黄曲霉毒素检验方法

黄曲霉毒素国标检测方法
黄曲霉毒素（AF）是一种由黄曲霉属真菌产生的有毒代谢产物。

它们被广泛分布在食品、饲料和环境中，可能对人类和动物健康造成危害。

因此，对黄曲霉毒素的快速、准确检测成为了保障公众健康的关键。

国家标准委员会制定了黄曲霉毒素国标检测方法，以保证各个检验机构的检测质量和结果一致性。

1. 检测样品的制备
样品制备过程是检测过程的关键步骤。

样品必须被精确称量和混合，以确保最终检测结果的准确性和可重复性。

样品预处理的方法通常包括研磨、切碎、混合和抽样等步骤，具体方法取决于样品的特性，如水分含量、粘度和粒度分布等。

2. 样品提取
样品提取过程中，黄曲霉毒素从样品中被提取到适当的溶剂中。

提取的选择取决于样品的特性和黄曲霉毒素的特性。

一些常见的提取方法包括回收萃取、固相萃取和羧甲基纤维素柱萃取等。

3. 分离和净化
为了获得最终准确的结果，必须分离并净化提取的样品。

对于黄曲霉毒素的分离和纯化方法主要有和阳离子交换树脂和固相萃取等方法。

检测黄曲霉毒素的方法主要包括色谱检测法、酶联免疫检测法、毛细管电泳等方法。

其中酶联免疫检测法已成为广泛使用的检测方法之一。

该方法以特异性抗体为基础，利用抗原抗体相互作用，快速、敏感地检测黄曲霉毒素。

总的来说，黄曲霉毒素国标检测方法是一系列高效准确的方法，可以帮助检验机构检测食品或饲料中的黄曲霉毒素，保证公众健康。

实用标准文案2010版药典黄曲霉毒素检验法（文字版）附录Ⅸ V 黄曲霉毒素测定法本法系用高效液相色谱法(附录ⅥD)侧定药材饮片剂制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉毒B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水(10：18：42)为流动相，流速每分钟0.8ml；采用柱后衍生法检测。

衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加人甲醇100ml使溶解，用谁稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每挣钟0.3ml 衍生化温度70℃；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm(或365nm），发射波长λem=450nm。

两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。

混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混和标准品（黄曲霉毒B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0ug/ml、0.3ug/ml、1.0ug/ml、0.3ug/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。

精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

供试品溶液的制备取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，加氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45um）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲和柱（AflaT-est@P），流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀。

即得。

测定法分别精密吸取上述混和对照品溶液5ul、10ul、15ul、20ul、25ul，诸如液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，另精密吸取上述供试品溶液20-25ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的量，计算，即得。

中国果菜质量控制黄曲霉毒素B1（AFB1）是二氢呋喃氧杂萘邻酮衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮，是已知的化学物质中致癌性最强的一种。

AFB1污染的物质包括食品中的花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等农产品及其加工产品；且以南方高温、高湿地区受污染最为严重。

黄曲霉毒素无臭、无味、无色，在饲料中及其稳定，对家禽、家畜的健康威胁极大，作为饲料强制性卫生监控指标，目前有半定量薄层色谱法[1]、免疫亲和柱净化———高效液相色谱法[2]、免疫亲和荧光光度法[3]、酶联免疫吸附法[4]。

高效液相色谱法虽然灵敏度高，但是样品前处理繁琐，操作复杂；薄层色谱法虽然简便，但是灵敏度差，因此研究能够准确、快速检测饲料中AFB1的检测方法是十分必要且具有现实意义的。

1实验部分1.1材料与试剂甲酸，优级纯；乙腈，色谱纯；超纯水；饲料中黄曲霉毒素B1的检测刘超景赞（乐山市食品药品检验检测中心，四川乐山614000）摘要:采用高效液相色谱串联质谱法对饲料中黄曲霉毒素B1进行检测。

建立了以Inertsil ODS-3为液相色谱柱，以0.1%甲酸水、乙腈（0.1%甲酸）为流动相，质谱使用电喷雾离子源，正离子扫描，以313.0/285.0为定量离子对的LC-MS/MS 检测方法。

