免疫学实验二 elisa(双抗夹心法)1-ppt课件

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双抗夹心ELISA测沙门氏菌(课件)1

几种酶标分析仪
DNM-9602G酶标分析仪
DNM-9602A酶标分析仪
DNM-9602 标配酶标分析仪
ELISA的基本原理
它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性。然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性。当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色，其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。
4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG) 黄色红色黄色深蓝色荧光黄色 400 500 405 420 360,450 420 碱性磷酸酯酶葡萄糖氧化酶 β-Ｄ－半乳糖苷酶
为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育？
ELISA 属固相免疫测定，抗原、抗体、二抗等在固相属上的结合是一个扩散和平衡的过程，因此需一定时间才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与酶底物的结合也同样如此。温育常采用的温度有43℃、 37℃、室温和4℃等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。
酶结合物是酶与抗体或抗原 ,橘红色半抗原在交辣根过氧化物酶邻苯二胺 492 联剂作用下联结的产物。是 ELISA成败的关键试四甲基联苯胺(TMB) 黄色 450 氨基水杨酸棕色剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还 449 邻联苯甲胺兰色 425 具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻蓝绿色 642 的酶选用不同的底物，将得到不同的颜色反应唑啉磺酸-6)铵盐 .

《ELISA检测技术》PPT课件

洗涤
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。
聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的而在洗涤时可清除在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质
洗涤时可清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质
洗涤方式（浸泡式）
a.
甩干孔内反应液；
b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，
即甩去）；
c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置3分钟，间
歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；
d. 甩去液体后在吸水纸上拍干；
e.重复操作c和d，洗涤3次。
保温
1）在ELISA中抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称
为温育。
2）温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。 3）保温时为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔。
• 抗原或抗体能物理性地吸附于固相表面，并且保持其免疫活性； • 抗原或抗体能与酶通过共价键形成酶结合物，同时保持各自的免疫活性和酶活性； • 酶结合物与相应的抗原或抗体结合后，能通过加入底物的颜色反应来确定免疫反应的发生，颜色反应的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正比。
ELISA 的分类、原理和操作
显色和比色
显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色时间一般不需要严格控制及时判断。比色使用酶标比色仪在405nm波长读数。若要终止反应，以防反应过度，常用的碱性磷酸酶反应终止液为1M NaOH,每孔 100ul。

竞争法原理：通过a组和b组显色的差异，来确定标本中待测蛋白的量

Elisa技术原理及应用PPT课件

ELISA的检测类型
ABS-ELISA法
➢ 亲和素与生物素的结合，
虽不属于免疫反应，但特
异性强，亲和力大，能够
形成一种极为稳定的复合
体。把亲和素和生物素与
ELISA偶联起来，可以大
①：固相支持物；
大提高ELISA的敏感度。
②：样品； ③：特异性IgG； ④：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）；
• 检查抗原和半抗原方面：在内分泌方面用于检测雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等
• 在血液学方面：可用于检查凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（Hapto Globin）等
• 在肿瘤方面：试用检查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA），对前者的敏
-
18
ELISA应用前景
ELISA在生物医学领域的应用范围四个方面： •免疫酶染色各种细胞内成份的定位 •研究抗酶抗体的合成 •显现微量的免疫沉淀反应 •定量检测体液中抗原或抗体成份
-
19
ELISA应用前景
ELISA在检测抗原方面：
• 在实际应用方面：可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。
ABS:亲和素（avidin）生物素（biotin）系统（system）
⑤：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）；
⑥：DAB显色液；
⑦：显色；
-
17
ELISA检测
ELISA特点：
•灵敏度高：ELISA测定法的灵敏度来自作为报告基团的酶。由于酶的催化效率很高，很少量的酶即可诱导大量的催化反应，产生可供观察的显色反应，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

