复旦大学免疫实验ELISA双抗体夹心法检测抗原

双抗原夹心法实验步骤引言：双抗原夹心法是一种常用的实验技术，用于检测特定抗原在样本中的存在与否。

本文将详细介绍双抗原夹心法的实验步骤，以帮助读者了解该实验的操作流程。

一、实验准备1. 准备所需试剂和器材：包括抗原、抗体、标记物、酶底物、缓冲液、洗涤液、显色液等。

2. 根据实验需求，选择合适的抗原和抗体，确保它们具有高度特异性和亲和力。

3. 标记物的选择要考虑到其稳定性和灵敏度，常用的标记物有酶、荧光剂和放射性同位素等。

4. 预先调制好所需的缓冲液和洗涤液，确保其pH值和离子浓度合适。

二、实验步骤1. 预处理样本：将待测样本进行必要的预处理，如离心、稀释等，以获得适合实验的样本液。

2. 涂盒涂层：将特定抗原涂覆在微孔板的孔底上，通常采用直接吸附的方法，将抗原溶液加入孔中，静置一段时间，使其充分吸附。

3. 阻断：用适当的阻断剂（如牛血清蛋白）处理微孔板，以防止非特异性结合。

4. 加入待测样本：将预处理后的样本加入孔中，充分接触抗原，并与抗原发生特异性结合。

5. 加入一抗：在孔中加入与抗原结合的第一抗体，使其与待测样本中的抗原形成夹心复合物。

6. 洗涤：用洗涤液充分洗涤孔中的未结合物质，以减少非特异性反应。

7. 加入二抗：在孔中加入与第一抗体结合的酶标记的第二抗体，形成抗原-第一抗体-第二抗体的夹心结构。

8. 再次洗涤：用洗涤液彻底洗涤孔中的未结合物质，确保准确的结果。

9. 加入标记物：在孔中加入与酶标记的第二抗体结合的底物，使其发生化学反应产生信号。

10. 反应停止：通过加入反应停止剂，停止底物的化学反应，防止信号继续放大。

11. 测定结果：使用合适的测定仪器（如酶标仪、荧光仪等）测定底物反应产生的信号强度，根据信号强度判断抗原的存在与否。

三、实验注意事项1. 实验过程中要严格控制各步骤的时间和温度，以确保实验结果的准确性和可重复性。

2. 洗涤步骤的次数和时间要根据实验需求进行优化，以保证洗涤彻底而又不影响反应的灵敏度。

双抗夹心法测抗原原理双抗夹心法是一种常用的免疫学实验方法，用于检测特定抗原的存在。

它利用抗原与抗体的特异性结合来实现检测，从而确定样本中是否含有目标抗原。

双抗夹心法的原理可以简单概括为三个步骤：固定抗体、夹心抗原和检测抗体。

固定抗体被涂在固体表面上，如实验室常用的微孔板。

这些抗体通常是特异性的，能够识别并结合目标抗原。

固定抗体的涂布可以通过直接涂布、吸附或共价结合等方法完成。

接下来，待检测的抗原样品被加入到微孔板中，与固定抗体结合形成抗原-抗体复合物。

这一步骤被称为抗原的夹心过程，因为抗原被夹在固定抗体和检测抗体之间。

检测抗体被加入到微孔板中，与已夹心的抗原结合。

检测抗体通常与标记物相结合，例如酶、荧光染料或放射性同位素等。

通过检测标记物的信号，可以确定目标抗原的存在量。

双抗夹心法的关键在于抗原与抗体的特异性结合。

抗原是一种能够被免疫系统识别并引发免疫反应的物质，可以是细菌、病毒、细胞表面蛋白等。

而抗体是由免疫系统产生的特异性蛋白质，能够与特定抗原结合形成稳定的复合物。

在双抗夹心法中，固定抗体和检测抗体的选择非常重要。

