黄曲霉毒素B检测试剂盒操作方法

该操作是根据江苏省苏微微生物产品应用编制的，具体使用请参照产品附带说明书！黄曲霉毒素B1操作流程示意图
1.
；
2.1‐6号孔分别按次序由小到大加入浓度为0‐‐2ppb 标准品溶液各50ul ，剩余孔从7号开始分别加入要测定的样品的稀释液；然后从1号开始的所有孔分别加入50ul 稀释后的酶标抗原溶液，加盖后放入37℃培养箱，进行30分钟温育；
3.孵育完成后，倒掉孔内所有试剂，每孔加入约250ul 洗涤液，洗板5次；
4.5次洗板后拍干酶标孔（拍干后残留的气泡可用吸头戳破），按照先后顺序，所有孔先加入50ul 底物a ，然后所有孔再加入50ul 底物b ，加盖后放入37℃培养箱，进行15分钟温育；
显色反应后每个孔基本都会呈现出不同程度的蓝色，肉眼能明显的看到1‐6号孔的蓝色是由深到浅的（毒素含量越低，蓝色越深；反之亦然。

），样品孔则由于毒素含量的不同，呈现出
显色示意图
5.显色反应完成后，在每个孔中加入50ul 的终止液，蓝色变成黄色，混匀后上450nm 波长的酶标仪读取吸光度值。

黄曲霉毒素B1检测试剂盒操作方法2/50 ppb一、样品的准备/萃取1. 获取具有代表性的样品，使用Romer 系列II型研磨机研磨，使至少95%的研磨样品能够通过20目筛网，彻底混合并对样品进行二次取样。

2. 称取4g 研磨样品于干净并可密封的广口瓶中。

加入20mL 70/30（v/v）甲醇/水萃取溶液并密封广口瓶。

注意：样品与萃取溶液比例应为1：5（w:v），振荡或均质3分钟。

3. 静置样品，用滤纸过滤萃取上清液，收集待检滤液。

4. 用提供的分析缓冲液对滤液进行1：2稀释。

例如，将50μL待检滤液加入50μL分析缓冲液中，混匀准备进行随后检测。

二、检测步骤1．将适量的标记颜色的稀释孔条放入微孔板架上，稀释条孔的数目需使每个标准品（0, 2, 5, 20 & 50ppb）或样品能够对应一个稀释孔。

2．将等量的有抗体包被的微孔条放入微孔板架上，未使用的有抗体包被的微孔条需放回装有干燥剂的原铝箔袋内并密封保存。

3．按照240 μL/孔或2 mL/条的体积计算所需的酶联偶合物用量。

从绿色瓶盖的瓶中量取所需用量的酶联偶合物至一个酶联偶合物试剂槽中（如多道移液器所用的试剂槽）。

使用8道移液枪移取100μL酶联偶合物至每个稀释孔中。

4．使用单道移液枪，移取50μL标准品和样品至已装有100μL酶联偶合物的稀释孔中。

用移液枪反复吸送3次以充分混合孔中液体。

每当移取一个标准品或样品时，单道移液枪必需更换上新吸头。

注意确保最后将吸头中的液体排空。

5．使用换有全新吸头的8道移液枪，快速移取每个稀释孔中的液体各100μL至相应的有抗体包被的微孔中。

室温下放置15分钟。

注意不要摇动微孔板去混匀孔中液体，以免引起孔与孔之间的污染。

6．将孔中的液体甩入水槽中，用去离子水或蒸馏水冲洗每个孔，然后将微孔中的水甩入水槽中。

如此方式反复冲洗5次。

注意在冲洗过程中不要将微孔条从微孔板架上取下，每条微孔条带应被固定在微孔板架上。

黄曲霉毒素B1检测试剂盒使用说明书（酶联免疫法）1 原理及用途本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测谷物、饲料等样品中的黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。

检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的黄曲霉毒素B1和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗黄曲霉毒素B1抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含黄曲霉毒素B1含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中黄曲霉毒素B1的残留量。

