植物亚细胞定位载体卡盒pCEG的构建及验证

亚细胞定位PTEN基因真核表达载体的构建与鉴定李洪凌;朱向辉;姜新;曲雅勤;李亮【摘要】目的:构建人野生型亚细胞定位PTEN基因真核表达载体,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法:以胎盘组织RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增H的基因片段.PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-PTEN质粒,进行酶切鉴定和测序.以T-PTEN质粒为模板,利用PCR技术将核定位信号(NSL)加入PTEN序列.PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-NSL-PTEN质粒.真核表达载体pcDNA3.1及T-NSL-PTEN质粒经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后连接,转化大肠杆菌,获得重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN,进行酶切和测序鉴定.结果:重组质粒PUM-PTEN酶切在1 200 bp处见目的片段,与预期结果符合.测序结果显示基因序列与目的基因完全一致;重组质粒PUM-NSL-PTEN酶切在1 200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与设计一致,核定位信号成功加入;重组质粒pcDNA3.1-PTEN酶切在1 200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与目的基因相同;重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN经双酶切和测序证实了其正确性EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切在1 200 bp处见目的片段,与预期结果一致.测序结果显示,核定位信号成功加入,其后是阅读框架正确的PTEN基因序列.结论:成功构建可表达亚细胞定位PTEN的真核表达载体pcDNA3.1-NSL-PTEN.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2009(035)006【总页数】4页(P1057-1060)【关键词】亚细胞定位;PTEN基因;质粒【作者】李洪凌;朱向辉;姜新;曲雅勤;李亮【作者单位】吉林大学第二医院放疗科,吉林,长春,130041;吉林大学第二医院放疗科,吉林,长春,130041;吉林大学第二医院放疗科,吉林,长春,130041;吉林大学第二医院放疗科,吉林,长春,130041;复旦大学附属金山医院医学影像中心,上海,200540【正文语种】中文【中图分类】Q78PTEN基因是一种重要的抑癌基因，在50%～80%的实体瘤中发生了突变[1]。

真核表达载体 pcDN A3．1（＋）-G FP-M C1R 的构建及在羊驼毛囊干细胞中的表达白瑞;王振华;尹志红;弓慧敏;于志慧;庞全海【摘要】旨在构建含有 MC1R基因的pcDNA3．1（＋）真核重组表达载体，为进一步研究 MC1R的生物学功能奠定基础。

应用RT‐PCR技术从羊驼皮肤cDNA 文库中扩增 MC1R基因全长cDNA ，然后通过双酶切将 MC1R基因全长cDNA 克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋），然后采用脂质体法转染体外培养的羊驼毛囊干细胞后，通过G418筛选培养，建立稳定的转染体系，直接荧光观察pcDNA3．1／MC1R融合蛋白在细胞中的分布定位，并通过Western Blot方法检测 MC1R在羊驼毛囊干细胞中的表达。

结果表明，成功构建了pcDNA3．1／MC1R重组表达载体，并且发现试验组的毛囊干细胞中表达 MC1R蛋白显著高于空白组（P＜0．05）。

成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA3．1／MC1R ，且 MC1R基因在羊驼毛囊干细胞中获得表达。

%It is the base of further study on MC1R biological functions to construct the pcD‐NA3 .1 eukaryotic expression vector of MC1R gene in alpaca .MC1R gene was amplified by RT‐PCR with the cDNA from alpaca skin library .PCR products and pcDNA3 .1 plasmid were digested and recycled by BamHI and EcoRI endonuclease .The positive clones were selected , from which plasmid DNA was abstracted and identified by restriction endonuclease ,sequence identification and sequencing . ThepcDNA3 .1/MC1R recombinant expression plasmid was transfected into alpaca hair follicle stem cells by Lipofectamine TM 2000 .After screening culture by G418 ,a stably‐transfected cell system wasestablished .Fluorescent microscopy was em‐ployed to reveal the localization o f MC1R in alpaca hair follicle stem cells ,and the transcrip‐tion and expression of the MC1R were identified by Western Blot .The results show that eu‐karyotic expression vector pcDNA3 .1/MC1R was successfully constructed .When pcDNA3 . 1/MC1R recombinant expression plasmids were transfected into alpaca hair follicle stem cells , the expression ofMC1R was up‐regulated (P<0 .05) .This study successfully constructed eu‐karyotic expression vector containing green fluorescent protein gene pcDNA 3 .1/MC1R .It c ould up‐regulate the expression of MC1R in alpaca hair follicle stem cells .【期刊名称】《河北农业大学学报》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】5页(P86-90)【关键词】羊驼;黑素皮质激素受体1;毛囊干细胞;真核表达载体;转染【作者】白瑞;王振华;尹志红;弓慧敏;于志慧;庞全海【作者单位】山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801; 山西医科大学晋祠学院，山西太原 030025;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801【正文语种】中文【中图分类】Q7822种天然毛色是羊驼的非常重要的经济性状之一［1］。