ELISA-双抗夹心法检测抗原PPT课件

2）待测样品：取100μl待测样品加入酶标板，做复孔； 3）空白对照：取100μl 1×Assay diluent加入酶标板，做复孔；
Standard 原液 ½ ¼
1/8 1/16 1/32
50ul
37℃避光孵育1h
•33
每组4位同学的加样顺序：
每孔加样100μl
待测抗原 100μl
待测抗原 100μl
结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，
既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈
色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。
•15
实验材料
小鼠INF-γ检测试剂盒的组成：
• Capture Ab：purified anti-mouse IFN-γ • Detection Ab ：biotin-conjugate-anti-mouse IFN-γ • Avidin-conjugate-HRP • Standard：recombinant mouse IFN-γ （定量测定） • Coating buffer • 5×Assay diluent • TMB solution
• 抗原测定法
➢ 直接竞争法检测可溶性抗原 ➢ 双抗体夹心法检测可溶性抗原
（改良双抗体夹心法检测可溶性抗原） ➢ 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法
•4
间接法检测特异性抗体
包被已知抗原
与待测抗体孵育
与酶标抗体孵育
加入底物
显色
•5
优点:
• 只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法
• 终止反应，防止反应过度：
TMB受光照影响不大，经HRP作用后，40min达到高峰；终止液有多种，叠氮钠或SDS等酶抑制剂可以维持蓝色12-24h不褪色；

酶联免疫吸附双抗体夹心法 PPT

❖检查抗体
1.在寄生虫病方面，它用于对疟原虫、阿米巴、利日曼原虫、锥虫、血吸虫、旋毛虫病等血清学诊断，这对人医和兽医都很重要。 2.在病原微生物方面已用于检查链球菌、沙门氏菌、布氏杆菌、结核杆菌、麻疯杆菌、霍乱弧菌等的抗体，还可用于破伤风抗毒素和霍乱弧菌抗毒素的测定以及检测斑疹伤寒立克次氏体感染后的抗体。
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl ，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。 4. 配液：将20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水20 倍稀释后备用 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7. 温育：操作同3。 8. 洗涤：操作同5。 9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟. 10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止液后15 分钟以内进行。
酶联免疫吸附双抗体夹心法
一、实验目的 1 掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理 2 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法
二、实验原理
ELISA的三条基本原理
❖ 原理一
ELISA的基础是抗原（或抗体）的固相化及抗原（或抗体）的酶标记。结合在固相载体表面的抗原（或抗体）仍保持其免疫学活性。
❖ 原理二
辣根过氧化物酶(HRP)

elisa原理、方法及操作细节ppt课件

成本较高
高质量的抗体和酶标仪等设备的成本较高，限制了其在一些
领域的应用。
2024/1/24
30
技术挑战与发展趋势
提高自动化程度
开发自动化ELISA检测系统，减少人为操作误差，提高检测效率。
2024/1/24
发展多重检测技术
在同一反应体系中同时检测多种目标分子，提高检测通量。
提高特异性
通过改进抗体设计和筛选方法，提高抗体的特异性，减少交叉反应。
优点
适用于检测大分子抗原，如病毒、细菌等。
缺点
需要针对每种抗原制备特异性抗体，成本较高。
2024/1/24
9
竞争法
1 2
原理
将特异性抗体与固相抗原竞争结合待检抗原，形成抗体-抗原复合物，再加入酶标二抗与复合物结合，最后加入底物显色。
优点
适用于检测小分子抗原或半抗原，如激素、药物等。
3
缺点
抗原与抗体的特异性结合
免疫记忆
抗原表位与抗体超变区互补，形成稳定的抗原-抗体复合物。
免疫系统对再次遇到的相同抗原产生更快、更强的应答。
免疫应答
机体对抗原的识别、应答和清除过程，包括细胞免疫和体液免疫。
2024/1/24
4
ELISA技术原理
01
02
03
酶标记抗体/抗原
利用酶的催化作用放大抗原-抗体结合的信号，提高检测灵敏度。
2024/1/24
28
优点分析
高灵敏度
ELISA技术能够检测到非常低浓度的目标分子，
适用于痕量分析。
2024/1/24
特异性
通过使用特定的抗体-抗原反应，可以实现高特异性的检测，减少假阳