固定抗体必须具有针对目标抗原的特异性，以确保只有目标抗原能够结合。

而检测抗体则需要与固定抗体结合的位置不同，以便检测标记物的信号不受干扰。

除了特异性结合，双抗夹心法还具有高度灵敏性和可重复性的优点。

通过选择合适的抗体和优化实验条件，可以使其达到非常低的检测限度。

因此，双抗夹心法被广泛应用于医学诊断、生物学研究和药物开发等领域。

需要注意的是，双抗夹心法虽然在抗原检测中具有很高的可靠性和准确性，但仍然存在一些局限性。

首先，抗体的特异性有时可能受到干扰物的影响，导致误判。

其次，双抗夹心法无法提供关于抗原的定量信息，只能确定其存在与否。

双抗夹心法是一种常用的抗原检测技术，通过特异性抗体的结合来确定样本中是否含有目标抗原。

其原理简单明了，操作方便，具有高度灵敏性和可重复性。

在今后的医学和生物学研究中，双抗夹心法将继续发挥重要作用，为人们提供可靠的实验手段。

elisa双抗体夹心法实验报告实验报告：ELISA双抗体夹心法实验一、实验目的本实验旨在通过ELISA双抗体夹心法，检测待测样品中目标蛋白的含量，为相关研究提供依据。

二、实验原理ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种灵敏的免疫学检测方法，通过将特异性抗体与酶标记结合，实现对目标蛋白的定量检测。

双抗体夹心法是一种常用的ELISA 技术，其原理是将两种特异性抗体分别固定在酶标板的不同位置上，形成两个“抗体夹心”，实现对目标蛋白的双重捕获，从而提高检测的灵敏度和特异性。

三、实验步骤1.酶标板包被：将第一种特异性抗体（capture antibody）包被在酶标板孔中，以固定化抗体形式捕获目标蛋白。

2.封闭：加入封闭液（通常为正常血清或BSA），填充孔内未结合的位点，以减少非特异性吸附。

3.洗涤：洗涤液清洗酶标板，去除未结合的物质。

4.样本加入：将待测样本加入酶标板孔中，与固定化的抗体发生特异性结合。

5.洗涤：再次洗涤酶标板，以去除未结合的物质。

6.酶标二抗加入：将第二种特异性抗体（detection antibody）与酶标记结合，形成酶标二抗。

将酶标二抗加入酶标板孔中，与目标蛋白发生特异性结合，形成“抗体夹心”。

7.洗涤：洗涤液清洗酶标板，去除未结合的物质。

8.显色反应：加入底物溶液，发生显色反应。

若目标蛋白存在，则呈现颜色变化。

9.终止反应：加入终止液，停止显色反应。

10.吸光度测定：用酶标仪测定各孔的吸光度值（通常在450nm处测量），根据吸光度值判断目标蛋白的含量。

四、实验结果根据实验数据，绘制标准曲线图和散点图，分析待测样品中目标蛋白的含量。

通常，标准曲线图横坐标为蛋白浓度，纵坐标为吸光度值。

通过将待测样品的吸光度值与标准品进行比较，计算出待测样品中目标蛋白的浓度。

五、实验总结本实验通过ELISA双抗体夹心法成功检测了待测样品中目标蛋白的含量。

实验过程中需注意保持操作环境的清洁和干燥，避免影响实验结果。

elisa双抗体夹心法临床应用ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，可以用于检测特定抗体或抗原的存在。

