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中性粒细胞吞噬实验报告中性粒细胞吞噬实验报告细胞是生命的基本单位，它们在体内发挥着各种重要的功能。
其中，中性粒细胞是一类重要的白细胞，它们在机体的免疫防御中起着至关重要的作用。
为了更好地了解中性粒细胞的功能，我们进行了一项中性粒细胞吞噬实验。
实验目的：通过观察中性粒细胞对细菌的吞噬过程，探究中性粒细胞的吞噬能力以及其在免疫防御中的作用。
实验材料：1. 中性粒细胞培养液2. 细菌培养液3. 显微镜4. 培养皿5. 移液器6. 培养箱实验步骤：1. 准备中性粒细胞培养液和细菌培养液。
2. 取一块无菌培养皿，使用移液器将中性粒细胞培养液滴在培养皿中。
3. 添加适量的细菌培养液到培养皿中，使细菌均匀分布。
4. 将培养皿放入预热的培养箱中，以37摄氏度恒温培养。
5. 在各个时间点，取出培养皿，用显微镜观察中性粒细胞的吞噬情况。
6. 记录观察结果，并进行数据分析。
实验结果：经过观察，我们发现中性粒细胞对细菌的吞噬能力非常强大。
在实验开始的几分钟内，中性粒细胞迅速聚集到细菌附近，并开始将细菌吞入细胞内部。
随着时间的推移，越来越多的细菌被吞噬，中性粒细胞的数量也逐渐增加。
在实验结束时，几乎所有的细菌都被中性粒细胞吞噬。
实验分析：中性粒细胞的吞噬能力是机体免疫防御的重要组成部分。
通过吞噬细菌和其他病原微生物，中性粒细胞能够清除体内的病原体，维护机体的健康。
在实验中，我们观察到中性粒细胞对细菌的迅速吞噬过程，这证实了中性粒细胞在免疫防御中的重要作用。
中性粒细胞的吞噬过程是一个复杂的生物学过程，其中涉及到多种细胞因子和信号分子的调控。
这些因子和分子能够引导中性粒细胞朝向病原体，并促使细胞对其进行吞噬。
在实验中，我们没有对这些调控因子进行深入研究，但可以肯定的是，它们在中性粒细胞吞噬过程中发挥着重要的作用。
此外，中性粒细胞的吞噬能力也受到多种因素的影响。
例如，炎症反应和免疫系统的激活可以增强中性粒细胞的吞噬能力。
而某些疾病和病理状态则可能导致中性粒细胞吞噬功能的下降。
医学免疫学实验指导（供医学、药学各专业使用）主编：刘彦平编委：邵嘉会陆东明李萍高翔青海大学医学院病原生物学与免疫学教研室2008年10月医学免疫学是医学院校必设的基础课程之一，按教学大纲要求医学免疫学的实验课时占总学时的1/3左右，说明该学科具有理论与实践紧密结合的特点及实验教学在学科中的重要性。
本课程设置要求学生不仅要掌握基础理论、基本知识，而且要学习和掌握各项基本技能。
据此，我们编写出《医学免疫学实验指导》一书，力求规范实验教学，从整体提高教学水平和教学质量。
本书结合教学工作实际，共编写14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，并附有一定量的思考题。
本书依教学进程安排实验次序，可帮助学生巩固基础理论知识，培养学生基本技能，提高教学效果。
免疫学和免疫学技术的发展日新月异，医学教育的改革不断向纵深发展，限于编者的学术及认识水平，本书难免存在缺点和不足。
为此，希望广大师生对本书提出宝贵意见，以便及时加以改进。
