亚细胞定位之烟草转化方法
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本氏烟草(N. benthamian)瞬时表达及相关实验方法:
一、农杆菌介导的烟草瞬时转化:
A、实验步骤:
1、根据实验需要,将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中,并转化农杆菌。
2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中,28℃,200rpm过夜。
*估算时间,防止农杆菌液浓度超过1OD,否则会影响转化效率。
3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时,1000g,5min离心收集农杆菌。
4、用2ml Induction medium(without AS)轻柔重悬农杆菌,然后再次离心收集菌液。
5、重复步骤4。
6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。
7、室温放置1~4小时
8、测OD值,根据实验需要,配置侵染液(组合详见下文)。
9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。
*使用注射器时注意安全,防止针头扎到手,使用完的注射器要把针头套套上再扔,或者将针头放到注射器里面,避免伤害他人;注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套,防止交叉污染。B、试剂:
Induction medium:
MES-KOH PH 5.7 10mM
MgCl210mM
AS 200uM
推荐提前配制母液
1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍。
1M MgCl2 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍。
0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌,分装(避免反复冻融),-20℃。用高压灭菌的超纯水稀释。
C、关于表达时间:
烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间,一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段,但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观,不要错过。
D、关于侵染液浓度:
推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。