饲料中三聚氰胺测定不确定度的评定

饲料中三聚氰胺测定(高效液相色谱法)的不确定度分析评价人审核人#############检测中心20##-##-##饲料中三聚氰胺的测定(高效液相色谱法)的不确定度分析1 实验部分1.1 实验方法：按NY/T 1372—2007《饲料中三聚氰胺的测定》方法进行。

1.2 三聚氰胺标准溶液制备1.2.2 标准储备液：称取三聚氰胺标准品（BW 3831）50mg（精确到0.01mg），用甲醇溶液（20%的甲醇水溶液，甲醇为色谱级，水为一级水）溶解并定容于100mL 容量瓶中，该溶液浓度为500μg/mL。

1.2.3 标准中间液：吸取标准储备液10mL，于100mL容量瓶内，用甲醇溶液（同上）定容至100mL，该溶液三聚氰胺浓度为50μg/mL。

1.2.4 标准工作液：用移液管分别移取标准中间液1mL、5 mL、10 mL、25 mL 和50 mL于5个50 mL容量瓶内，用甲醇溶液（同上）定容，该溶液三聚氰胺浓度为1.0μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL、25μg/mL和50μg/mL。

1.3 样品测定方法称取5g试样（精确至0.01g），准确加入50mL三氯乙酸溶液（10g/L），加入2mL乙酸铅溶液（22g/L）。

摇匀，超声提取20min。

静止2min，取上层提取液约30mL转入离心管，在10000r/min离心机上离心5min。

分别用3mL甲醇，3mL水活化混合型阳离子交换固相萃取柱，准确移取10mL离心液分次上柱，控制过柱速度在1mL/min以内再用3mL水和3mL甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱，抽近干后用氨水甲醇溶液（氨水：甲醇=5：100）3mL洗脱。

洗脱液50℃氮气吹干，准确加入甲醇溶液（同上），涡旋振荡1min，过0.45μm滤膜，上机测定。

液相色谱条件为：色谱柱：C8柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒度5μm；或性能相当的色谱柱。

柱温：室温。

流动相流速：1.0 mL/min 。

检测波长：240 nm 。

进样10 μL ，用多点校正外标法定量。

2 数学模型式中：X —―试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg ）； V —―净化后加入的甲醇溶液体积，单位为毫升（mL ）；Cx —―标准曲线上查到的试样中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升（μg /mL ）；m —―试样质量，单位为克（g ）； n —―稀释倍数。

3 不确定度来源分析从测量过程和数学模型分析，此次试验测定的不确定度来源可归纳为以下几方面。

3.1 标准曲线引入的相对不确定度3.1.1 三聚氰胺标准品引入的相对标准不确定度()std rel μ实验所用三聚氰胺标准品购自国家标准计量局，证书给出标准值99.9%，相对扩展不确定度为0.5%，扩展因子k 为2，则()0025.02/%5.0rel ==std μ。

3.1.2 标准品称量引起的相对标准不确定度()m std rel μ用准确至0.01mg 的电子分析天平称取50mg 三聚氰胺标准品，不确定度主要nmV C X ⨯⨯=x由天平校准、环境、称量变动性所产生。

环境影响一般忽略，而称量变动性在检测结果重复性中已经评定，因此称量过程中所引入的不确定度来自天平校准。

天平最大误差为0.01mg 两次减量法称取引入的不确定度属于B 类不确定度。

按矩形分布，其标准不确定度为：()00082.031.002m r ⨯=μ mg ，故标准品称量引入的相对标准不确定度为：()000016.05000082.0rel ==m std μ 。

3.1.3 标准溶液配制引入的相对标准不确定度配制过程的不确定度主要由量器的校准引起的，分别计算如下。

3.1.3.1 移液管 （1）校准A 级1.00mL 移液管，检定证书给出，20℃时的允差为±0.007mL ，假设矩形分布，则其不确定度为0.007/3=0.0040mL ；A 级5.00mL 移液管，检定证书给出，20℃时的允差为±0.015mL ，假设矩形分布，则其不确定度为0.015/3=0.0087mL ；A 级10.00mL 移液管，检定证书给出，20℃时的允差为±0.020mL ，假设矩形分布，则其不确定度为0.020/3=0.0115mL 。

（2）温度温度的波动范围为±4℃，设为矩形分布，水的膨胀系数为4-101.2⨯/℃，温度影响不确定度为：1.00mL 移液管：1.00=⨯⨯⨯34101.24-0.0005mL ； 5.00mL 移液管：5.00=⨯⨯⨯34101.24-0.0024mL ； 10.00mL 移液管：10.00=⨯⨯⨯34101.24-0.0048mL 。