2 技术指标2.1 试剂盒灵敏度：0.01ppb(ng/ml)2.2 反应模式：25℃，30min～15min2.3 检测下限：谷物……………………………………0.05ppb配合饲料………………………………0.1ppb食用油、花生…………………………0.2ppb酱类、麦类等饲料……………………0.1ppb啤酒……………………………………0.1ppb葡萄酒、酱油、醋……………………0.05ppb2.4 交叉反应率：黄曲霉毒素B1…………………………100%2.5 样本回收率：谷物及配合饲料……………………85%±15%花生…………………………………82±15%食用油………………………………85±15%酱类、麦类等饲料………………83±15%啤酒………………………………84±15%葡萄酒、酱油、醋………………87±15%3 试剂盒组成酶标板……………………………96孔标准液（黑盖）：各1ml0ppb、0.01ppb、0.03ppb、0.09ppb、0.27ppb、0.81ppb高标准液：100ppb…………………1ml酶标记物（红盖）…………………5.5ml抗体工作液（蓝盖）………………5.5ml底物液A（白盖）……………………6ml底物液B（黑盖）……………………6ml终止液（黄盖）………………………6ml20X浓缩洗涤液（白盖）……………40ml说明书………………………………1份4 需要的器材和试剂4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）4.2 微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl4.3 试剂：甲醇、正己烷、三氯甲烷或二氯甲烷5 样本前处理5.1 样本处理前须知：实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。

黄曲霉毒素 B1酶联免疫检测试剂盒使用说明书Ⅰ．样品处理方法一、食品1、脂肪含量小的固体样品（如大米、玉米、小米等）称取5.0g样品（已粉碎）于100ml具塞三角瓶中，准确加入25.0ml甲醇水（1+1）溶液，振摇15min，过滤，弃去1/4初滤液，收集试样滤液，根据样品的国家允许量标准，用A试剂将滤液进行稀释（见表1：样品稀释表）。

将样品稀释液进行定量或限量测定。

2、酱油、醋称取5.0g样品于25ml小烧杯中，用5ml蒸馏水将试样转移到125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。

放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水Na2SO4过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。

挥干冷却后，准确加入25.0ml 甲醇水（1+1），将蒸发皿中的凝结物充分溶解。

根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释（见表1：样品稀释表）。

将样品稀释液进行定量或限量测定。

3、食用油（如菜油、麻油、色拉油、花生油等）称5.0g油样于25ml小烧杯中，用20ml石油醚或正乙烷分次将试样转移至125ml分液漏斗中，准确加入25.0ml甲醇水（1+1）溶液，加塞轻轻振摇5min，静置分层，放出下层甲醇水提取液。

根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释（见表1：样品稀释表）。

将样品稀释液进行定量或限量测定。

4、葡萄酒准备称取5.0g葡萄酒于125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。

放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的的无水Na2SO4过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中， 65℃水浴通风挥干。

黄曲霉毒素B1 ELISA快速检测试剂盒【产品概述】黄曲霉毒素是一类真菌（如黄曲霉和寄生曲霉）的有毒的代谢产物，它们具有很强的致癌性。

主要存在于谷物、坚果、棉籽以及一些和人类血液、动物饲料相关的产品中。

天然污染的黄曲霉毒素以AFB1为主。

1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织的癌症研究机构划定为类致癌物，是一类毒性极强的剧毒物质。

它被证明对人和动物的肝脏、肾脏等组织和器官具有很大的危害。

产生黄曲霉毒素的霉菌（如黄曲霉、寄生曲霉等）遍及世界各地，黄曲霉的污染可以发生在植物的生长、收获和加工、储藏、运输等过程中、及时发现污染源是最好的预防黄曲霉毒素污染的方法。

