几个常用的启动子和诱导表达调控系统

2．质粒DNA和病毒（噬菌体）DNA作为载体的主要特征是什么为外源基因提供进入受体细胞的转移能力；为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力；为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，具有合适的选择标记3．如何理解质粒的不相容性及其在DNA重组克隆过程中的运用意义质粒的不相容性：具有相同或相似复制子结构及调控模式的两种不同的质粒不能稳定存在于同一受体细胞内.4．列举表达质粒、穿梭质粒、探针质粒和cos质粒的不同用途表达质粒:在多克隆位点的上下游分别装有两套转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点序列（SD）序列以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达。

穿梭质粒：质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子以及相应的选择性标记，能在两种不同的受体细胞中复制并检测。

探针质粒：用来筛选克隆基因的表达调控元件。

通常含有报告基因，但缺少相应的调控序列（如启动子或终止子），只有含有启动子或终止子的调控序列被克隆进入载体后，报告基因才能别表达，表达量的大小直接反应了克隆进入的调控元件的强弱。

cos质粒：人工构建的含有λDNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。

具有大的装载量，可以用于构建基因组文库。

5． II类限制性核酸内切酶的主要酶学特征是什么分子量较小的单体蛋白，双链识别和切割活性仅需Mg2+，识别位点为4-6个bp的回文序列，切割位点在识别序列中或靠近识别序列7． KLenow酶与大肠杆菌DNA聚合酶I在结构和功能上的主要区别DNA聚合酶I包括大片段(klenow片段)和小片段功能上：DNA聚合酶I比klenow酶多了5’→3’核酸外切酶活性，两者都具有5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性。

8．影响限制性核酸内切酶活性的主要因素有哪些？温度、盐度等物理因素，DNA样品纯度，DNA甲基化程度，限制性核酸内切酶的缓冲液性质，甘油和微量的金属离子会抑制限制性内切酶的活性9.如何理解粘性末端比平头末端更容易连接在退火条件下，粘性末端的连接为分子内反应，平头末端是分子间反应，平头末端的连接反应更加复杂，速度也慢。

真核启动子EF1a常规表达用mRNA人延长因子1α来源的强哺乳动物表达启动子组成型表达水平十分稳定，与细胞类型无关PGK1 (人/小鼠)常规表达用mRNA磷酸甘油酸酯激酶基因来源的哺乳动物启动子组成型广泛表达,但可能因细胞类型而异。

由于甲基化或脱乙酰作用，倾向于抵抗启动子下调。

human beta actin常规表达用mRNAβ-肌动蛋白基因来源的哺乳动物启动子组成型无处不在，鸡的启动子常用与启动子杂交TRE常规表达用mRNA四环素响应元件启动子被四环素或者类似物诱导通常有本底表达Ac5常规表达用mRNA果蝇Actin 5c 基因来源的强昆虫启动子组成型果蝇表达系统的常用启动子CaMKIIa 光遗传学基因表达mRNACa2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶 II 启动子特异的用于中枢神经系统/神经元表达。

受到钙和钙调蛋白调节。

TEF1常规表达用mRNA酵母转录延伸因子启动子组成型与哺乳动物的EF1a 启动子类似ADH1常规表达用mRNA乙醇脱氢酶I的酵母启动子被乙醇抑制全长版本很强，促进高表达。

截短启动子是组成型的，表达较低。

Ubi常规表达用mRNA玉米泛素基因的植物启动子组成型在植物中促进高表达U6小RNA表达shRNA来源于人U6小核启动子组成型小鼠U6也使用,但效率略差。

常用的原核表达系统启动子T7lac高水平基因表达T7噬菌体来源的启动子加上lac 操纵子 几乎没有本底表达，需要T7 RNA 聚合酶，受到lac 操纵子的控制，可以被IPTG 诱导。

常用与pET 载体，受到lac 操纵子的严格调控Sp6体外转录/常规表达Sp6噬菌体来源的启动子 组成型, 需要SP6 RNA 聚合酶当用于体外转录的时候，专路方向有可能是正向的也可能是反向的，取决于启动子相对于目的基因的方向araBAD常规表达用阿拉伯糖代谢操纵子的启动子阿拉伯糖诱导 弱，常用与pBAD 载体。

适合于快速调控和低的本底表达lac 常规表达用Lac操纵子来源的启动子可以被IPTG或者乳糖诱导在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高地表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。

原核表达操作步骤及注意事项时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。

这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。

大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。

但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。

原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

感受态BL21、BL21(DE3)及BL21(DE3)pLysSBL21没有T7 RNA聚合酶基因, 因此不能表达T7启动子控制的目的基因, 但是可以表达大肠杆菌启动子lac、tac、trc及trp控制的基因。

BL21(DE3)是λDE3溶原菌，带有T7 RNA聚合酶，可用于表达T7启动子控制的目的基因，也可以表达大肠杆菌启动子lac、tac、trc及trp控制的基因。