在ELISA实验中，常用的检测方法之一就是双抗体夹心法。

本文将介绍ELISA双抗体夹心法在临床应用中的重要性和优势。

一、ELISA双抗体夹心法原理ELISA双抗体夹心法是一种通过两种抗体反应来检测目标分子的方法。

首先，在试验板上吸附抗原，然后加入第一种对抗原特异的抗体，使其与抗原结合。

接着，加入第二种与第一种抗体不同的抗体，这第二种抗体常被标记有酶等物质，以便后续检测。

通过测量酶的底物反应程度，可以确定目标分子的存在量。

二、ELISA双抗体夹心法在临床诊断中的应用1. 疾病诊断：ELISA双抗体夹心法可以用于检测患者体液中特定抗原或抗体的存在，帮助医生进行疾病的早期诊断。

例如，在HIV感染的诊断中，ELISA双抗体夹心法有着很高的敏感性和特异性，可以快速准确地检测出HIV抗体的存在。

2. 肿瘤标记物检测：ELISA双抗体夹心法也常用于检测患者体液中的肿瘤标记物，帮助筛查和监测肿瘤患者的疾病进展。

通过检测血清中特定肿瘤标记物的水平，医生可以及早发现肿瘤的复发或转移。

3. 药物检测：在药物治疗过程中，ELISA双抗体夹心法可以帮助医生监测患者体内药物浓度的变化，确定药物的治疗效果，以及调整治疗方案。

三、ELISA双抗体夹心法的优势1. 敏感性高：ELISA双抗体夹心法可以检测非常低浓度的抗原或抗体，具有较高的敏感性。

2. 特异性好：通过选择特异性较好的抗体，可以确保ELISA双抗体夹心法对目标分子的检测具有较高的特异性。

3. 操作简便：ELISA双抗体夹心法操作简单，不需要复杂的仪器设备，适合临床快速检测的需求。

总结：ELISA双抗体夹心法作为一种重要的生物医学检测技术，在临床应用中发挥着重要作用。

其高敏感性、良好特异性和操作简便性，使其成为临床诊断和治疗中不可或缺的工具，有助于提高疾病的早期诊断率和治疗效果，促进患者的健康管理。

ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原临床ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原对于含多个抗原决定簇的大分子蛋白，使用双抗体夹心ELISA模式测定相当简便，现有的商品试剂盒基本上都采用此种测定模式。

具体测定方法如下：1．首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中4℃下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。

2．加入含待测物的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测抗原就会与固相上特异抗体反应而吸附于固相上。

3．加入酶标记的双抗体之二，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。

4．加入酶底物，温育显色测定(图2—1)。

在该测定模式中，有两步温育和板孔洗涤步骤，如果将上述测定步骤2和3并为一步，即将待测样本和酶标抗体同时加入，从而仅有一步温育和洗板过程，即为通常所说的“一步法”。

最初的双抗夹心ELISA试剂盒，均采用两步法。

后来，人们为了节省时间，简化操作步骤，试剂生产厂家逐步推出了“一步法”试剂盒。

目前在我们的临床实验室中，测定大分子抗原如HAg、。

FP和hCG等，基本上都采用一步法。

一步法相比于两步法，虽然操作简单‘但有其固有的缺陷，处理不好，对ELISA测定结果有严重影响。

在通常的两步温育洗涤方法中，抗原抗体反应将遵循下述规律，即在第一步中加入的待测标本中抗原(Ag)浓度逐步增加时，将使固相抗体(Ab)与抗原的结合逐步达到饱和[(1)式]，这样当随后加入一定浓度的酶标抗体(Ab’)后，a复合物的形成将直接与在第一步中形成的b复合物相关[(2)式]，因此，待测抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深，当抗原浓度增加到一定程度时，反应显色达到平台，而呈S形变化曲线。

而一步法双抗夹心ELISA的反应曲线则为钟形曲线。

也就是说测定显色随着待则标本中抗原浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色，即所谓的“钩状效应”(hook eHect)，也就是我们在免疫沉淀试验中所称的“带现象”(zonephen。

附件9 酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗原夹心法
检测血清总抗体
试验材料：
（1）纯化的重组汉坦病毒核蛋白抗原预包被酶标板：
（2）辣根过氧化物酶标记的纯化的重组汉坦病毒核蛋白抗原；
（3）缓冲液：
包被液：pH9. 6碳酸缓冲液；
稀释液：pH7.4 PBS（含5%脱脂奶）
洗涤液：pH7.4 PBS－T（0.05％吐温－20）；
（4）显色液：A/B液
（5）终止液：4N H
2SO
4
（6）酶标板、酶标仪。

检测步骤：
（1）将待检血清加入抗原孔，25μl/孔，同时用稀释液按工作浓度稀释酶标抗原，加入样品孔，25μl/孔，需设阴、阳性对照各3孔，37℃水浴1小时；
（2）用洗涤液洗涤6次，甩干；
（3）加显色液：于各反应孔内加A/B液各一滴，37℃，避光3～5分钟；
（4）加终止液于每反应孔，一滴/孔。

结果判断：
于450nm（TMB）阳性对照孔OD值/阴性对照孔OD均值，即P/N≥2.1，对照成立；若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD比值≥2.1，则标本为出血热抗体阳性，反之阴性。

（阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记，若大于0.05按实际数值计算）
意义：阳性结果，表明曾受到汉坦病毒感染。