【产品原理】本产品是利用免疫竞争法检测原理建立的一种定量检测试剂盒。

具有简单、快速，无需特殊的仪器设备，既可以在实验室进行，也可在农场、饲料混合车间等实地进行测定。

结果准确，灵敏度度为0.05ppb，准确率大于95% 。

适用于谷物、饲料等样板中的黄曲霉毒素的检测。

【产品特性】1）试剂盒灵敏度: 0.05ppb2）试剂盒变异系数：小于20%。

3）试剂盒准确度：回收率范围在80％-110％之间。

【试剂盒组成】1）包被有抗原的96微孔板：1块（96 孔，12 条×8 孔）2）黄曲霉标准品：0 ppb 、0.05 ppb、0.12 ppb、0.25 ppb、0.5ppb、1 .0 ppb、2.0ppb1 瓶× 1.0ml3）200×黄曲霉抗体浓缩液： 1 瓶× 0.25ml4）60×酶标二抗浓缩液： 1 瓶× 0.25ml5）10×浓缩洗涤液： 1 瓶× 50ml6）稀释缓冲液： 2 瓶×40ml7）显色底物液 1 瓶×7ml8）反应终止液： 1 瓶× 7ml9) 试剂盒说明书【仪器试剂】仪器—酶标仪450nm—过滤漏斗—微量移液器20μl～200μl，100μl～1000μl—刻度移液管—天平：感量0.01g—50ml离心管或25ml锥形瓶—定性滤纸试剂—甲醇—蒸馏水【样本的前期处理】1. 玉米、花生等谷物----称取10g样品，加入20ml样品提取液（每100ml中含60ml甲醇，40ml蒸馏水），剧烈振荡3分钟（用手或振荡器）----将提取液用普通滤纸过滤，用稀释缓冲液按1：9的比例稀释过滤液（吸取100u过滤液，加入900ul稀释液缓冲液）样本稀释倍数为20倍2. 饲料（1）普通饲料----称取5g样品，加入25ml样品提取液（每100ml中含60ml甲醇，40ml蒸馏水），剧烈振荡3分钟（用手或振荡器）----将提取液用普通滤纸过滤，用稀释缓冲液按1：9的比例稀释过滤液（吸取100u过滤液，加入900ul稀释液缓冲液）样本稀释倍数为50倍（2）浓缩饲料----称取5g样品，加入25ml样品提取液（每100ml中含60ml甲醇，40ml蒸馏水），剧烈振荡3分钟（用手或振荡器）----将提取液用普通滤纸过滤，取2ml滤液，加入3ml三氯甲烷，振荡1分钟，静置1分钟，3500rpm离心5分钟。

黄曲霉毒素B1酶免检测试剂盒操作规程一、样品前处理1、稻谷：称取5 g待测样品（已粉碎）于100 mL具塞三角瓶中，准确加入25.0 mL甲醇水（1+1）溶液，加塞振荡30 min，静置后，用移液器取上层清液50 μL于反应孔中。

2、油：称取5 g油样于于100 mL具塞三角瓶中，准确加入25.0 mL甲醇水（1+1）溶液，和25 mL石油醚，加塞振荡30 min，静置后，用移液器取下层清液50 μL于反应孔中。

二、检测1、反应孔编号：取相应的包被反应条放在框架上，反应条横放，设定1～6号孔为AFB1 标准对照孔，其余孔为样品孔。

2、空白：在7号空白反应孔中加入50 μL酶标抗原稀释缓冲液。

3、AFB1标准对照：在1～6号孔中分别准确加入50 μL AFB1标准溶液（0、0.1、0.25、0.5、1、2ppb）。

4、样品检测：在8号孔以后（包括8号孔）的反应孔中准确加入50 μL待测样品提取液。

5、加酶标抗原：各孔均准确加入50μL酶标抗原溶液。

6、试剂混匀：轻轻振摇或敲击酶标板框架，使反应孔的试剂充分混匀。

（注意：试剂不得溅出、不得交叉滴加、不同试剂必须更换吸头）7、孵育：将反应板盖上盖子，放入37 ℃培养箱中孵育30 min。

（时间必须够）8、洗板：取出反应板，用力甩干3下，并在吸水纸上拍干3下，然后往每孔加入250 μL（5滴左右）洗涤液，放置2 min，用力甩干3下，并在吸水纸上拍干3下。

重复洗涤4次。

9、显色：反应板拍干后，每孔准确加入50 μL底物液和显色液。

轻轻振摇或敲击酶标板框架，使反应孔的试剂充分混匀。

将反应板盖上盖子，放入37 ℃培养箱中孵育15 min。

10、终止反应：取出反应板，每孔准确加入50 μL终止液。

轻轻振摇或敲击酶标板框架，使反应孔的试剂充分混匀。

11、仪器读数：放入450 nm酶标仪中读取各孔的吸光值。

（在30 min内完成，动作要快）。

1 适用范围本方法适用于测定全价饲料及脂肪含量小的固体原料（如玉米、玉米副产物等）。

2 操作方法1 样品处理：称取5.0g粉碎后的样品于具塞三角瓶中，准确加入25.0毫升甲醇水（1+1）溶液，（现配现用）。

振摇15分钟过滤，收集试样滤液，此液为样品提取液。

根据样品的国家标准允许量标准，用A试剂（样品稀释液）将样品提取液进行适当稀释，玉米一般将提取液稀释10倍（取滤液50uL+450uLA试剂），全价料滤液一般稀释4倍（取滤液50uL+150uLA试剂）稀释后放在混匀器上混匀，即为待测样液。

