黄曲霉素检测法

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食品中黄曲霉毒素的测定—免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法1 范围本标准规定了免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法测定食品中黄曲霉毒素的条件和详细分析步骤。

本标准适用于玉米、花生及其制品（花生酱、花生仁、花生米）、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中黄曲霉毒素的测定。

样品中黄曲霉毒素的检出限：免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法为1mg/kg；免疫亲和层析净化—荧光光度法测定酱油样品中黄曲霉毒素检出限为2.5mg/kg。

2 免疫亲和层析净化高效液相色谱法2.1 方法提要试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。

用水或吐温/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。

2.2 试剂和溶液除非另有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。

2.2.1甲醇（CH3OH）：色谱纯2.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水2.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水2.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水2.2.5 苯：色谱纯2.2.6乙腈：色谱纯2.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯2.2.8氯化钠（NaCl）2.2.9磷酸氢二钠（Na2HPO4）2.2.10磷酸二氢钾（KH2PO4）GB/T 18979-20032.2.11氯化钾（KCl）2.2.12 PBS缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。

2.2.13 吐温-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000mL。

2.2.14 pH7.0磷酸盐缓冲溶液：取25.0mL 0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液与29.1mL 0.1mol/L 的氢氧化钠溶液混匀后，稀释到100 mL。

2.2.15 黄曲霉毒素标准品（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2）：纯度≥99%。

2.2.16 黄曲霉毒素标准贮备溶液：用苯-乙腈（98+2）溶液分别配制0.100mg/mL的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准贮备液，保存于4ºC备用。

2.2.17 黄曲霉毒素混合标准工作液：准确移取适量的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准贮备液，用苯-乙腈（98+2）溶液稀释成混合标准工作液。

2.2.18 柱后衍生溶液（0.05%碘溶液）：称取0.1g碘，溶解于20mL甲醇后，加纯水定容至200mL，以0.45μm的尼龙滤膜过滤，4℃避光保存。

2.3 仪器和设备实验室常规仪器、设备、材料及下列各项。

2.3.1 高速均质器：18,000 r/min ~22,000 r/min。

2.3.2 黄曲霉毒素免疫亲和柱。

2.3.3 玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5μm。

2.3.4 玻璃注射器：10 mL，20mL。

2.3.5 玻璃试管：直径12 mm ，长75mm，无荧光特性。

2.3.6 高效液相色谱仪：具有360nm激发波长和大于420nm发射波长的荧光检测器。

2.3.7 空气压力泵。

2.3.8 微量注射器：100mL。

2.3.9 色谱柱：C18柱（柱长150 mm ，内径4.6mm，填料直径5mm）。

2.4 分析步骤2.4.1提取2.4.1.1大米、玉米、小麦、花生及其制品：准确称取经过磨细（粒度小于2mm）的试样25.0g 于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及准确加入125.0mL（）甲醇-水（7+3），以均质器高速搅拌提取2min。

定量滤纸过滤，准确移取15.0mL（）滤液并加入30.0mL（）水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1~2次，至滤液澄清，备用。

2.4.1.2 植物油脂：准确称取试样25.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及加入甲醇-水（7+3）至125.0mL（），以均质器高速搅拌提取2min。

定量滤纸过滤，准确移取15.0mL（）滤液并加入30.0mL（）水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1~2次，至滤液澄清，备用。

2.4.1.3 酱油：称取试样50.0g于250.0mL具塞锥形瓶中，加入2.5g氯化钠及加入甲醇-水（8+2）至100.0mL（），以均质器高速搅拌提取1min。

定量滤纸过滤，准确移取10.0mL （）滤液并加入40.0mL（）水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1~2次，至滤液澄清，备用。