elisa检测技术 ppt课件

生物素是一种生长因子，广泛分布于动、植物体内，又称辅酶R或维生素H。亲和素由四个亚单位组成，对生物素具有高度亲和力，即一个亲和素可以结合4个生物素分子。因此，本方法具有信号放大功能（特点）。
该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA（生物素）检测。
BAS-ELISA实验原理
竞争法ELISA
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从而进一步得知样本中抗原的多少。
37℃, 30min
洗涤3次, 拍干加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min 加终止液 (空孔除外)
上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零)
从标准曲线上读取样品含量
ELISA试验中的注意事项
必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验试剂盒的质量；待测样品应设立双复孔或三复孔；酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O

elisa免疫测定-医学免疫学ppt课件

钩状效应（hook effect）
一般情况下的双抗体夹心法ELISA反应
抗原过量时一步法ELISA反应会
出现钩状效应
钩状效应强阳性----------------假阴性方法：稀释后再测
特点：不易发现避免：结果回顾、诊断提示、临床沟通
间接法的影响因素
正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体
温育时间足够。保温的方式一般采用水浴或电热块。温育的温度和时间应按规定力求准确。
洗板
分离游离的和结合的酶标记物洗板的方式：自动洗板仪；手工操作有浸泡式和
流水冲洗式倾倒液体的方式
甩干孔内液体：应注意交叉污染和个人防护吸干孔内液体：吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸（推荐）如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。
EDTA、酶抑制剂(如NaN3)可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性,造成假阴性
标本凝固不全,形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果
标本中有内源性干扰物, 不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、交叉反应物质和其他物质等
试剂准备
试剂的准备
选择高质量的试剂是保证结果准确的关键室温平衡所用蒸馏水或去离子水应保证质量
ELISA的概念酶联免疫吸附试验的反应原理及操作中注意事
项常见问题原因分析及解决结果的报告解释
ELISA的概念
• ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971年由荷兰和瑞典的学者提出，操作过程简单易行并可以定量，从而使其在免疫学检测中得到了广泛的应用。
•ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。

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免疫学实验二 elisa(双抗夹心法)1-教学
实验原理：
酶联免疫吸附试验（ELISA）是将抗原、抗体的特异性反应与酶对底
物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术，可用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原。首先，抗原、抗体的特异性反应在一种
固相载体表面－聚苯乙烯微量反应板孔中进行，通过洗涤去除多余的游
15.巨噬细胞的主要生物学功能。
16.简述免疫应答的基本过程。 17.抗原的提呈途径（两条）。
18.固有免疫的组成及其与适应性免疫的关系。
19.两种人工免疫的主要区别。预防接种的注意事项。 20.灭活疫苗与减毒活疫苗的主要区别。
论述题（10×2=20）
• 免疫应答：
如TD抗原诱导体液免疫应答的过程； TD抗原诱导细胞免疫应答的过程。
免疫、计划免疫
注：红色标记为要求掌握英文
二、填空题（0.5×40=20分）
三、单项选择题（1×30=30分）
简答5×2=10
1. 2. 3. 4. 免疫的三大功能及其生理和病理表现。影响抗原免疫原性的因素。医学上有哪些重要的抗原。简述Ig的基本结构。
5.
6. 7.
免疫球蛋白有哪些主要的生物学功能？
注：阴性对照OD值小于0.05按0.05计算，
大于0.05按实际OD值计算判断值。
注意事项：
1. 试剂及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂混匀，弃去1～2滴垂直滴加；
2. 严格按照操作程序依次加样，以保证实验结果准确性；
3. 应尽量避免孔中有气泡，以免所测得OD值不准确。
思考题：
1.免疫标记技术有哪些？各有何特点？。 2.ELISA操作过程中应注意哪些问题？
7.终止反应各孔加终止液50μl
（2mol/L H2SO4 ）
OPD（邻苯二胺）经酶作用后的显色反应
终止前终止后
TMB四甲基联苯胺经酶作用后的显色反应
终止前终止后
结果判断：
计算：判断值＝阴性对照平均OD值×2.1
结果判断：待测样品孔OD值大于或等于判断值为阳性；
小于判断值为阴性。
实验原理：
• 免疫酶技术是利用酶标记抗体或抗原，以检测
相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。其原
理是酶与抗体或抗原结合后既不改变抗体或抗
原的特异性及免疫反应性，也不影响酶的催化
效能。当存在相应酶底物时，酶能催化产生有颜色的产物，颜色的有无及深浅能反映相应的抗原或抗体是否存在及其量的多少。
ELISA的测定方法包括：
6. 显色：各孔（包括空白对照）加底物A液50μl（1滴），底
物B液50μl（1滴），置37℃避光温育15min。
7. 终止反应：各孔加终止液50μl （2mol/L H2SO4 ）。
8. 比色：将反应板以酶标仪450nm处用空白孔调零，测各孔 OD值。
6.显色各孔（包括空白对照）加底物 A液50μl（1滴），底物B液 50μl（1滴），置37℃避光温育15min
离反应物；然后加入酶标记的抗体或酶标记的抗抗体，从而形成抗体－抗原－酶标抗体复合物（双抗体夹心法）或抗原－抗体－抗抗体复合物
（间接法）；此时加入酶底物和显色剂，在酶催化底物后，液体呈现显
色反应。液体显色的强弱与复合物中待测抗原或抗体的量呈正比，借此可检测待测抗原或抗体的有无及含量。
该技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。
2.3加满洗涤液（重复三次）
3.加样
（1）阳性对照：第1、2孔加 HBsAb阳性对照血清50μl；
（2）阴性对照：第3、4孔加
HBsAb阴性对照血清50μl；（3）空白对照：第5孔加生理盐水100μl；（4）余下各孔加待检血清50μl 。
4. 加酶标记的抗HBsAb抗体：除空白对照外各孔50μl，充分混匀。将即时帖覆盖于反应板上，37℃孵育30min。 5. 弃去反应孔内液体，拍干，用洗涤液注满各孔、静置30秒、再拍干，重复洗涤5 次。(操作同2)
简述补体的组成。补体活化三条途径的比较。