BL21（DE3）pLysS含有pLysS质粒，一种与pET共存的表达T7裂解酶的质粒，可以减少目的基因的本底表达，提供更严紧的控制。

真核原核启动子原核：几个常用的启动子和诱导调控表达系统1.最早应用于的表达系统的是Lac乳糖操纵子，由启动子lacP + 操纵基因lacO + 结构基因组成。

其转录受CAP正调控和lacI负调控。

cUV5突变能够在没有CAP的存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平上只受lacI 的调控，因而随后得到了更广泛采用。

lacI产物是一种阻遏蛋白，能结合在操纵基因lacO 上从而阻遏转录起始。

乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录。

这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。

3.tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。

4.trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。

5.在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高地表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。

现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。

诱导性基因表达系统1．诱导性基因表达系统(inducible gene expression system) 允许转基因在特定的时间或特定的组织、细胞类型内调控基因表达⽔平。

⽬前，应⽤最⼴泛的诱导性表达系统是基于⼀种可诱导的四环素操纵⼦调控系统Tet-On/Tet-Off和雌激素受体与激素他莫昔芬(tamoxifen)系统。

(1)Tet可控基因表达系统：到⽬前为⽌，在转基因⼩⿏中最⼴泛使⽤的可控基因表达系统是基于⼤肠埃希菌四环素(tetracycline, tet)操纵⼦的tet基因表达调控系统。

tet操纵⼦的调节机制是通过tet阻遏⼦(tet repressor，tetR)来实现的。

tetR蛋⽩结合到被称为四环素操控序列(tet operator, tetO)的DNA上⾏使转录阻遏作⽤。

四环素阻⽌tetR结合到tetO上，从⽽逆转tetR导致的转录抑制。

通过将tetR基因的DNA结合域序列与单纯疱疹病毒 VP16的基因表达激活域序列融合在⼀起，可表达⼀个四环素控制的转录激活蛋⽩(tet transcriptional activator, tTA)。

tTA需结合到合适的Tet反应启动⼦才能发挥作⽤；Tet反应启动⼦是⼀些成串的 tetO重复序列(tet response element, TRE)，置于巨细胞病毒(CMV)的最⼩启动⼦上游，以便与VP16的激活结构域适当地对齐，使得tTA的结合可以激活转录。

Tet可控基因表达调控系统分为Tet-Off和 Tet-On(图3-2)。

图3-2 Tet-Off和Tet-On⽰意图(2)Tet-Off系统：在没有四环素存在时，tTA蛋⽩持续作⽤于tet启动⼦上，使基因持续表达。

在需要转基因保持在⼀个持续表达状态下，该系统是⾮常有⽤的。

加⼊四环素时，四环素可与tTA结合使tTA蛋⽩的结构变化，使其不能与启动⼦结合，从⽽使其驱动的基因表达⽔平下降。

为了使该系统保持“关闭”状态，必须连续添加四环素。

Ara启动子：一种高效的原核基因表达调控系统引言基因表达调控是生物学中的一个重要领域，它涉及到基因在不同的环境条件下如何被激活或抑制，从而产生不同的表型和功能。

基因表达调控的机制有很多，其中之一是利用启动子，即DNA上的特定序列，可以被转录因子识别和结合，从而影响下游基因的转录水平。

启动子可以分为两类：本构型启动子和诱导型启动子。

本构型启动子是指在任何条件下都可以持续地驱动基因的表达，而诱导型启动子是指只有在特定的条件下，如存在某种诱导物时，才能激活基因的表达。

诱导型启动子在基因工程中有着广泛的应用，它们可以用于控制外源基因的表达，从而实现特定的目的，如蛋白质的生产、细胞的改造、基因的敲除等。

诱导型启动子的选择和设计需要考虑很多因素，如诱导物的种类、浓度、成本、安全性、稳定性等，以及启动子的敏感性、效率、特异性、可调节性等。

在这方面，Ara启动子是一种优秀的诱导型启动子，它可以在原核宿主中实现阿拉伯糖代谢相关基因的表达调控，也可以用于外源基因的可调节表达。

本文将介绍Ara启动子的结构、原理、优缺点和应用，以及一些改进和创新的方法。

Ara启动子的结构和原理Ara启动子是一种由噬菌体P1衍生的重组位点，它可以被Cre重组酶识别和结合，从而实现DNA的特异性重组。

Ara启动子由两个启动子Pc和PBAD 组成，它们分别控制araC和araBAD基因的双向转录。

araC基因编码AraC蛋白，它是Ara启动子的主要调节因子，可以结合阿拉伯糖或其代谢产物。

araBAD基因编码三种酶，它们参与阿拉伯糖的分解和利用。

Ara启动子的结构如图1所示。

![图1 Ara启动子的结构]Ara启动子的表达调控过程如下：•当没有阿拉伯糖存在时，AraC蛋白以二聚体形式结合在araI和araO2位点上，形成一个环状结构，阻碍了Pc和PBAD启动子的转录，从而关闭了操纵子的表达。