则1.00mL 移液管合成体积标准不确定度：()==1v rel μ=+00.10005.00040.0220.0040mL ；5.00mL 移液管合成体积相对标准不确定度：()==5v rel μ=+00.50.00240087.0220.0018mL ；10.00mL 移液管合成体积相对标准不确定度：()==10v rel μ=+00.100.00480.0115220.0012mL综上，移液管合成体积相对标准不确定度：()()()()222210v rel 25v rel 21v rel v rel 0.00120.00180.00401++=++====μμμμ=0.0045mL3.1.3.2 容量瓶（1）校准A 级100.0mL 移液管，检定证书给出，20℃时的允差为±0.10mL ，假设矩形分布，则其不确定度为0.10/3=0.058mL ；A 级50.00mL 移液管，检定证书给出，20℃时的允差为±0.05mL ，假设矩形分布，则其不确定度为0.05/3=0.029mL（2）温度温度的波动范围为±4℃，设为矩形分布，水的膨胀系数为4-101.2⨯/℃，温度影响不确定度为：100.0mL 移液管：100.0=⨯⨯⨯34101.24-0.0485mL ； 50.00mL 移液管：50.00=⨯⨯⨯34101.24-0.0242mL 。

则100.0mL 移液管合成体积合成标准不确定度：()==100v rel μ=+0.1000485.0058.0220.00078；100.0mL 移液管合成体积相对标准不确定度：()==50v rel μ=+0.500242.0029.0220.00077。

综上，容量瓶的相对标准不确定度()()()=+=+===22250v rel 2100v rel 2v rel 0.000770.00078μμμ0.0011故可以得到，配制标准溶液中，由量器引入的合成相对标准不确定度为：()()()=+=+=2222v rel 2v1rel v std rel 0.00110.0045μμμ0.00463.1.4 标准使用液（三聚氰胺标准使用液选择浓度为10mL g μ）重复测定产生的相对不确定度()0rel A μ：标准使用液6次重复测定的峰面积，见表1。

表1 标准使用液重复测定（n=6）结果次数 1 2 3 4 5 6峰面积A 0 337572 339848 337498 330257 335660 337257平均峰面积0A336349得出标准偏差()==00SA A μ3270.186则重复测定标准使用液产生的相对不确定度()()==0A rel 0A Aμμ0.0097233.1.5 标准工作曲线拟合引入的标准不确定度对标准系列工作液进行测量，测得其峰面积，以峰面积A-浓度C （μg/mL ）作图，得标准曲线，曲线回归方程为441009.11041.3y ⨯-⨯=x ，r 2=0.999989，r=0.999994，故斜率b=41041.3⨯，截距a=41009.1⨯-。

表2系列标准工作溶液峰面积测定结果：标准工作液浓度mL g x i ⋅μ峰面积 峰面积平均值0 0 0 0 0 1 34358 35894 36620 35624 5 174822 168317 168624 170588 10 344620 348156 349868 347548 25 890768 885146 883929 886614 5017194271711082172049517170013.1.5.1 回归曲线的标准偏差()y μ（即y 回归曲线的标准偏差x y s ）按式（1）计算：()()2y 21n1--∑∑====mn y y s i ij mj i xyμ (1)式中：y ij ——液相色谱仪的各点峰面积； Yi ——回归曲线的计算值； n ——测量点数目，n=6；M ——每测量点重复测量次数，m=3。

将表2数据代入（1）式得()y μ= 2780灵敏度系数c(y)=1/b=-5102.93⨯3.1.5.2 由分散性引入的回归曲线斜率的标准偏差及不确定度()b μ为：()()()()21y b s b xx i n i -∑===μμ=63.58灵敏度系数()()=--=2c ba yb 0.000462（x 取平均值时，y=526229）。

3.1.5.3 由分散性引入的回归曲线斜率截距的标准偏差及不确定度()a μ为：()()()2121a s a xx mn x s i n i ini xy-∑∑====μ=873.92灵敏度系数c(a)=-1/b=-0.000029 将以上数据代入下式计算：()()()()()()()b b c a a c y y cx 222222c 2μμμμ++== 0.00814待测样品中三聚氰胺含量c 的最佳估计值为5 mg/kg ，则标准工作曲线拟合引入的相对标准不确定度为：()()==cx c rel μμ曲线拟合0.091/5.0= 0.018综合 3.1.1至 3.1.5，制作标准曲线整个过程中引入的相对不确定度()()()()()()021.0018.0009723.00046.0000016.00025.022222rel 2A rel 2vstd rel 2mstd rel 2std rel 2rel =++++=++++=曲线拟合曲线μμμμμμο3.2 样品称量m 引入的相对标准不确定度μrel （m ）称量样品5.00g ，根据电子天平检定证书规定的天平最大允差为0.001g ，按均匀分布考虑，则g 000577.03001.0m 1==）（μ，重复性误差和四角误差为0.002g ，则g 00115.03002.0m 2==）（μ，天平校准的标准不确定度为()()[]()[]00173.02m 2121=⨯+=mmμμμ g 。