编者2008年10月实验室规则 (4)实验一显微镜的结构与使用 (4)实验二白细胞的吞噬及溶菌酶试验 (7)一、小吞噬试验(中性粒细胞吞噬功能试验) (8)二、大吞噬试验 (8)三、溶菌酶测定 (9)实验三巨噬细胞（白细胞）移动抑制试验 (9)实验四硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验 (11)实验五凝集反应 (12)一、玻片凝集试验 (12)二、人类ABO 血型鉴定试验（玻片法） (13)三、试管凝集反应 (14)四、间接凝集试验 (15)五、间接乳胶凝集抑制试验 (16)实验六沉淀反应 (17)一、琼脂扩散试验 (18)二、免疫电泳 (20)三、火箭免疫电泳 (20)四、对流免疫电泳 (22)实验七补体的溶细胞作用 (23)实验八补体结合试验 (24)一、溶血素单位滴定 (24)二、补体单位滴定 (24)实验九血清补体活性测定 (27)实验十淋巴细胞转换试验 (29)实验十一玫瑰花环形成试验 (31)实验十二变态反应试验 (32)一、豚鼠过敏试验 (33)二、皮肤超敏反应 (33)实验十三免疫浊度试验 (34)实验十四循环免疫复合物的检测 (35)实验十五免疫标记技术 (37)一、酶联免疫吸附试验 (37)二、酶免疫组化技术 (38)三、酶标免疫定量测定 (40)四、免疫荧光技术 (41)五、斑点金免疫渗滤试验 (43)六、斑点免疫层析试验 (44)实验室规则实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段，为保证实验效果，同时避免病原微生物的实验室内传染，保障实验操作者的安全，特制定如下规则：一、学生在实验课前，应认真预习所要进行实验的内容，明确实验目的，了解实验原理，熟悉所要使用的仪器、药品的性质及操作程序，如有疑问，应事先请教指导教师。
一、实验目的1. 了解中性粒细胞吞噬功能的实验原理和方法。
2. 观察中性粒细胞对细菌、红细胞等颗粒的吞噬现象。
3. 评估中性粒细胞的吞噬能力。
二、实验原理中性粒细胞是人体免疫系统中重要的吞噬细胞，具有吞噬和杀灭病原体的功能。
吞噬过程包括趋化、调理、吞入和杀菌等步骤。
在本实验中，通过观察中性粒细胞对细菌、红细胞的吞噬现象，评估其吞噬能力。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠2. 实验试剂：中性粒细胞分离试剂盒、细菌、红细胞、细胞培养液、抗生素等3. 实验仪器：显微镜、离心机、培养箱等四、实验方法1. 中性粒细胞分离：取小鼠血液，按照中性粒细胞分离试剂盒说明书进行分离。
2. 细菌培养：将细菌接种于细胞培养液，在培养箱中培养至对数生长期。
3. 红细胞制备：将红细胞洗涤、染色，制成红细胞悬液。
4. 吞噬实验：a. 将分离出的中性粒细胞用细胞培养液洗涤后，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。
b. 将中性粒细胞与细菌、红细胞悬液混合，在培养箱中培养一段时间。
c. 收集细胞，用抗生素处理，去除未被吞噬的细菌。
d. 将细胞涂片，进行染色和显微镜观察。
五、实验结果1. 在显微镜下观察，可见中性粒细胞对细菌、红细胞具有明显的吞噬现象。
2. 吞噬细菌的中性粒细胞数量较多，吞噬红细胞的数量较少。
3. 部分中性粒细胞吞噬细菌后，细胞内出现细菌残体。
六、实验分析1. 本实验结果表明，中性粒细胞具有吞噬细菌、红细胞的能力，表明其在免疫防御中发挥重要作用。
2. 吞噬细菌的中性粒细胞数量较多，说明中性粒细胞对细菌的吞噬能力较强。
3. 吞噬红细胞的数量较少，可能与红细胞的结构和表面特性有关。
七、实验结论1. 中性粒细胞具有吞噬细菌、红细胞的能力，在免疫防御中发挥重要作用。
2. 中性粒细胞对细菌的吞噬能力较强，对红细胞的吞噬能力较弱。