•当有阿拉伯糖存在时，阿拉伯糖或其代谢产物与AraC蛋白结合，改变了AraC蛋白的构象，使其从araO2位点上脱落，打开了Pc启动子的转录，从而产生更多的AraC蛋白。

实验九外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用【实验目的】1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。

2.掌握乳糖操纵子的调节机制和操作方法。

【实验原理】1.外源基因在原核细胞中的表达蛋白质通常是研究的最终目标，因此蛋白质的表达在基因工程中占有非常重要的地位。

常用的表达系统有原核细胞和真核细胞。

原核细胞表达系统主要使用大肠杆菌，真核细胞表达系统主要有酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。

这些表达系统各有优缺点，应根据实验目的和实验室条件加以选择。

本实验主要介绍以大肠杆菌为代表的原核细胞表达系统。

（1）大肠杆菌表达系统的特点：生物学特性和遗传背景清楚，易于操作；已开发较多的克隆载体可供选择；容易获得大量的外源蛋白（外源蛋白可占细菌总蛋白50％左右）。

（2）蛋白质在原核细胞中的表达特点：原核细胞有其固有的RNA聚合酶，识别原核基因的启动子。

因此，在用原核细胞表达目的基因（无论是真核基因还是原核基因）时，一般应使用原核启动子。

原核基因的mRNA含有SD序列，启动蛋白质的合成。

而在真核基因上则缺乏该序列。

因此，一些商品化原核表达载体上设计有SD序列，以方便真核基因的表达。

原核细胞没有mRNA转录后加工的能力。

因此，在原核细胞中表达真核基因时，应使用cDNA 为目的基因。

原核细胞缺乏真核细胞对蛋白质进行翻译后加工的能力。

如表达产物的功能和蛋白质的糖基化、高级结构的正确折叠有关，必须慎重使用原核表达系统。

外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物往往在胞浆聚集，形成均一密度的包涵体。

包涵体的形成有利于保护表达产物不被胞内的蛋白酶降解，而且可以通过包涵体和胞内其他蛋白质密度不同来纯化包涵体蛋白。

但包涵体蛋白不具有该蛋白的所有生物学活性，往往需要通过变性复性的方法恢复活性，有时只能回复部分活性。

（3）蛋白质在原核细胞表达的调控启动子是转录水平调控的主要因素。

根据启动子起始mRNA合成效率的不同，可分为强、弱启动子，但是启动子的强弱是相对于不同基因而言的。

IPTG 诱导表达1.原核表达系统将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中高效地表达、合成基因产物的体系。

2.原核生物基因表达特点➢原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。

➢操纵子（operon）是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位3.原核基因的表达调控原核生物绝大多数基因按功能相关性成簇地串联、密集于染色体上，共同组成一个转录单位──操纵子（元），如乳糖（lac）操纵子、阿拉伯糖（ara）操纵子及色氨酸（trp）操纵子（元）等。

操纵子（元）机制在原核基因调控中具有较普遍的意义。

4.乳糖（lac）操纵子（元）调节机制糖操纵子4.乳糖操纵子的结构5.阻遏蛋白的负性调节➢阻遏蛋白的负性调节在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。

此时，I序列在P启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。

当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。

在这个操纵子（元）体系中，➢真正的诱导剂并非乳糖本身。

乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。

后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。

➢异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定.6.乳糖操纵子的结构及阻遏作用7.外源基因在原核表达系统中表达的必要条件1.删除内含子和5’非编码区2.外源基因置于强启动子和SD顺序控制下3.维持正确开放阅读框架（ORF）4.mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解8.影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子2、基因剂量3、核糖体结合位点9.常见原核强启动子•Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导•Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。

•Ptac :Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。

•P L和P R启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ噬菌体CI基因负调控。

查看完整版本: [-- pET原核表达手册(中文版) --]西部药学论坛-> 生物制药 -> pET原核表达手册(中文版)[打印本页]登录 -> 注册 -> 回复主题 -> 发表主题红色法拉利2006-06-01 21:50原核表达手册(中文版)可以说是原核表达宝典级读物,MERCK公司产品,让你对原核表达有个更深的认识,不错的东东，推荐大家读读红色法拉利2006-06-01 21:57之所以首先介绍Novagen公司的产品是因为用过它的系列载体，感觉很好用。

Novagen的母公司是德国默克（Merck）公司，它是国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darm stadt，已有300多年的历史。

已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建有62个生产基地。

Novagen公司出品的系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。

系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理见下图。

T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。

T7噬菌体基因编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。

它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成m RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。

并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。

在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。

T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。

噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株，一段含有lacⅠ，lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的 DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、 HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导型，类似于Lac表达系统。