2.4.1.4 食醋：准确称取5.0g样品，加入1.0g氯化钠，以pH7.0磷酸盐缓冲溶液稀释至25.0mL（），混匀，定量滤纸过滤。

取10.0mL（）滤液加入10.0mL（）缓冲液，混匀。

以玻璃纤维滤纸过滤1~2 次，至滤液澄清，备用。

2.4.2 净化2.4.2.1 大米、玉米、小麦、花生及其制品、植物油脂：将免疫亲和柱连接于20.0mL玻璃注射器下。

准确移取15.0mL（）样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体。

以10.0mL水淋洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体。

准确加入1.0mL （）色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

2.4.2.2 酱油：将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。

准确移取10mL（）酱油样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min 流速缓慢通过免疫亲和柱。

用10.0mL 0.1%的吐温/PBS清洗，再以10.0mL水清洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2 mL~3mL空气通过柱体。

准确加入1.0mL（）色谱级甲醇洗脱，流速为1mL/min~2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

2.4.2.3食醋：将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。

准确移取10.0mL（）食醋样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，用10mL 0.1%的吐温/PBS溶液清洗，再以10.0mL水清洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2 mL~3mL空气通过柱体。

准确加入1.0mL（）色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

2.4.3测定2.4.3.1 高效液相色谱条件流动相：甲醇-水（45+55）流速：0.8mL/min柱后衍生化系统衍生溶液：0.05%碘溶液衍生溶液流速：0.2mL/min反应管温度：70°C反应时间：1min2.4.3.2 定量用进样器吸取100mL黄曲霉毒素标准工作液（2.2.17）注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值（峰高或峰面积），得到黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准溶液高效液相色谱图。

参考谱图见图1。

图1 黄曲霉毒素B1, B2, G1, G2的标准谱图取样品洗脱液1.0mL加入重蒸馏水定容至2.0mL，用进样器吸取100mL注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值（峰高或峰面积）。

经过与黄曲霉毒素标准液谱图比较响应值得到试样中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的浓度。

2.4.4 空白试验用水代替试样，按2.4.1~2.4.3步骤做空白试验。

2.4.5 结果计算检测结果按公式（1）计算： (1)式中：—试样中黄曲霉毒素（B1、B2、G1或G2）的含量，mg/kg；—试样中黄曲霉毒素B1、B2、G1或G2的含量，mg/L；—空白试验黄曲霉毒素B1、B2、G1或G2的含量，mg/L；—最终甲醇洗脱液体积，mL；—最终净化洗脱液所含的试样质量，g；—试样称取量，g；—样品和提取液总体积，mL；—稀释用样品滤液体积，mL；—稀释液体积，mL；—通过亲和柱的样品提取液体积，mL。

黄曲霉毒素总量为B1、B2、G1、G2个别浓度之和，即B1+B2+G1+G2。

注：计算结果需扣除空白值。

计算结果表示到小数点后2位。

3 免疫亲和层析净化荧光光度法3.1 方法提要试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。

用蒸馏水将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度。

洗脱液通过荧光光度计测定黄曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）总量。

3.2 试剂和溶液3.2.1甲醇（CH3OH）：色谱纯3.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水3.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水3.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水3.2.5 苯：色谱纯不要去掉3.2.6乙腈：色谱纯3.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯3.2.8氯化钠（NaCl）3.2.9磷酸氢二钠（Na2HPO4）3.2.10磷酸二氢钾（KH2PO4）3.2.11氯化钾（KCl）3.2.12 溴溶液储备液（0.01%）：称取适量溴，溶于水，配成0.01%的储备液，4℃避光保存。

3.2.13 溴溶液工作液（0.002%）：取10mL 0.01%的溴溶液加入40mL水混匀，于棕色瓶中保存备用。

需每次使用前配制。

3.2.14 二水硫酸奎宁（C20H24N2O2×H2SO4×2H2O）3.2.15 硫酸溶液（0.05mol/L）：取2.8mL浓硫酸，缓慢加入适量水中，冷却后定容至1000mL。

3.2.16 荧光光度计校准溶液：称取3.40g硫酸奎宁（C20H24N2O2×H2SO4×2H2O）用0.05 mol/L 硫酸溶液稀释至100mL，此溶液荧光光度计读数相当于20 mg/L黄曲霉毒素标准溶液。