八、实验讨论1. 吞噬实验是评估中性粒细胞吞噬能力的重要方法，但实验结果受多种因素影响，如实验动物、试剂、操作等。
实验八溶菌酶的测定溶菌酶（lysozyme）主要是由吞噬细胞合成并分泌的一种小分子粘性蛋白，属乙酰多糖酶。
存在于唾液、乳汁、泪液和鼻及气管等分泌物中，能溶解革兰氏阳性细菌。
由于它的高等电点（pH11.0），使它能与细菌牢固结合，并水解细菌细胞壁肽聚糖，使细菌裂解死亡。
本实验在平板上进行唾液酶的测定。
溶菌酶与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作用后，可使该菌因细胞壁破坏而溶解，致使琼脂板加样孔周围出现溶菌环。
溶菌环直径与样品中溶菌酶含量的对数呈直线关系。
【材料】1. 无菌PBS（pH6.4，1/15mol/L），5mol/LKOH，3%PBS 琼脂，溶菌酶标准品，受验者唾液。
2. 枯草芽孢杆菌12 小时培养物。
3. 10×100 试管，试管架，无菌平皿，打孔器，微量加样器。
4. 分光光度计，水浴箱，温箱等。
【方法】1. 菌液配制：将PBS 加入枯草芽孢杆菌斜面，置室温5-10 分钟后制成菌悬液；在波长640nm处，测定菌悬液的浓度，并将菌液浓度调至透光率30-40%。
2. 溶菌酶标准液配制：称取溶菌酶标准品，用PBS 配成1000μg/ml，置冰箱冻存，临用时再稀释成100、50、25 和10μg/ml。
3. 收集唾液标本：待检测者用清水漱口后，将唾液收集于灭菌平皿内待用。
4. 加热融化3%琼脂，冷至60-70¡æ，与预热好的枯草芽孢杆菌菌悬液等体积混合，倒平板。
用打孔器在平板上打孔，孔间距约1.5cm，每平板可打孔8-9 个。
5. 各孔内依次加溶菌酶标准品和唾液样品，每孔20μl。
6. 置于24-26℃ 12 -18 小时后测量溶菌环直径。
【结果判断】记录溶菌环的直径（mm）于下表，绘制标准曲线，并从标准曲线上查出所测样品的溶菌酶含量。
溶菌酶标准品唾液样品1 2 3 4 5 6 7 8溶菌环直径（mm）【作业】1. 记录标准溶菌酶样品的溶菌环直径，绘制标准曲线。
《病原生物学和免疫学》实验教学大纲课程编号: 40921105课程类别: 专业基础课实验学时: 26学时学分: 1.5适用专业: 护理学本科一、实验教学目的和任务《病原生物学和免疫学》实验是为了使学生牢固掌握病原生物学和免疫学的基本方法与实验技术；加深学生对病原生物学和免疫学基本理论的理解；同时通过实验, 培养学生观察问题、提出问题、分析问题和解决问题的能力；培养学生实事求是、严谨踏实的科学态度和良好作风, 以及敢于创新的开拓精神；也为学生进一步深入学习其他医学相关学科奠定基础。
二、实验教学基本要求1.每次实验前必须充分预习实验内容, 明确实验目的、原理、方法以及操作中的注意事项,保持思路清晰。
2.在实验过程中, 应持严肃认真的科学态度, 并要注意合理地分配和利用时间。
3.认真及时做好实验记录, 对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验, 则需要记下每次观察的现象和结果, 以便分析。
4、在微生物学的整个实验过程中, 应严格加强“无菌观念”的培养和训练。
5、每次的实验结果, 应以实是求实的科学态度填入实验报告, 力求简明准确, 并及时汇交教师批阅。
如实验结果与理论不符, 应分析原因, 训练科学思维的能力。
三、实验教学内容实验项目一1.实验项目名称: 溶菌酶的溶菌试验2、实验内容提要:（1）制备含溶壁微球菌的琼脂平板。