9.
补体有哪些主要生物学功能？
细胞因子有哪些共同的特性？
10. 细胞因子的主要生物学作用。
11.简述MHC分子的结构及其分布。 12.HLA的主要生物学功能。 13.T细胞表面有哪些与其功能相关的重要分子。 14.B细胞表面有哪些与其功能相关的重要分子。
亲和素
5.加底物显色
4.加酶标记的亲和素 3.加生物素标记的特异性抗体
酶
生物素
待检标本
2.加待检标本 1.已知Ab包被固相
材料和试剂：
1. HBsAg、包被液。
酶标板
移液器
2.待检人血清。
3.酶标记的抗HBsAb抗体。 4.HBsAb阳性对照血清、HBsAb阴性对照血清 5.洗涤液：PH7.4 0.01mol/L PBS-吐温20。 6.底物溶液：OPD-H2O2或TMD-H2O2。 7.终止液：2mol/L H2SO4。 8. 酶标反应板、移液器、恒温箱、酶标仪酶标仪
操作步骤：
1. 包被：将HBsAg用包被液作适当稀释（1：100），在
96孔反应板中每孔加100μl，置37℃2h后再移置4℃过
夜。
2. 洗涤：将96孔反应板倾去包被液，用洗涤液PBS-吐温
20加满各孔，置3min,倾去，如此反复3次。（前两步
已完成）
1.已知抗原包被酶标板
2.2拍干
2.1弃去板内包被抗原
双抗体夹心法：检测抗原最常用的方法
间接法：检测抗体最常用的方法
竞争法：既可检测抗原，亦可检测抗体
生物素－亲和素系统ELISA法：是在ELISA中引入生物素或亲和素放大系统，检测极微量的抗原或抗体的方法。
直接法
间接法
BAS-ELISA
biotin-avidin-system，生物素-亲和素系统此法敏感性更高。用于抗原抗体以及DNA、RNA的检测。底物
2009级医疗专科复习题
一、名词解释2.5*8,共20分
免疫、抗原、抗原决定基(表位)、异嗜性抗原、白细胞分
化抗原、TD-Ag、 TI-Ag、抗体、免疫球蛋白、单（多）克
隆抗体、补体、经典途径、旁路途径、细胞因子、IL、IFN、 CSF、TNF、MHC、MHC限制性、TCR、BCR、模式识别受体（PRR）、抗原提呈细胞（ APC）、适应性免疫应答、免疫耐受、免疫调节、超敏反应、人工主动免疫、人工被动