一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术构建植物质体表达载体是一种将外源基因导入植物细胞并在植物细胞内进行表达的方法。

以下是一种常见的植物质体表达载体的构建方法及其应用与流程技术：
1.选择载体：选择适合植物质体表达的载体，通常是质粒
（plasmid）或病毒载体。

质粒载体通常由选择标记基因、启动子、终止子和目标基因构成。

2.克隆目标基因：将目标基因（外源基因）插入载体的多克
隆位点中。

这可以通过限制性内切酶切割质粒载体和目标基因的DNA，然后利用DNA连接酶将两者连接起来。

3.构建表达载体：将含有目标基因的质粒进行转化，例如通
过化学方法或电穿孔等手段将质粒导入植物细胞，形成表达载体。

4.选择转化植物细胞：通过对转化植物细胞进行筛选，例如
添加抗性选择剂或利用标记基因表达进行筛选，以筛选出含有目标基因的转基因植物细胞。

5.确认目标基因表达：通过PCR、RNA分析或蛋白质分析等
技术，检测和确认目标基因在转基因植物细胞内的表达情况。

6.稳定转基因植物的培养：将成功表达目标基因的转基因植
物细胞进行培养，以获得稳定转基因植物种子或植株。

7.功能性验证与应用：对获得的稳定转基因植物进行功能性
验证，例如检测表达的蛋白质具有特定的生物活性或应用
于农艺改良、抗病虫害等方面。

8.申请相关许可：如果打算将转基因植物及其产品用于商业
化目的，需要申请相关的许可和审批文件，以确保遵守法
规和伦理规范。

需要注意的是，植物质体表达载体的构建方法与特定目标基因、植物物种和研究目的有关。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011135875.4(22)申请日 2020.10.22(71)申请人 山东省农业科学院玉米研究所（山东省农业科学院玉米工程技术研究中心）地址 250100 山东省济南市桑园路11号(72)发明人 丁照华　程文　王志武　唐媛　崔海燕　赵苏娴　卢增斌　(74)专利代理机构 济南尚本知识产权代理事务所(普通合伙) 37307代理人 杨宝根(51)Int.Cl.C12N 15/66(2006.01)C12N 15/65(2006.01)(54)发明名称一种亚细胞定位表达载体及构建方法(57)摘要本发明属于基因工程技术领域，公开了一种亚细胞定位表达载体及构建方法，在TA载体中获得ccdB毒性蛋白，同时利用PCR在Gateway载体p2FGW7中扩增得到eGFP片段，在pCambia载体中获得多克隆位点以及载体的骨架，获得P35s∷ccdB ‑eGFP片段。

