马流感病毒血凝素基因甲病毒复制子重组表达质粒的构建及其免疫效力评价

论著流感病毒受体结合表位真核载体的构建及表达罗俊1,王欢1,戴军1,左斌1,裴德翠1,丰峰1,李婉宜1,邝玉1,王保宁1,蒋忠华1,李虹2,李明远1*(1.四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室,四川成都610041;2.四川大学华西第二医院港大联合研究中心) 摘要 目的 构建甲型流感病毒血凝素(H A )信号肽(SP)与HA 唾液酸受体结合部位(RB)所含T 、B 表位的基因片段(RBT 、R BB)真核表达质粒,研究其在真核细胞中的表达与免疫特性。

方法 通过重叠延伸PCR 法(o ver lap PCR)将HA 的SP 分别与R B 、RBT 、RBB 通过一段多肽接头Gly4Ser 融合为SP RB 、SP RBT 和SP R BT ,将其分别插入pcD N A 3.1(+)载体,构建质粒,鉴定正确后转染M DCK 细胞,RT PCR 、免疫荧光、M T T 检测该质粒的表达和分泌。

结果 融合基因真核表达质粒构建成功,在M DCK 细胞中成功表达,转染细胞培养上清能刺激淋巴细胞增殖。

结论 SP RB 、SP RBT 、SP RBB 真核表达载体成功构建,表达产物能刺激淋巴细胞增值,为流感病毒唾液酸受体结合部位的T 、B 细胞表位免苗研究提供初步依据,也为流感核酸疫苗的研制奠定了基础。

关键词 流感病毒;T 细胞表位;B 细胞表位;免疫荧光技术;淋巴细胞增殖试验中图分类号 R373.13 文献标识码 A 文章编号 1673 5234(2011)01 0008 4[J our nal of Pathogen B iology .2011Jan;6(1):8-11.]C onstruction of eukaryotic expression plasmid for receptor binding of influenza virus and their expression LU O Jun 1,WANG H uan 1,DAI Jun 1,ZU O Bin 1,PEI Dei cui 1,FENG Feng 1,LI Wan yi,KU ANG Yu 1,WANG Bao ning 1,JIANG Zhong hua 1,LI H ong 2,LI M ing yuan 1 (1.D ep ar tment of M icrobiology ,West China School of Pr eclinical and For ens ic M edicine,Sichuan Univ er sity ,Chengdu 610041,China;2.T he J oint R esearch Center of W es t China Seco nd Univ er s ity H os p ital of S ichuan Univ er sity and the Faculty of M edicine,Univer sity of H ong K ong )Abstract Objective T o const ruct eukary otic ex pression vector s fo r the signal pept ide (SP )of hemagg lutinin (HA )o f influenza A vir us and its acylneuraminate recepto r binding (RB)sites incor po rating gene segments o f T and B epitopes (RBT and RBB,respectively)and to observe the expressio n o f t arg et pr otein by and immunolog ical characterist ics o f eu kar yot ic cells. M ethods A polypept ide linker Gly4Ser w as used to splice SP w ith RB,RBT ,and RBB by ov erlap P CR to r espectively construct SP RB,SP RBT ,and SP RBT fusio n g enes.T hese g enes w ere inserted into eukar yo tic expres sio n plasmids pcD NA 3.1(+).A fter identification,pcDN A3.1(+)/SP R B,pcDN A3.1(+)/SP RBT ,and pcDN A 3.1(+)/SP R BB wer e tr ansfected into M D CK cells.T he ex pr essio n o f these g enes was analy zed w ith RT P CR,immunoflu o rescence assay ,and lym phocyt e pr oliferation test with M T T . Results pcDN A 3.1(+)ex pr essio n vector s incor po ra ting SP RB,SP RBT ,and SP RBT fusion genes wer e successfully constr ucted.T he fusion pro tein w as detect ed in M DCK transfected with pcDN A 3.1(+)/SP RB,pcDN A 3.1(+)/SP RBT ,or pcD NA 3.1(+)/SP RBB and st imulated lym phocyte pro liferatio n. C onclusion Eukar yo tic ex pr essio n plasmids fo r SP RB,SP RBT and SP RBT fusion genes wer e successfully constructed and t he ex pression pro ducts stimulated lympho cyte pro liferatio n,establishing a solid foundation for fur ther study of receptor binding,immuno lo gical study o f T and B cell epitopes o f influenza v ir us,and study of DN A vaccines.Key words Influenza virus;T cell epito pe;B cell epitope;immunofluo rescence assay ;lymphocyte pro liferatio n test流感病毒的高度变异性常导致流感的流行,因此如何获得高效及安全的流感疫苗是科学工作者关注的课题。