结果表明：该方法所测得的黄曲霉毒素B1在0~100.0ng/mL 内具有良好线性，检出限为2.8μg/kg ，加标回收率在93.3%~98.3%。

该方法适合饲料中黄曲霉毒素B1的分析检测。

与传统的薄层色谱、高效液相色谱法相比较，该方法具有分析速度快、操作方便、重现性好、灵敏度高等特点。

关键词:饲料；黄曲霉毒素B1；液质联用中图分类号:TS207文献标志码:A文章编号:1008-1038(2015)12-0025-03Detection of AFB1in FeedLIU ChaoJING Zan(Leshan Food and Drug Inspection and Testing Center,LeShan 614000,China)Abstract:We tested aflatoxin B1in feed with LC -MS/MS method.A method was developed with novel HPLC columnInertsil ODS -3,Mobile phase was 0.1%methanoic acid water,0.1%methanoic acid acetonitrile,combined with MS,which used positive ion scanning,and quantification ion pair was 313.0/285.0.A good linear in 0~100.0ng/mL.detection limit was 2.8μg/kg.Adding standard recovery was 93.3%~98.3%.This method has advantages of being fast,easy,reproducible and relatively sensitive compared with TLC and HPLC.Key words:Feed;AFB1;LC-MS/MS收稿日期:2015-06-26作者简介:刘超（1984—），男，助理工程师，研究方向为食品安全25. All Rights Reserved.中国果菜质量控制AFB1标准品（2μg/mL，农业部环境保护科研所）。

附件3液体乳中黄曲霉毒素M1的快速检测胶体金免疫层析法（KJ201709）1范围本方法规定了牛奶、羊奶、牦牛奶等液体乳中黄曲霉毒素M1的胶体金免疫层析快速检测方法。

本方法适用于生鲜乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳中黄曲霉毒素M1的快速测定。

2原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。

样品中的黄曲霉毒素M1与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。

通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中黄曲霉毒素M1进行定性判定。

3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。

3.1试剂甲醇。

3.2参考物质黄曲霉毒素M1参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度≥90%。

表1 黄曲霉毒素M1参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量注：或等同可溯源物质。

3.3标准溶液的配制3.3.1黄曲霉毒素M1标准储备液（100 μg/mL）：精密称取适量黄曲霉毒素M1标准品（3.2），置于10 mL容量瓶中，用甲醇（3.1）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100 μg/mL的黄曲霉毒素M1标准储备液；或可直接购买黄曲霉毒素M1标准储备液。

-20℃避光保存备用，有效期3个月。

—1—3.3.2黄曲霉毒素M1标准中间液（100 ng/mL）：精密量取黄曲霉毒素M1标准储备液（100 μg/mL）（3.3.1）0.1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇（3.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100 ng/mL 的黄曲霉毒素M1标准中间液。

临用新制。

3.4材料黄曲霉毒素M1胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为液体乳。

3.4.1金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体）。

3.4.2试纸条或检测卡。

4仪器和设备4.1移液器：100 µL、200 µL和500 µL。

分析检测高效液相色谱法检测农产品中黄曲霉毒素B1的含量韩 宇（四川省甘孜藏族自治州食品药品检验所，四川康定 626000）摘 要：目的：建立高效液相色谱法联合免疫磁固相萃取法测定农产品食品中黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）含量的分析方法。

方法：采用70%乙腈溶液提取花生、玉米、大豆、小麦、豌豆和绿豆样品中的AFB1，然后利用免疫磁珠净化、萃取和富集提取液中的AFB1，采用高效液相色谱法进行定量分析。

结果：方法的检出限为0.03～0.92 μg·kg-1，回收率为79.52%～97.53%。

利用该方法对市场上购买的20份花生、玉米、大豆、小麦、豌豆、绿豆样品中的AFB1进行检测，除了玉米和绿豆中未检测出AFB1外，其余实验样品中均检测出一定含量的AFB1。