（2）打孔凝固后, 用打孔器打孔, 孔间距1.5－2cm。
（3）加样周围四孔分别加入5.25.100、500μg溶菌酶标准品。
（4）结果观察各孔周围溶菌情况, 测量溶菌环直径。
实验项目二1.实验项目名称: 白细胞吞噬试验2、实验内容提要:（1）吸取肝素加于凹玻片内。
（2）取耳垂血0.04ml, 放在有肝素的凹玻片内, 摇匀。
（3）取葡萄球菌培养液0.02ml加于有抗凝血的凹玻片内, 摇匀。
（4）将凹玻片直于湿盒中, 37℃30分钟, 每10分钟摇匀一次。
（5）取一滴全血菌液混合液, 置载玻片上, 推片, 待干。
第四章白细胞检验的基本方法第一节白细胞功能的检验一、墨汁吞噬试验【目的】掌握墨汁吞噬试验的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】墨汁吞噬试验（ink phagocytosis test）是依据血液中的中性粒细胞及单核细胞对细菌、异物等具有吞噬作用，在一定量的肝素抗凝血中，加入一定量的墨汁，经37℃温育4h，涂片染色后，在显微镜下观察吞噬细胞对墨汁的吞噬情况，并计算吞噬率及吞噬指数，从而协助急性白血病的诊断与鉴别。
【材料】1．器材试管、移液管、微量移液器、载玻片、37℃水浴箱、显微镜等。
2．试剂（1）肝素：配成6U/ml水溶液。
（2）制备墨汁：于普通砚台上加生理盐水5ml，以优质中国块墨或印度墨，以100r/min 研磨3min。
所得墨汁经普通滤纸过滤3次备用。
（3）瑞氏染液等。
【方法步骤】1．取小试管1支，加肝素20μl，加外周血100μl，混匀。
2．加入过滤墨汁10μl，混匀，加塞。
3．置37℃温育4h。
4．取温育后样本，推制成血涂片，干燥后，瑞氏染色。
5．油镜下观察计数幼稚细胞或中性成熟粒细胞100个；计数单核细胞20个。
6．判断结果根据细胞吞噬墨粒多少及大小，可定为下列程度：阴性：细胞内未见吞噬墨粒。
阳性：(+) 细胞内吞噬有小墨粒1～5个。
(++) 细胞内吞噬有大小不等墨粒10个左右。
(+++) 细胞内吞噬有大墨粒10个左右，小墨粒较多。
(++++) 细胞内吞噬有多数大颗墨粒，并有块状、球状，小墨粒很多，但细胞核清楚。
7．计算吞噬率及吞噬指数吞噬率（%）= ×100%吞噬指数=【注意事项】肝素剂量对白细胞的吞噬功能有影响，肝素用量过大，细胞形态异常，吞噬率和吞噬指数降低；肝素用量过小，影响抗凝。
以每100μl血用0.3U肝素为最适宜。
【参考范围】成熟中性粒细胞吞噬率59～89%，吞噬指数66～186；成熟单核细胞吞噬率90～100%，吞噬指数227～399。
【临床意义】临床上可利用该试验了解吞噬细胞的吞噬功能，对白血病的诊断和分型有一定参考价值。
第四章白细胞检验的基本方法第一节白细胞功能的检验一、墨汁吞噬试验【目的】掌握墨汁吞噬试验的原理、方法、注意事项和临床意义。
【实验原理】墨汁吞噬试验（ink phagocytosis test）是依据血液中的中性粒细胞及单核细胞对细菌、异物等具有吞噬作用，在一定量的肝素抗凝血中，加入一定量的墨汁，经37℃温育4h，涂片染色后，在显微镜下观察吞噬细胞对墨汁的吞噬情况，并计算吞噬率及吞噬指数，从而协助急性白血病的诊断与鉴别。
【材料】1．器材试管、移液管、微量移液器、载玻片、37℃水浴箱、显微镜等。
2．试剂（1）肝素：配成6U/ml水溶液。
（2）制备墨汁：于普通砚台上加生理盐水5ml，以优质中国块墨或印度墨，以100r/min 研磨3min。
所得墨汁经普通滤纸过滤3次备用。
（3）瑞氏染液等。