甲型/乙型流感病毒实验室活动风险评估报告一、生物学特征（一）种类和分型流行性感冒病毒（influenza virus），是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的代表种，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行性感冒（流感）的病原体。

其中甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行。

例如1918～1919年的大流行中，全世界至少有2000万～4000万人死于流感；乙型流感病毒对人类致病性也比较强，但是人们还没有发现乙型流感病毒引起过世界性大流行；丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。

甲型流感病毒于1933年分离成功，乙型流感病毒于1940年获得，丙型流感病毒直到1949年才成功分离。

流感分类根据流感病毒感染的对象，可以将病毒分为人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒以及禽流感病毒等类群，其中人类流感病毒根据其核蛋白的抗原性可以分为三类:甲型流感病毒（Influenza A virus），又称A型流感病毒乙型流感病毒（Influenza B virus），又称B型流感病毒丙型流感病毒（Influenza C virus），又称C型流感病毒感染鸟类、猪等其他动物的流感病毒，其核蛋白的抗原性与人甲型流感病毒相同，但是由于甲型、乙型和丙型流感病毒的分类只是针对人流感病毒的，因此通常不将禽流感病毒等非人类宿主的流感病毒称作甲型流感病毒。

在核蛋白抗原性的基础上，流感病毒还根据血凝素HA和神经氨酸酶NA的抗原性分为不同的亚型。

（二）形态结构流感病毒呈球形，新分离的毒株则多呈丝状，其直径在80至120纳米之间，丝状流感病毒的长度可达4000纳米。

流感病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分。

病毒的核心包含了存贮病毒信息的遗传物质以及复制这些信息必须的酶。

流感病毒的遗传物质是单股负链RNA，简写为ss-RNA，ss-RNA与核蛋白 (NP)相结合，缠绕成核糖核蛋白体 (RNP)，以密度极高的形式存在。

甲型流感病毒 M1、M2和 M42蛋白研究进展谭伟;谢芝勋【摘要】Influenza virus genome consists of eight segmented genes .From the beginning ,researchers gen‐erally accepted that each gene of influenza virus only encodes one viral protein .Later on ,scientists found that influenza virus M gene encoded M 1 matrix protein and M 2 ion‐channel protein ,w hereas NS gene en‐coded nonstructural proteins NS1 andNS2 ,respectively .It was recently discovered that PB1 gene encoded proteins PB1 ,PB1‐F2 and PB1‐N40 , w hereas PA gene encoded pr oteins PA ,PA‐X ,PA‐N155 and PA‐N182 .To date ,four influenza virus genes has been shown to be able to encode two or more viral proteins , demonstrating that influenza virus can employ in cells mRNA alternative splicing and various protein trans‐lation mec hanisms to expand its genome coding capacity .In 2012 ,Wise et al .found that influenza virus M gene could encode a novel viral protein ,M42 .This article will provide a brief overview of research on pro‐teins M1 ,M2 and M42 encoded by influenza virus M gene .%甲型流感病毒基因组由8个分节段的基因组成，最初认为流感病毒的每个基因只能编码一个病毒蛋白，但随后发现M基因编码两种蛋白，即M 1基质蛋白和M 2离子通道蛋白。