2、试剂的配制：每瓶C试剂准确加入1.5毫升D试剂（用移液枪移两个750uL）。

配成实验用酶标抗原溶液；取一瓶E试剂（浓缩洗涤液）加入300毫升蒸馏水中，配成洗涤液待用，均在2—8℃保存。

3、试剂平衡：将测试盒于室温中放置15分钟以上，平衡至室温。

4、小孔编号：根据实验需要截取相当孔数放置反应板框架上，设定一号孔为仪器调零孔（空白孔），2号孔为阴性对照孔，3号孔为阳性对照孔，其余孔为样品孔。

5、洗板（激活抗原）：每孔加入250uL洗涤液，洗涤液不得溢出，放置1分钟后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干（注意：不能在同一张纸上重复多次拍打），重复洗板一次，放置、甩掉、拍干。

6、加样：第1步：第一个孔加50uLA稀释剂，第二个加50uLB试剂（0.1AFB1标准溶液），第三个孔加50 uLB试剂（1 AFB1标准溶液），其余孔加入相应待测样液。

第2步：1号孔加入50uLD试剂，从第2个孔开始加50uLC试剂，加完轻轻摇下，在37℃培养箱中培养半个小时，最好用书包着避光。

半个小时后，洗板，甩掉反应液，拍干。

每孔加入250洗涤液后，放置两分钟，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，再重复洗涤4次。

第3步：显色：每孔分别加入50uL F试剂（显色液）和50uL G试剂（显色液），摇匀，将反应板放入37℃恒温培养箱中显色15分钟（可以F和G混合加100uL，现用现配）。

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一、样品前处理方法
1、花生
样品去皮粉碎(刀切或剪切)，称取5.0g于100mL具塞三角瓶中。

加入25.0mL甲醇水(1+1)溶液和20mL正已烷(或石油醚)，振摇l5min，过滤于分液漏斗中，静置分层，放出下层甲醇水提取液，用样品稀释液（A试剂)将提取液稀释3倍（例如取0.5ml提取液+1.5ml样品稀释液），即为待测样液。

将待测样液进行定量或限量测定。

2、核桃
样品粉碎，称取5.0g于100mL具塞三角瓶中。

加入25.0mL甲醇水(1+1)溶液和20mL正已烷(或石油醚)，振摇l5min，过滤于分液漏斗中，静置分层，放出下层甲醇水提取液，用样品稀释液（A试剂)将提取液稀释1倍（例如取0.5ml提取液+ 0.5ml样品稀释液），即为待测样液。

将待测样液进行定量或限量测定。

3、牛奶
将含脂牛奶降温至10℃以下，3500转/min下离心10min，用吸管弃去上层脂肪层，取下层牛奶液用样品稀释液（A试剂）稀释4倍（例如取0.5ml提取液+ 2.0ml样品稀释液即为待测液。

4、奶粉
上海佑隆生物科技有限公司
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称取5g奶粉于100ml三角瓶中，加入40ml蒸馏水，振摇5min，使其完全溶解。

将（含脂）牛奶降温至10℃以下，3500转/min下离心10min，用吸管弃去上层脂肪层，取下层牛奶液用样品稀释液（A 试剂）稀释4倍（例如取0.5ml提取液+ 2.0ml样品稀释液即为待测液。

二、操作步骤
上海佑隆生物科技有限公司。

黄曲霉素B1检测卡说明书(完整版)-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN黄曲霉毒素B1 检测卡说明书【简介】黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株所产生的有毒代谢产物，最主要的4种分别为：B1、B2、G1、G2。