用多克隆位点进行酶切后，所获得的线性片段中不再含有ccdB蛋白，同时获得黏性末端，可以利用连接酶将含有相应黏性末端的目的片段插入到载体中。

本发明的亚细胞定位载体既可以用于瞬时转化，研究亚细胞定位，也可以利用农杆菌介导的方法，获得稳定的转基因植株；获得的转基因材料可以用于下一步的生理生化与功能分析。

权利要求书1页 说明书3页序列表5页 附图2页CN 112266925 A 2021.01.26C N 112266925A1.一种亚细胞定位表达载体的构建方法，其特征在于，所述亚细胞定位表达载体的构建方法包括以下步骤：（1）TA载体中获得ccdB毒性蛋白，同时利用PCR在Gateway载体p2FGW7中扩增得到eGFP 片段，在pCambia载体中获得多克隆位点以及载体的骨架，获得P35s∷ccdB -eGFP片段；（2）用多克隆位点进行酶切后，所获得的线性片段中不再含有ccdB蛋白，同时获得黏性末端，利用连接酶将含有相应黏性末端的目的片段插入到载体中；（3）利用任意一种限制性内切酶消化后，然后利用连接酶将片段进行连接，获得P35s∷eGFP载体，该载体产生的蛋白质进入细胞的任意结构，用于阳性对照。

一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术植物质体表达载体是一种用于将外源基因转化至植物质体中进行表达的工具，具有许多应用于农业、医药和工业领域的潜力。

本文将介绍一种常用的植物质体表达载体构建方法以及其在相关领域的应用和流程技术。

植物质体是细胞中的一种特殊器官，其中包含了丰富的DNA、RNA 和蛋白质。

通过将外源基因导入质体中进行表达，可以使植物细胞产生特定的蛋白质，从而实现对目标基因功能的研究和生产特定蛋白质的目的。

一种常用的植物质体表达载体构建方法是利用嵌合质粒。

嵌合质粒是由质体和细菌染色体DNA片段组合而成的具有双重起源和选择标记的质粒。

该方法的具体步骤如下：步骤一：选择合适的细菌质粒作为载体。

常用的载体包括Agrobacterium、E. coli等。

首先根据需要选择合适的细菌质粒，该质粒需要能够稳定复制并在植物中高效表达外源基因。

步骤二：选择合适的启动子和终止子。

启动子是控制基因转录起始的区域，终止子是控制转录终止的区域。

通过选择适合的启动子和终止子，可以调控外源基因在植物细胞中的表达水平。

步骤三：克隆外源基因。

将目标基因克隆到载体上，通常使用限制酶切和DNA连接技术。

可以选择不同的限制酶来线性化质粒和选择目标基因以适应不同的表达需求。

步骤四：转化植物细胞。

通过植物转基因技术将构建好的载体导入植物细胞中。

常用的方法包括农杆菌介导的转化和基因枪法。

步骤五：筛选转化成功的植物。

使用适当的选择标记基因，如抗生素抗性基因，来标记成功转化的植物细胞。

通过诱导植物细胞分化和培养，最终得到转化植株。

植物质体表达载体在农业、医药和工业领域有广泛的应用。

在农业领域，该技术可以用于改良作物，使其具备抗病虫害、耐逆性、提高产量等特点。

在医药领域，植物质体表达载体可以用于生产重要的药物和疫苗，如疫苗蛋白、抗体等。

在工业领域，该技术可以用于生产生物材料和生物燃料等高附加值产品。

总结起来，植物质体表达载体构建方法主要包括选择合适的载体、启动子和终止子，克隆外源基因，转化植物细胞，筛选转化成功的植物等步骤。

山西农业科学 2023，51（8）：839-845Journal of Shanxi Agricultural Sciences枣ZjWRKY22基因克隆、亚细胞定位及表达载体构建张雪慧 1，2，张鹏飞 1，2，刘亚令 3，梁晋军 1，2，温鹏飞1，2（1.山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801；2.山西石楼红枣科技小院，山西 石楼 032500；3.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801）摘要：WRKY 是植物特有的锌指型转录调控因子，参与调控植物抗逆、生长发育和新陈代谢。

为探索易裂品种壶瓶枣WRKY 转录因子ZjWRKY22的生物学功能，同时为揭示枣WRKY 响应非生物胁迫的分子机制提供理论基础，对克隆ZjWRKY22基因编码区序列进行生物信息学预测，并对枣吊、茎、叶、花、果实进行差异表达分析。

