医学免疫学实验指导
实验二白细胞的吞噬及溶菌酶试验用由长沙达尔锋生物科技有限公司整理
【文章介绍】实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。BioRike博瑞克系统的介绍了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。
BioRike简介：BioRike（中文简称“博瑞克”）是长沙达尔锋生物科技有限公司旗下的产品品牌,由旗下专业的生命科学实验室BioRike博瑞克研发和生产。BioRike是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技实验室，专门从事以Elisa试剂盒、抗体、细胞因子、免疫检测试剂盒等免疫学产品为主的生物试剂的研发与销售。
【实验目的】
1.熟悉白细胞的吞噬及溶菌酶试验的原理和方法。
2.通过本实验理解机体的非特异性免疫机制。
【实验原理】
机体内具有吞噬功能的细胞大致分为两大类，即小吞噬细胞和大吞噬细胞。小吞噬细胞一般指血液中的中性粒细胞，大吞噬细胞则是存在于组织中的巨噬细胞和血液中的大单核细胞。它们构成机体天然防御机能。本实验通过体外或动物体内的细胞吞噬及溶菌酶试验，以证实机体的非特异性免疫机制。
【实验用品】
1.器材：显微镜、载玻片、厚凹玻片、接种环、采血针、滴管、湿盒、恒温培养箱、注射器、针头、打孔器、平皿、酒精灯、火柴。
2.材料、试剂：
3.8％枸橼酸钠、2％碘酒、75％酒精、瑞氏染液、蒸馏水、6％可溶性淀粉、1％鸡红细胞悬液、溶壁微球菌(100mg／m1)、l／15mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.4)、琼脂、标准溶菌酶(100ug／m1)、新鲜鸡蛋清(1:10)、生理盐水、香柏油。
3.菌种：白色葡萄球菌24小时斜面培养物。
4.动物：小白鼠
【内容和方法】
一、小吞噬试验(中性粒细胞吞噬功能试验)
1.方法
(1)取厚凹玻片一片，在凹孔中用滴管加入一滴3.8％枸橼酸钠溶液。
(2)依次用碘酒、酒精消毒手指或耳垂及采血针后，从消毒部位采取三大滴血加入凹孔中混匀。
(3)将接种环烧灼灭菌后，刮取少许白色葡萄球菌置于凹孔血液中搅匀。
(4)将上述凹玻片放人湿盒，于37℃温箱中作用45分钟，注意每15分钟混匀一次。
(5)取出凹玻片，用烧灼灭菌的接种环将凹孔中血液搅匀后取血3—4环于载玻片上，用另一载玻片推成薄血片。接种环烧灼灭菌后放回原处。
(6)待血片自干后，用瑞氏染液染色。用吸管取瑞氏染液数滴滴于上述血片上先染1分
钟。然后加等量缓冲液，轻轻晃动混匀，继续染5分钟后水洗，用吸水纸吸干后镜检。
2.结果分析
油镜检查，先寻找白血球，观察胞浆中有无吞噬的细菌。如结果正确可见染成紫色的细胞核及被吞噬的细菌，细胞桨则为淡红色。
随机计数100个中性白细胞，记录发生吞噬和未发生吞噬的白细胞数，计数吞噬细胞百分率。
二、大吞噬试验
1.试剂配制
(1)6％可溶性淀粉肉汤：取肉汤培养基100ml，加入可溶性淀粉6g，混匀后煮沸灭菌，冷却后置4℃冰箱保存(只能保存一周)。使用时37℃水浴溶解。
(2)1％鸡红细胞悬液：取肝素抗凝鸡血1m1，加生理盐水99ml混合。
2.方法
(1)试验前3天，于小白鼠腹腔内注射6％可溶性淀粉肉汤lml(注射时切勿刺伤内脏)。
(2)试验当天，于每只小白鼠腹腔内注射1％鸡红细胞悬液lml并轻揉腹部。
(3)注射后30分钟，用注射器吸取腹腔液少许，置于洁净载玻片上，推成涂片、晾干。用瑞氏染液染色。
(4)油镜观察小白鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞现象(鸡红细胞为有核红细胞)，并计算吞噬细胞的百分率。
瑞(Wright)氏染液：瑞氏染粉0.1g，甲醇60ml，先将染粉置研钵内加少量甲醇研磨，然后加入全部甲醇。配好的染液要装瓶塞紧，置二周后使用。
三、溶菌酶测定
1.试剂配制
(1)溶壁微球菌菌液的制备：菌种于使用前先在琼脂斜面上传代一次，然后接种于琼脂斜面培养基中，37℃培养24小时后收集菌苔，称重、用pH6.4磷酸盐缓冲液配成100mg／ml菌液。经70℃水浴l小时杀菌，放置4℃冰箱备用。
(2)pH6.4 1／15mol/L磷酸盐缓冲液(沙伦生PBS)：甲液：无水Na2HPO49．46g溶于1000ml 蒸馏水。乙液：无水KH2PO4 9．078g溶于1000ml蒸馏水。然后取甲液27ml，乙液73ml，加NaCl 0.5g即成。
2.方法及结果
(1)将1％磷酸盐缓冲液琼脂100rnl加热溶化，待冷至50—60℃时加入微球菌菌液1m1(每m1琼脂内含标准溶壁微球菌1mg)混和均匀，注入无菌平皿，每个平皿15ml。
(2)琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板上打4个孔，孔径5mm，孔距相等。
(3)用1 m1注射器吸取唾液(由实验者收集自己的唾液于洁净平皿中取下层清液使用)，加入琼脂孔内，以注满为度。同时以标准溶菌酶、鸡蛋清作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照，分别作好标记。
(4)将平皿置于实验台上于室温中过夜，第二天观察琼脂孔周围的溶菌环。根据溶菌环直径的大小比较唾液及二个阳性对照的实验结果，分析试剂中溶菌酶的含量。
【注意事项】
1.小吞噬实验中要掌握好抗凝剂与血液的比例，否则会使红细胞及白细胞破坏，影响结果的观察。
2.大吞噬实验时使用小白鼠处于直立姿势有利于腹腔渗出液的抽取。
3.溶菌酶实验中应注意无菌操作，否则杂菌生长会影响溶菌环的观察。
【实验报告与思考题】
1.在吞噬细胞中发现细菌时，如何区别吞噬的细菌和粘附在吞噬细胞表面的细菌?
2.简述机体非特异性免疫的概念及特点?