1。

ELISA双抗体夹心法检测抗原实验时间：实验地点：实验人：1实验目的1.阐述ELISA（酶联免疫吸附测定）的原理，列举ELISA类型2.完成ELISA的基本操作3.学会分析实验结果4.能根据需要设计相应的ELISAS实验流程2实验原理ELISA：是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。

ELISA双抗体夹心法常用于检测抗原。

将已知道抗体吸附于固相载体上，加入待检含相应抗原的标本使之结合反应。

然后洗涤，再加入酶标抗体和底物进行测定。

但该方法只适用于检测多价大分子抗原，不适合检测小分子半抗原。

结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

通过加入与酶反应的底物后显色，根据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量，进行定性或定量的分析，可以间接放大免疫反应结果。

所以说ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。

酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果,还可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

3实验材料1.酶标反应板（包被有抗CEA抗体）2.CEA标准品（0ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml）3.样品1和样品24.酶标抗体（酶结合物）5.底物液A和底物液B（显色剂A和B）6.终止液7.洗涤液4实验方法1.每孔依次加入0、5、10、20、40、80ng/mlCEA标准品、样品1、样品2各100μl。

2.37°C温盒内温育30min。

3.洗涤4次。

于吸水纸上拍干。

4.加入酶结合物100μl于各孔，轻轻混匀。

ELISA操作步骤（双抗体夹心法）ELISA操作步骤（双抗体夹心法）1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体，(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)。

2 PBS洗3次，每次3分钟。

具体为.吸干或甩干孔内反应液；.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；吸干孔内液体，可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；.重复操作涤3次。

3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl。

将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔100μl，置于37℃,40-60min。

4 PBS洗3次，每次3分钟。

5. 加入酶标抗体:酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度，37℃,30-60min之间，短于30min往往结果不稳定，每孔加100μl。

6 PBS洗3次，每次3分钟。

7. 加入底物液(现用现配):TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl，底物加入量每孔100μl （TMB空白显色孔除外）,置37℃避光放置20-25分钟。

8. 终止反应:每孔加入终止液50μl(2M H2SO4)终止反应, 此时蓝色立转黄色，于20min内测定实验结果。

9 结果判断:可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。

也可测吸光值：在ELISA检测仪上，TMB反应产物检测需要450nm波长，检测时一定要首先进行空白孔系统调零。

用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为抗体的效价即大于阴性对照吸光值的2倍，(数值的大小依具体检测要求而定)。

双抗体夹心elisa方法的原理
宝子，今天咱来唠唠双抗体夹心ELISA方法的原理哈。

ELISA呢，就是酶联免疫吸附测定，这双抗体夹心ELISA可有意思啦。

它就像是给抗原这个小坏蛋设了个包围圈。

有两种抗体参与哦。

一种是捕获抗体，就像一个小陷阱，先被固定在检测板上，就等着抗原上钩呢。

这个捕获抗体的形状和抗原的某个部分特别匹配，就像一把钥匙配一把锁一样。

然后呢，咱们要检测的抗原就大摇大摆地来了，它一头就扎进了捕获抗体这个小陷阱里，紧紧地结合在一起啦。

这时候，另一种抗体，也就是检测抗体就登场啦。

检测抗体也是专门针对抗原的，它从另一个方向和抗原结合，就像给抗原来了个前后夹击。

这个检测抗体还带着特殊的标记呢，就像是它的小标签。

这个标记可以是酶之类的东西。

接下来就更有趣啦。

当我们加入底物的时候，因为检测抗体上带着酶标记，这个酶就像一个小工匠，它会对底物进行加工。

底物被加工之后呢，就会发生一些变化，比如说变色啦。

我们就可以根据这个变化的程度来判断抗原的量。

如果颜色变得很深，那就说明抗原的量比较多；要是颜色浅，那抗原的量就少啦。

双抗体夹心ELISA方法可厉害了，它能够很灵敏地检测出抗原。

在医学上呀，它能检测出身体里是不是有病毒或者细菌的抗原，帮助医生判断病情。

在食品检测里呢，也能检测出有没有有害的微生物抗原，保障我们的食品安全。

反正这双抗体夹心ELISA方法就像一个小小的侦探，在微观的世界里，把抗原这个小目标给找出来，然后告诉我们它的情况呢。

是不是很神奇呀，宝子？ 。