结果表明，从壶瓶枣中克隆得到ZjWRKY22基因CDS 序列长1 068 bp ，共编码335个氨基酸，分子质量约为38.9 ku ，等电点为5.92，分子式为C 1682H 2582N 472O 568S 13；该蛋白中丝氨酸最多，占18%，为亲水不稳定蛋白质，无信号肽和跨膜结构域，含有76个磷酸化位点；二级结构类型以无规则卷曲为主，该基因具有典型的WRKY 结构域，三级结构预测主要由4个β-折叠组成，分别为WRKYGQK 、RGYYR 、RKQVER 、FIVTYT ；属于WRKY 家族Ⅱe 组。

同源序列比对显示，枣与杨梅、桃、扁桃、梅的同源性分别为75.86%、74.88%、74.41%和74.88%，系统进化树表明，枣ZjWRKY22与酸枣亲缘关系最近；实时荧光定量显示，ZjWRKY22在果实中表达量最高，具有组织特异性。

进一步构建融合表达载体pCAMBIA1300-GFP -ZjWRKY22，通过农杆菌瞬时注射本氏烟草进行亚细胞定位，结果确定了ZjWRKY22蛋白位于细胞核中，同时成功构建了植物超表达载体pCAMBIA -1300-ZjWRKY22。

分枝杆菌膜锚定表达载体的构建与亚细胞定位分析王鑫;范小勇;马辉;曲勍;朱越雄【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》【年(卷),期】2011(031)006【摘要】Objective To construct mycobacterial membrane-anchored expression vector and to analyze expression level and sub-cellualr localization of exogenous target protein. Methods Based on the mycobacterial intracellular expression vector pMFA42 which contained a strong promoter of pfurAma mutant, the signal sequence of Mycobacterium tuberculosis(Mtb) 19×103 lipoprotein (19SS) was synthesized and was then cloned into the downstream of pfurAma mutant to generate the mycobacterial membrane-anchored expression vector pMFA42M. The coding gene of enhanced green fluorescent protein(EGFP) was amplified by PCR, and then sub-cloned into these two vectors described above to construct recombinant EGFP fused and membrane-anchored strains, respectively. The coding genes of Mtb immuno-dominant antigens Ag85A and its chimera Ag856A2 were then sub-cloned intothe membrane-anchored construct pMFA42MG to produce recombinant Mtb antigen EGFP fused-expression strains. After that, expression levels and sub-cellualr localization of exogenous target protein were further analyzed by Western blot and flow cytometry sorting(FCS), and the fluorescence intensities of recombinant EGFP- expressed strainswere observed in vitro directly and after transfection of murine macrophage cell line RAW264.7. Results The novel mycobacterial membrane-anchored expression vector was constructed successfully by introduction of signal sequence of Mtb 19×103 lipoprotein. Usin g of EGFP as model antigen, exogenous target protein was demonstrated to be expressed with high level and could be anchored into cell membrane of recombinant mycobaterial strains. Conclusion A novel mycobacterial membrane-anchored expression vector was constructed successfully to research recombinant BCG and functions of mycobacterial membrane proteins, and the constructed EGFP-expressed recombinant strains could also be used to research cytophagy in cell model and mycobacterial colony and translocation in animal immunization as model indicator bacteria.%目的构建分枝杆菌膜锚定表达载体,并分析外源目标蛋白的表达情况及其亚细胞定位.方法在分枝杆菌胞内表达载体pMFA42的基础上进行改造,人工合成结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)相对分子质量(Mr)为19×103的脂蛋白膜分泌信号序列,将其插入高效的突变型 furA基因启动子(pfurAma)下游构建新型的分枝杆菌膜锚定表达载体pMFA42M.PCR扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码基因,亚克隆至上述两种载体中并电转化耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms),分别获得重组EGFP融合表达菌株和膜锚定表达菌株;接着将Mtb 主要保护性抗原Ag85A及其嵌合抗原Ag856A2的编码基因亚克隆入膜锚定表达载体pMFA42M中构建Mtb抗原-EGFP融合表达菌株;通过Western blot和流式细胞表面标记技术来分析目标抗原的表达水平及其亚细胞定位,并进一步通过荧光显微镜直接观察重组EGFP融合表达菌株在体外和感染巨噬细胞后的荧光强度.结果通过引入Mtb 19×103脂蛋白膜分泌信号,在高效pfurAma启动子的驱动下,成功地构建了分枝杆菌膜锚定表达载体.利用EGFP作为标签抗原,通过Western blot、荧光显微观察和流式细胞表面标记等技术均证实了外源目标抗原可在分枝杆菌中高水平表达并定位至细胞膜上.结论本研究为重组BCG和分枝杆菌膜蛋白功能研究提供了一种新型的膜锚定表达载体,所构建的EGFP重组表达菌株亦可作为一种模式示踪菌为细胞吞噬和动物免疫中的细菌定植和移位分析提供新思路.【总页数】7页(P537-543)【作者】王鑫;范小勇;马辉;曲勍;朱越雄【作者单位】215123,苏州大学医学部基础医学与生命科学学院;201508,上海,复旦大学附属上海市公共卫生临床中心;201508,上海,复旦大学附属上海市公共卫生临床中心;201508,上海,复旦大学附属上海市公共卫生临床中心;215123,苏州大学医学部基础医学与生命科学学院【正文语种】中文【相关文献】1.苹果MdAFS基因亚细胞定位表达载体的构建及分析2.伪狂犬病毒VP22蛋白C-端系列缺失突变体的构建及亚细胞定位分析3.hβ-NGF基因真核表达载体构建及亚细胞定位4.版纳微型猪近交系B4GALNT2基因真核表达载体构建及亚细胞定位分析5.嗜热内切葡聚糖酶(E1)植物亚细胞定位表达载体的构建及验证因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