3.3 仪器和设备3.3.1 荧光光度计2.3.2 高速均质器：18,000 r/min ~22,000 r/min。

2.3.3 黄曲霉毒素免疫亲和柱。

2.3.4 玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5μm。

2.3.5 玻璃注射器：10 mL，20mL。

2.3.6 玻璃试管：直径12 mm ，长75mm，无荧光特性。

2.3.7 空气压力泵。

3.4 分析步骤3.4.1提取同本标准2.4.1。

黄曲霉素的检测方法及预防措施

２０１９．２０科学技术创新黄曲霉素的检测方法及预防措施陈靖文（四川大学华西公共卫生学院，四川成都610061）黄曲霉素所引起的污染事件频频出现，食品安全已成为当今社会上消费者们关心的热点问题，各类有关部门对食品安全及人体健康问题越发重视。

因此各国对食品及农产品内黄曲霉素含量进行限量设定。

在我国制定出了严格规范的食品中黄曲霉素含量限量标准（ＧＢ－２７６１－２０１１）。

１黄曲霉素的基本概述黄曲霉素（ａｆｌａｔｏｘｉｎ，ＡＦＴ）为毒性极强的剧毒物质，是一种由黄曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓ）、寄生曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）和集峰曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｏｍｉｕｓ）通过聚酮方法产生的次生代谢产物。

已知种类包括：Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ２ａ、Ｍ１、Ｍ２、Ｐ１等十几种。

其中Ｂ１是毒性为最强，根据研究结果中实验数据显示黄曲霉素Ｂ１毒性为氰化钾毒性的１０倍，相当于砒霜毒性的６８倍，其致癌性是奶油黄的９００倍，二甲基亚硝酸铵的７５倍，苯并芘的４０００倍，并且在天然食物中最为常见。

黄曲霉毒素是一种毒性极强的剧毒物质，世界卫生组织（ＷＨＯ）划定为１类致癌物。

黄曲霉素含量标准在３０～５０ｍｇ／ｋｇ为低毒，而５０～１００ｍｇ／ｋｇ为中毒，１００～１０００ｍｇ／ｋｇ为高毒，１０００ｍｇ／ｋｇ以上为极毒。

２黄曲霉素的检测方法２．１薄层分析法（ＴＬＣ）薄层分析法，该方法是测黄曲霉毒素最为经典的方法，在早前的检测中最为常见———是我国黄曲霉素检测的国标方法之一，并且中外检测机构至今仍使用这种方法进行检测。

该方法原理为：在一定条件下，黄曲霉素可以被符合条件并适宜用量的萃取剂从各种不同试样中萃取出来，通过柱层析将被萃取分离出来的黄曲霉素进行净化，在薄板上展开从而进行分离并分析。

利用试样的荧光斑点颜色强弱程度与试样含量呈线性正相关，可与标准品中荧光斑点颜色强弱进行比较从而确定出试样中黄曲霉素的含量（可利用双向展开对组分复杂的试样进行分析），从而提高灵敏度。

黄曲霉M1酶联免疫法检测方法

黄曲霉毒素M1酶联免疫测试1．概述REA GEN ™黄曲霉毒素M1酶联免疫反应测试盒可用于检测乳酪，牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M1的残留。

黄曲霉毒素M1是黄曲霉素素B1羟基化的产物。

黄曲霉毒素已被确认是最常见的致癌物。

该试剂盒特点包括：样品无需前处理提取，可直接用于检测。

应用于牛奶检测时有高灵敏度（0.005ng/g或ppb）低检测限（0.005ng/g或ppb）。

高重现性。

2．试剂盒原理REA GEN ™黄曲霉毒素M1酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联反应原理，相关的抗体已经包被于微孔板上。