流感的危害流行性感冒简称流感，是由流行性感冒病毒引起的呼吸道疾病，具有传染性强、流行面广、潜伏期短、发病率高等特点，在儿童、老人及高危人群中的死亡率很高。

有数据表明，每年冬季流感爆发期会使全球人口近10％感染致病。

流感病毒简介流行性感冒病毒（influenza virus）简称流感病毒，是引起流行性感冒（流感）的病原体，属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）。

(是与粘液蛋白有特殊亲和性病毒中的1科)粘病毒是指对人或某些动物红细胞表面的黏蛋白有亲和力的病毒。

正、副粘病毒的区分以其核酸是否分节段为标准，分节段者为正粘病毒，不分节段者为副粘病毒，正粘病毒科只有流感病毒一个种。

（一）形态与结构流感病毒具有多形态，一般为球形，也有的呈丝状或杆状，病毒直径为80-120nm。

流感病毒的结构主要包括内部的核心、衣壳（核衣壳）和外面的包膜（附图）。

Fig. (1) Schematic representation of the influenza A virus (Reference [22])1、核心（core）流感病毒的核酸为分节段、负链单股RNA，称为分节段基因组（segmented genome）。

其中甲型和乙型流感病毒的核酸分为8个节段，而丙型流感病毒的分为7个节段。

每一基因节段分别编码不同的蛋白，决定流感病毒的遗传特性。

第1~6基因节段分别编码RNA多聚酶（RNA polymerase）PB2、PB1、PA、血凝素（hemagglutinin，HA）、核蛋白（nucleoprotein, NP）、神经氨酸酶（neuraminidase, NA）；第7基因节段编码包膜蛋白，包括内膜基质蛋白（M1）和膜蛋白（M2）；第8节段编码非结构蛋白（nonstructural protein, NS）NS1和NS2。

流感病毒各基因节段复制后，组装入子代病毒体中，但在组装过程中极易发生基因重组而导致新病毒株的出现，这是流感病毒容易发生变异而出现大流行的主要原因。

(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510712786.4(22)申请日 2015.10.27C12N 7/04(2006.01)C12N 15/63(2006.01)C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)(71)申请人广东和信健康科技有限公司地址510530 广东省广州市萝岗区瑞发路1号1栋4楼申请人广州呼研所生物技术有限公司(72)发明人李小锋 李晨阳 崔红 商兴芳(74)专利代理机构广州华进联合专利商标代理有限公司 44224代理人万志香 胡杰(54)发明名称一种假病毒颗粒及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种假病毒颗粒，其是由MS2噬菌体的衣壳蛋白包裹了依次由甲型流感病毒、乙型流感病毒和β-actin 三种碱基片段串联而成的检测序列的DNA-蛋白复合体。

本发明还公开了上述假病毒颗粒的制备方法和其作为甲型流感病毒、乙型流感病毒检测的质控品的应用。

本发明的假病毒颗粒制备方法简单、操作容易、获得的假病毒纯度高，可作为甲型流感病毒及乙型流感病毒核酸检测试剂盒中的质控品，无传染性且稳定性好，具有耐核糖核酸酶等特点。

(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书16页序列表4页 附图3页CN 105200018 A 2015.12.30C N 105200018A1.一种假病毒颗粒，其特征在于，其是由MS2噬菌体的衣壳蛋白包裹了依次由甲型流感病毒、乙型流感病毒和β-actin三种碱基片段串联而成的检测序列的DNA-蛋白复合体。

2.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述甲型流感病毒的碱基片段为SEQ ID NO:3或对SEQ ID NO:3进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述乙型流感病毒的碱基片段为SEQ ID NO:4或对SEQ ID NO:4进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。