植物蛋白质的亚细胞定位研究进展一、本文概述植物蛋白质在细胞中的亚细胞定位对于理解其生物功能及在植物生命活动中的作用至关重要。

近年来，随着生物技术的飞速发展，尤其是分子生物学、遗传学和蛋白质组学等领域的突破，植物蛋白质亚细胞定位的研究取得了显著进展。

本文旨在综述当前植物蛋白质亚细胞定位的研究现状，探讨其方法和技术，分析面临的挑战，并展望未来的发展趋势。

文章首先简要介绍了植物蛋白质亚细胞定位的基本概念和研究意义，随后综述了目前常用的定位方法和技术，包括生物信息学预测、荧光标记、免疫电镜等。

接着，文章重点分析了近年来在植物蛋白质亚细胞定位研究方面取得的重要成果，包括新发现的定位模式、定位机制以及定位与功能关系的研究等。

文章对当前研究中存在的问题和挑战进行了讨论，并提出了未来研究的方向和建议。

通过本文的综述，希望能够为植物蛋白质亚细胞定位领域的研究者提供有价值的参考和启示。

二、植物蛋白质亚细胞定位方法随着分子生物学和生物技术的快速发展，植物蛋白质的亚细胞定位研究取得了显著的进步。

亚细胞定位是理解蛋白质功能的关键环节，它有助于我们揭示蛋白质在细胞内的确切位置，从而推测其可能参与的生物过程。

目前，植物蛋白质亚细胞定位的方法主要包括生物信息学预测、荧光标记显微观察以及细胞分馏技术等。

生物信息学预测：这是一种基于计算机算法的方法，通过分析蛋白质的氨基酸序列，预测其可能的亚细胞定位。

这种方法具有快速、高效的特点，可以在蛋白质表达之前提供初步的定位信息。

目前，已有多个在线工具和数据库可供使用，如TargetP、WoLF PSORT等。

荧光标记显微观察：这种方法通过将荧光基团与特定的蛋白质标记结合，然后利用显微镜观察荧光信号在细胞内的分布，从而确定蛋白质的亚细胞位置。

常用的荧光标记技术包括绿色荧光蛋白（GFP）标记、免疫荧光标记等。

这种方法直观、准确，是目前研究蛋白质亚细胞定位的主要手段之一。

细胞分馏技术：这是一种基于生物化学原理的方法，通过利用不同细胞组分在物理和化学性质上的差异，将细胞内的各种组分进行分离和纯化，从而得到特定的亚细胞组分。