药物分析时，样品加入微孔孵育，洗板后加入酶标记物，若样品残留有黄曲霉M1就会竞争包被抗体，抑制HRP酶标与包被抗体结合，加入TMB后显色反应，颜色显色强度与样品中靶毒素的含量成反比。

3.试剂盒组成部分和储存内容物规格保存条件黄曲霉毒素M1包被板(Aflatoxin M1 Plate) 96孔板（12×8 孔）2-8℃黄曲霉毒素M1标准品(Standards)：0ng/ml阴性质控(Negative control)0.005ng/mL0.015ng/mL0.03 ng/mL0.09ng/mL0.27ng/mL回收用10ng/ml(Spiking，可选) 1.8mL1.8mL1.8mL1.8mL1.8mL1.8mL1.8ml2-8℃HRP-酶标记物(HRP-Conjugate) 12mL2-8℃20×浓缩洗液(Wash Solution) 28mL终止液(Stop Buffer) 14mLTMB底物(TMB Substrate) 12mL10x PBS缓冲液（可选）25mL10x 牛奶提取液（可选）5mL本试剂盒应当在2-8℃的温度下储存，有效期为一年。

如果一个月内不使用试剂盒，黄霉素毒素M1标准品和HRP-酶标应置于-20℃或者冷冻保藏。

4.样品检测下限检测物质检测下限（ng/g）牛奶0.005奶粉0.005（按1:10稀释成液体奶）乳酪0.05酸奶0.015.交叉反应数据药物交叉反应率（%）黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1) 100黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1) 46黄曲霉毒素B2(Aflatoxin B2) 35黄曲霉毒素M2(Aflatoxin M2) 29黄曲霉毒素G1(Aflatoxin G1) 27黄曲霉毒素G2(Aflatoxin G2) 66．未提供的设备或材料1)酶标仪(450nm)2)微量加样器(10、20、100和1000μL各一支)3)多道枪：50-300μL4)黄曲霉M1清洗试剂（可选）7.注意事项实验前请阅读以下文字，以保证获得最佳实验效果。

黄曲霉素测定方法

黄曲霉毒素测定法1 简述黄曲霉毒素可以有曲霉菌黄曲霉、寄生曲霉、集封曲霉和伪溜曲霉4种真菌产生，是一组化学结构类素的二呋喃香豆素的衍生化合物，中药在贮藏、制备、运输过程中如保存不当有受潮霉变而污染黄曲霉毒素的可能。

黄曲霉毒素是目前世界上已知的毒性最强的化合物之一，其致癌性肯定。

对中药中黄曲霉毒素残留量进行严格控制对保证药用安全具有重要意义。

本法的基本原理为样品经有机溶剂提取、免疫亲和柱净化后，利用高效液相色谱分离，柱后碘衍生-荧光检测器检测进行分析测定。

2 仪器与用具2.1 高速匀浆机、振荡器2.2 高效液相色谱单元，配荧光检测其（具360nm激发波长和大于420nm发射波长）2.3 柱后衍生系统2.4 离心机2.5 超纯水处理系统2.6 黄曲霉总量（B1、B2、G1、G2）免疫亲和柱2.7 固相萃取装置2.8 离心管，具塞锥形瓶，刻度浓缩瓶，移液管，容量瓶等。

3 试药与试液3.1 甲醇、乙腈均为色谱纯。

3.2 水位高纯水。

3.3 黄曲霉毒素混合对照品。

3.4 0.05%的碘溶液：取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml即得。

4.色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40:18:42）为流动相，流速每分钟0.8m；采用柱后衍生法检测，（1）碘衍生法：衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每分钟0.3ml，衍生化温度70℃；以荧光检测器检测，激发波长λex =360nm，发射波长λem =450nm。

进样量：20~50μl（视灵敏度进行调整）。

按上述条件操作，理论板数以B1计应不低于5000，两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。

5.操作方法5.1 混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混合标准品（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标示浓度分别为1. 0μg/ml、0.3μg/ml、1.0μg/ml、0.3μg/ml、）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。