结论：该方法简便、快速、准确，适用于复杂样品中黄曲霉毒素B1的测定。

关键词：高效液相色谱法；免疫磁固相萃取；黄曲霉毒素B1Determination of Aspergillus Flavus B1 in Agricultural Products by High-Performance Liquid ChromatographyHAN Yu(Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture Institute for Food and Drug Control, Kangding 626000, China)Abstract: Objective: To establish a method for the determination of Aflatoxin B1 (AFB1) in agricultural products by high performance liquid chromatography combined with immunomagnetic solid phase extraction. Method: AFB1 was extracted from samples of peanuts, corn, soybeans, wheat, peas, and mung beans using a 70% acetonitrile solution, and then AFB1 was purified, extracted and enriched by immunomagnetic beads, and quantitative analysis was performed by HPLC. Result: The limits of detection were 0.03～0.92 μg·kg-1, and the recoveries were 79.52%～97.53%. AFB1 in 20 samples of peanut, corn, soybean, wheat, pea and mung bean purchased from the market was detected by this method. AFB1 content was detected in all the other samples except corn and mung bean. Conclusion: The method is simple, rapid, accurate and suitable for the determination of aflatoxin B1 in complex samples.Keywords: high-performance liquid chromatography; immunomagnetic solid-phase extraction; aspergillus flavus B1黄曲霉毒素是一种由黄曲霉菌产生的有毒代谢产物，在自然界中分布广泛，在粮食和饲料等农产品中广泛存在。

2020版药典真菌毒素分析方法验证*方法依据：《中国药典》2020版 第四部 9101 药品质量标准分析方法验证指导原则一 检测限、定量限信噪比法 1. 检测限：取黄曲霉毒素标准品，不断将其稀释（逐级稀释法），按照供试品进样体积进液相色谱检测，直至信噪比为3或略大于3，此时的标准品浓度（单位为μg/mL ），乘以5除以3得到的就是检测限，单位为μg/kg 。

2. 定量限：取黄曲霉毒素标准品，不断将其稀释（逐级稀释法），按照供试品进样体积进液相色谱检测，直至信噪比为10或略大于10，此时的标准品浓度（单位为μg/mL ），乘以5除以得到的就是定量限，单位为μg/kg 。

上述计算方法获得的数据须用含量相近的样品进行验证。

应附测试图谱，说明测试过程和结果。

二 准确度回收率验证： （以黄曲霉毒素为例）称取未检出黄曲霉毒素的样品6份，每份15g ，分别加入75μL 浓度为2.6ppm 的黄曲霉毒素混合标准品，按照2020版药典《通则2351 黄曲霉毒素测定法》进行操作。

回收率计算如下：1．黄曲霉毒素B 1、G 1回收率计算公式：%1005)(-)()(111111⨯=含量样品含量加标样品回收率黄曲霉毒素G B G B G B2．黄曲霉毒素B 2、G 2回收率计算公式：%1005.1)(-)()(222222⨯=含量样品含量加标样品回收率黄曲霉毒素G B G B G B表1 样品中待测定成分含量和回收率限度三 精密度1. 重复性在规定范围内，取同一浓度的供试品，用至少6份的测定结果进行评价。

或设计至少3种不同浓度，每种浓度分别制备至少3份供试品溶液进行测定，用至少9份样品的测定结果进行评价。

2. 中间精密度考查随机变动因素，如不同日期、不同分析人员、不同仪器对精密度的影响，应进行中间精密度试验。

3. 重现性国家药品质量标准采用的分析方法，应进行重现性试验，如通过不同实验室协同检验获得重现性结果。

表2 样品中待测定成分的含量与精密度可接受范围关系。

流动相的梯度变化表（GBT 5009.23-2006 食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定）
标准方法检出限（GBT 23212-2008）
次氯酸钠溶液（消毒用）：
取100g漂白粉，加入500ml水，搅拌均匀。

另将80g工业用碳酸钠（Na2CO3·10H2O）溶于500ml温水中，再将两液混合、搅拌、澄清后过滤。

此滤液含次氯酸浓度约为25g/L。

若用漂粉精制备，则碳酸钠的量可以加倍。

所得溶液的浓度约为50g/L。

污染的玻璃仪器用10g/L次氯酸钠溶液浸泡半天或用50g/L次氯酸钠溶液浸泡片刻后，即可达到去毒效果。

（GBT 5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定）
AFT B1标准溶液配制
1 仪器校正，测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，以求出使用仪器的校正因素f
2 标准溶液配制，配制AFT B1标准溶液，用紫外分光光度计测此溶液最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值，计算AFT B1标准液浓度，后用苯-乙腈混合液调到标准液为10.0ug/ml，并用分光光度计核对浓度。

（GBT 5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定）。