黄曲霉毒素具有很强的急性毒性，也有明显的慢性毒性及强致癌性。

黄曲霉毒素主要污染粮、油及其制品，其中受污染最严重的是花生、棉籽、玉米及其制品；其次是稻米、小麦、大麦、高粱、芝麻、茶叶等。

鉴于这些霉菌毒素的毒性，欧盟国家规定，黄曲霉毒素B1的残留限量值为5ppb。

【检测原理】该试剂盒采用免疫竞争法分析原理结合胶体金标记技术进行检测。

【检测范围】花生、玉米、小麦、大米、茶叶、油脂、饲料等；【产品组成】黄曲霉毒素B1免疫胶体金快速检测卡(40份/盒)滴管（40支）干燥剂（40片）一次性手套（5只）【技术指标】检测下限：5μg／kg；【检测步骤】1．取5g以上有代表性的粉碎后的谷物样品（过20目筛），准确称取0.5g均匀粉碎试样，加入到配套的15ml离心管中。

2．向离心管中准确加入纯净水和乙酸乙酯各2mL，将瓶塞盖紧密封，用力振荡5分钟，4000rpm离心1分钟（备注：如实验室没有大离心机设备，可以用小离心管取1.5ml上清液，用小离心机离心）。

3．用吸管取0.6mL上清液到小玻璃杯中，吹干滤液（吹风机或烘箱），然后用0.3ml体积稀释液复溶杯底固体。

此溶解液即为检测液.4．取出试纸，开封后平放在桌面，用滴管向试纸孔缓慢而准确地逐滴加入3滴检测液。

5．5~10分钟判断结果，半小时后的结果判读无效。

【结果判断】1、阴性:测试线(T)与对照线(C)都出现，表明样品中黄曲霉毒素的浓度小于5ug／kg。

2、阳性:只有对照线(C),无测试线(T)，表明样品中黄曲霉毒素的浓度大于或等于5μg／kg。

3、无效:对照线(C)和测试线(T)都不出现，或者对照线（C）不出现。

【注意事项】1、本产品在2～30℃密封干燥保存；忌冷冻；检测卡保存期18个月；2、在环境温度15～37℃下操作；检测卡极易受潮，打开小包装后应立即使用；3、乙酸乙酯为易挥发液体，保存为12个月，不用时要盖紧瓶塞；。

曲霉毒素B1〔AFB1〕酶联免疫定量检测试剂盒使用说明本测试盒用间接竞争免疫分析法定量测定谷物中AFB1。

该测试盒反响孔可拆卸，可测单份样品，也可测多份样品。

定量分析时需有含450nm 波长的微孔板酶标仪。

1 概要:黄曲霉毒素是由曲霉菌属的黄曲霉和寄生曲霉等产生的次级代谢产物，主要污染玉米、花生、坚果等。

天然污染的黄曲霉毒素以AFB1 主，AFB1 于强烈致癌物质，肝脏是其主要的靶器官，具有极强的急性毒性和致癌性。

AFB1测方法主要有薄层色谱法〔TLC〕、高效液相色谱法〔H 处测定OD值。

3 提供的物品微孔板：包被有AFB1-BSA 5个浓度的AFB1标准溶液〔各〕标准1：0ng/mL直接使用标准2：mL直接使用标准3：mL直接使用标准4：mL直接使用标准5：mL直接使用抗AF B1 单克隆抗体溶液〔6mL〕直接使用酶标物〔12mL〕直接使用显色液〔12mL〕直接使用终止液〔6mL〕直接使用浓缩洗液〔30mL〕稀释使用4 盒中未提供，需自备物品微孔板酶标仪〔可于450nm处测定〕、振荡器、粉碎机、微量移液器、量筒、漏斗、容量瓶、快速定性滤纸；氯化钠〔分析纯〕、甲醇〔分析纯〕、去离子水或蒸馏水。

5 操作者考前须知标准溶液中含有黄曲霉毒素，应特别小心。

使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素溶液最好用in内。

孵育过程中应避光。

不要使用过期试剂盒。

不要交叉使用不同批号的试剂盒中的试剂。

6 储存条件保存试剂盒于2~8℃。

不要冷冻。

显色液对光敏感，因此要防止直接暴露在光线下。

将不用的微孔板放进原铝箔袋中，置2~8℃保存。

7 试剂变质的标志标准1的吸光度值小于个单位〔A450nm<〕时，表示试剂可能变质。

8样品处理样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存。

取5g粉碎的有代表性的样品，加氯化钠及25mL70%甲醇-水溶液。

强力振荡3分钟。

用快速定性滤纸过滤。

取1mL滤液，加水4mL进行稀释。

取50μL稀释液进行分析。

根据需要可以增减样品量，但甲醇-水溶液的量也应相应增减。