【方法步骤】1．取小试管1支，加肝素20μl，加外周血100μl，混匀。
2．加入过滤墨汁10μl，混匀，加塞。
3．置37℃温育4h。
4．取温育后样本，推制成血涂片，干燥后，瑞氏染色。
5．油镜下观察计数幼稚细胞或中性成熟粒细胞100个；计数单核细胞20个。
6．判断结果根据细胞吞噬墨粒多少及大小，可定为下列程度：阴性：细胞内未见吞噬墨粒。
阳性：(+) 细胞内吞噬有小墨粒1～5个。
(++) 细胞内吞噬有大小不等墨粒10个左右。
(+++) 细胞内吞噬有大墨粒10个左右，小墨粒较多。
(++++) 细胞内吞噬有多数大颗墨粒，并有块状、球状，小墨粒很多，但细胞核清楚。
7．计算吞噬率及吞噬指数吞噬率（%）= ×100%吞噬指数=【注意事项】肝素剂量对白细胞的吞噬功能有影响，肝素用量过大，细胞形态异常，吞噬率和吞噬指数降低；肝素用量过小，影响抗凝。
以每100μl血用0.3U肝素为最适宜。
【参考范围】成熟中性粒细胞吞噬率59～89%，吞噬指数66～186；成熟单核细胞吞噬率90～100%，吞噬指数227～399。
【临床意义】临床上可利用该试验了解吞噬细胞的吞噬功能，对白血病的诊断和分型有一定参考价值。
医学免疫学实验指导
实验二白细胞的吞噬及溶菌酶试验用由长沙达尔锋生物科技有限公司整理
【文章介绍】实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。
BioRike博瑞克系统的介绍了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。
BioRike简介：BioRike（中文简称“博瑞克”）是长沙达尔锋生物科技有限公司旗下的产品品牌,由旗下专业的生命科学实验室BioRike博瑞克研发和生产。
BioRike是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技实验室，专门从事以Elisa试剂盒、抗体、细胞因子、免疫检测试剂盒等免疫学产品为主的生物试剂的研发与销售。
【实验目的】
1.熟悉白细胞的吞噬及溶菌酶试验的原理和方法。
2.通过本实验理解机体的非特异性免疫机制。
【实验原理】
机体内具有吞噬功能的细胞大致分为两大类，即小吞噬细胞和大吞噬细胞。
小吞噬细胞一般指血液中的中性粒细胞，大吞噬细胞则是存在于组织中的巨噬细胞和血液中的大单核细胞。
它们构成机体天然防御机能。
本实验通过体外或动物体内的细胞吞噬及溶菌酶试验，以证实机体的非特异性免疫机制。
【实验用品】
1.器材：显微镜、载玻片、厚凹玻片、接种环、采血针、滴管、湿盒、恒温培养箱、注射器、针头、打孔器、平皿、酒精灯、火柴。
2.材料、试剂：
3.8％枸橼酸钠、2％碘酒、75％酒精、瑞氏染液、蒸馏水、6％可溶性淀粉、1％鸡红细胞悬液、溶壁微球菌(100mg／m1)、l／15mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.4)、琼脂、标准溶菌酶(100ug／m1)、新鲜鸡蛋清(1:10)、生理盐水、香柏油。
3.菌种：白色葡萄球菌24小时斜面培养物。
4.动物：小白鼠
【内容和方法】
一、小吞噬试验(中性粒细胞吞噬功能试验)
1.方法
(1)取厚凹玻片一片，在凹孔中用滴管加入一滴3.8％枸橼酸钠溶液。
(2)依次用碘酒、酒精消毒手指或耳垂及采血针后，从消毒部位采取三大滴血加入凹孔中混匀。
(3)将接种环烧灼灭菌后，刮取少许白色葡萄球菌置于凹孔血液中搅匀。
(4)将上述凹玻片放人湿盒，于37℃温箱中作用45分钟，注意每15分钟混匀一次。