甲型流感的病复制与细胞宿主因素甲型流感病毒的复制与细胞宿主因素甲型流感，又称为H1N1流感或甲流，是一种由甲型流感病毒引起的急性呼吸道传染病。

病毒的复制与细胞宿主因素密切相关，本文将从这两个方面进行探讨。

一、甲型流感病毒的复制甲型流感病毒是一种负链单股RNA病毒，其复制过程通常包括以下几个关键步骤：1. 侵入细胞甲型流感病毒通过病毒表面的血凝素（H）蛋白与细胞表面的糖基化受体结合，从而侵入宿主细胞。

一旦病毒进入呼吸道上皮细胞，它将开始复制和传播。

2. 病毒基因组释放一旦病毒进入细胞，其外膜上的血凝素蛋白的活性使病毒能够与细胞内的囊泡融合，使得病毒基因组进入细胞质。

此后，病毒基因组将被释放出来，准备进行下一步的复制。

3. 病毒基因组复制与转录病毒基因组的复制和转录主要依赖于病毒内的RNA聚合酶。

该酶负责合成病毒基因组的互补链，同时也合成了病毒mRNA。

这一步骤为后续的病毒基因组复制和蛋白质合成提供了必要的模板。

4. 病毒蛋白质合成通过病毒内的核糖体结合位点，在宿主细胞内进行翻译，合成病毒所需的蛋白质。

这些蛋白质包括病毒膜蛋白、核蛋白以及血凝素等。

这些蛋白质的合成是病毒复制的基础，也为病毒的组装和释放提供了必要的支持。

5. 病毒组装和释放合成的病毒蛋白质会逐渐聚集在细胞内形成新的病毒颗粒。

最终，新病毒颗粒将通过细胞膜的融合、凋亡或细胞溶解等方式释放到细胞外，继续传播感染。

二、细胞宿主因素对甲型流感的影响除了病毒本身的复制过程外，细胞宿主因素也对甲型流感的发病和传播起着重要作用。

1. 受体特异性甲型流感病毒的侵入与细胞表面的受体结合密切相关。

不同的受体表达模式和特异性可影响病毒对不同类型细胞的感染能力和传播。

例如，H1N1病毒主要结合α-2,6型糖基化受体，其广泛分布于人类上皮细胞和淋巴细胞中，从而导致甲型流感在人群中蔓延。

2. 免疫反应宿主细胞的免疫反应是对抗甲型流感病毒感染的重要防线。

宿主细胞通过产生干扰素和其他炎症因子来启动免疫反应，并激活天然免疫细胞，如巨噬细胞和自然杀伤细胞等。

陈双钊一常见的致动物疾病性病毒狂犬病病毒狂犬病病毒（Rabies virus）属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus），是引起人和动物狂犬病的病原，该病在世界各地均有发生。

一、生物学特性病毒子长140～180nm，宽75～80nm，一端钝圆，另端平凹，呈子弹头形或试管形。

在螺旋对称的衣壳中，含有负股单股RNA。

具有脂蛋白的囊膜，在膜上有血凝素的穗状突起。

该病毒只有一个血清型。

二、抵抗力病毒在pH为7～9的范围内比较稳定，在56℃经30min可使病毒灭括。

五、致病性狂犬病病毒几乎可以感染所有的温血脊椎动物，同样也能感染人。

本病主要由患病动物咬伤后而感染。

当健康动物皮肤粘膜有损伤时，接触病畜的唾液亦可以感染。

病犬的唾液于症状出现前1～2周便可能会有病毒。

存在于病畜唾液中的病毒，通过咬伤而进入易感动物的皮下组织，然后沿着神经纤维由外周进入神经中枢。

也有人认为病毒是由外周经血液侵入脑组织。

病毒在脊髓和脑组织中增殖，并可按离心方向由中枢神经向外扩散，而脑脊髓液在病毒扩散中，亦起着重要作用，使所有器官都能查出病毒。

抵达唾液腺的病毒，在其上皮细胞内又大量增殖，并进入到唾液中。

病毒在中枢神经系统中的继续繁殖，损害神经细胞和血管壁，引起血管周围的细胞浸润。

神经细胞受刺激后，首先引起兴奋症状，如神经紊乱和反射性增高，后期神经细胞变性，逐渐引起麻痹，当呼吸中枢麻痹后即可造成死亡。

六、微生物学诊断常用的特异性检查方法有包涵体检查，动物试验，荧光抗体检查等三种。

（一）包涵体检查取大脑、小脑，特别是海马角部分，用刀片切开印片，趁印片未完全干燥时，以塞勒（Seller）氏液染1～5s，水洗、干燥、镜检。

内基氏小体呈鲜红色、间质呈粉红色、红细胞则为桔红色。

内基氏小体为圆形、卵形、核形、阿米巴形。

大小为24～27μm，位于细胞浆内。

用姬姆萨氏（Giemsa）染色，小体为红色（图10-1）。

由于有些犬、猪和草食兽的病例及病初死亡或早期剖杀动物中可能不见包涵体，所以并不是所有的病例都能检查出包涵体来。

第18章正粘病毒科（Orthomyxoviridae）讲解第⼗⼋章正粘病毒科(Orthomyxoviridae)⼀、概述主要参考⽂献⼀、概述流⾏性感冒病毒(以下简称流感病毒)的⾎凝素和神经氨酸酶对粘(糖)蛋⽩有亲和⼒，因此，原称为粘病毒，后统称为正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，以与另⼀科病毒--副粘病毒相区别。

甲型流感病毒的感染范围很⼴，常以流⾏的形式出现，发病急剧，蔓延迅速，危害很⼤。

在1918年第⼀次世界⼤战结束时，流感⼤流⾏，席卷全世界，死于流感的⼈⽐战争本⾝死亡的还多。

1933年，Smith等⾃⼈体分离出了甲型流感病毒。

家畜和家禽的流感都是流感病毒引起的。

Shope于1931年研究猪的流感，从猪体分离出⼀株病毒，将此种病毒接种易感猪后，使其发⽣了典型的猪流感。

Sovinova和Waddell等先后从马体中分离出马甲1型和马甲2型两株马流感病毒。

1955年证明鸡流感病毒含有甲型流感病毒核蛋⽩。

⼄型流感病毒发现于1940年，能引起⼈的呼吸道感染，但流⾏规模⽐甲型流感病毒⼩得多。

丙型流感病毒也是感染⼈的病毒，但极少引起流⾏。

1982年郭元吉等发现了猪的丙型流感病毒。

1.分类现状与命名正粘病毒科中原来只有⼀个属，即流感病毒属。

根据国际病毒分类委员会(ICTV) 第6次分类报告(1995)将正粘病毒科由原来的⼀个流感病毒属分为三个病毒属：甲、⼄型流感病毒属(Influenza virus A, B)；丙型流感病毒属(Influenza Virus C)；“类托⾼⼟病毒属”(“Thogoto －like viruses”)。

三个属的代表种分别为甲型流感病毒、丙型流感病毒、托⾼⼟病毒(Thogoto virus)。

现将正粘病毒科的分类现状列表18-1。

表18-1. 正粘病毒科分类现状科属代表种成员正粘病毒科（orthomyxoviridae）甲、⼄型流感病毒属(Influenza virus A, B)甲型流感病毒(Influenza virus A)丙型流感病毒属(Influenza Virus C)丙型流感病毒(Influenza Virus C)“类托⾼⼟病毒属”(“Thogoto-like virus”)托⾼⼟病毒(Thogoto virus)有关流感病毒的分类与命名，世界卫⽣组织1971年推荐⾸先以病毒蛋⽩为依据，将其分为甲、⼄、丙三型，再按表⾯抗原区分为⾎凝素(H)和神经氨酸酶(N)的不同亚型。