(5)取出凹玻片，用烧灼灭菌的接种环将凹孔中血液搅匀后取血3—4环于载玻片上，用另一载玻片推成薄血片。
接种环烧灼灭菌后放回原处。
(6)待血片自干后，用瑞氏染液染色。
用吸管取瑞氏染液数滴滴于上述血片上先染1分
钟。
然后加等量缓冲液，轻轻晃动混匀，继续染5分钟后水洗，用吸水纸吸干后镜检。
2.结果分析
油镜检查，先寻找白血球，观察胞浆中有无吞噬的细菌。
如结果正确可见染成紫色的细胞核及被吞噬的细菌，细胞桨则为淡红色。
随机计数100个中性白细胞，记录发生吞噬和未发生吞噬的白细胞数，计数吞噬细胞百分率。
二、大吞噬试验
1.试剂配制
(1)6％可溶性淀粉肉汤：取肉汤培养基100ml，加入可溶性淀粉6g，混匀后煮沸灭菌，冷却后置4℃冰箱保存(只能保存一周)。
使用时37℃水浴溶解。
(2)1％鸡红细胞悬液：取肝素抗凝鸡血1m1，加生理盐水99ml混合。
2.方法
(1)试验前3天，于小白鼠腹腔内注射6％可溶性淀粉肉汤lml(注射时切勿刺伤内脏)。
(2)试验当天，于每只小白鼠腹腔内注射1％鸡红细胞悬液lml并轻揉腹部。
(3)注射后30分钟，用注射器吸取腹腔液少许，置于洁净载玻片上，推成涂片、晾干。
用瑞氏染液染色。
(4)油镜观察小白鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞现象(鸡红细胞为有核红细胞)，并计算吞噬细胞的百分率。
瑞(Wright)氏染液：瑞氏染粉0.1g，甲醇60ml，先将染粉置研钵内加少量甲醇研磨，然后加入全部甲醇。
配好的染液要装瓶塞紧，置二周后使用。
三、溶菌酶测定
1.试剂配制
(1)溶壁微球菌菌液的制备：菌种于使用前先在琼脂斜面上传代一次，然后接种于琼脂斜面培养基中，37℃培养24小时后收集菌苔，称重、用pH6.4磷酸盐缓冲液配成100mg／ml菌液。
经70℃水浴l小时杀菌，放置4℃冰箱备用。
(2)pH6.4 1／15mol/L磷酸盐缓冲液(沙伦生PBS)：甲液：无水Na2HPO49．46g溶于1000ml 蒸馏水。
乙液：无水KH2PO4 9．078g溶于1000ml蒸馏水。
然后取甲液27ml，乙液73ml，加NaCl 0.5g即成。
2.方法及结果
(1)将1％磷酸盐缓冲液琼脂100rnl加热溶化，待冷至50—60℃时加入微球菌菌液1m1(每m1琼脂内含标准溶壁微球菌1mg)混和均匀，注入无菌平皿，每个平皿15ml。
(2)琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板上打4个孔，孔径5mm，孔距相等。
(3)用1 m1注射器吸取唾液(由实验者收集自己的唾液于洁净平皿中取下层清液使用)，加入琼脂孔内，以注满为度。
同时以标准溶菌酶、鸡蛋清作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照，分别作好标记。
(4)将平皿置于实验台上于室温中过夜，第二天观察琼脂孔周围的溶菌环。
根据溶菌环直径的大小比较唾液及二个阳性对照的实验结果，分析试剂中溶菌酶的含量。
【注意事项】
1.小吞噬实验中要掌握好抗凝剂与血液的比例，否则会使红细胞及白细胞破坏，影响结果的观察。
2.大吞噬实验时使用小白鼠处于直立姿势有利于腹腔渗出液的抽取。
3.溶菌酶实验中应注意无菌操作，否则杂菌生长会影响溶菌环的观察。
【实验报告与思考题】
1.在吞噬细胞中发现细菌时，如何区别吞噬的细菌和粘附在吞噬细胞表面的细菌?
2.简述机体非特异性免疫的概念及特点?。
