尖孢镰刀菌拮抗细菌的筛选与抗菌蛋白的分离

河北大学硕士学位论文尖孢镰刀菌拮抗细菌的筛选与抗菌蛋白的分离姓名：王纳贤申请学位级别：硕士专业：细胞生物学指导教师：朱宝成;李术娜副20100601摘要西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）侵染引起的真菌性维管束系统病害，是西瓜生产中毁灭性的病害，给我国西瓜生产造成严重损失，严重制约着西瓜生产的发展。

为了得到对尖孢镰刀菌有抑制作用的菌株，本实验从西瓜根际土壤中分离到346株细菌菌株，其中菌株5-20的活性最高。

经有机溶剂萃取及盐析初步确定该菌株产生的拮抗物质为蛋白类物质。

通过对该菌株进行形态特征观察、生理生化试验以及16S rDNA 的序列比对分析，确认该菌株为Bacillus velezensis。

对B.velezensis5-20菌株产抗菌物质的液态发酵条件进行优化，得到了抗菌蛋白的最佳培养基组成为：玉米粉3%、蛋白胨3%、CuSO4·7H2O0.05%、ZnCl20.05%、发酵液初始pH值为7.0、装量75mL/250mL、接种量10%、发酵时间36h。

优化前后蛋白抑菌活性差别明显，优化之前抑菌圈面积379.94mm2，优化后为509.25mm2，活性提高了34.03%。

芽孢是微生物菌剂的最佳制剂形式，对恶劣的环境因素的具有抗性，可延长制剂保存期，稳定活性。

对B.velezensis5-20菌株产芽孢条件进一步进行摸索，为防治西瓜枯萎病的拮抗细菌进入工业化生产提供理论依据。

产芽孢最适发酵培养基为：最佳培养基为：玉米粉0.5%、黄豆饼粉2%、MnSO40.3%、FeSO4·5H2O0.3%；最佳培养条件为：种龄18h、接种量10%、培养基初始pH值7.0、装量75mL/250mL、发酵时间48h、温度30℃、转速220r/min。

在此优化条件下，5-20菌株发酵液中的菌体芽孢形成率大大提高，最终生物量达到2×109cfu/mL，芽孢形成率达到96.75%。

用硫酸铵沉淀B.velezensis5-20菌株发酵液中的蛋白质，透析、真空冷冻干燥后检测活性，并对其性质进行了研究。

该抗菌蛋白最适作用温度为25℃，在pH6.0~8.0范围内具有较好的稳定性，最适作用pH值为7.0；Mg2+、Mn2+对此蛋白有明显的激活作用。

关键词尖孢镰刀菌Bacillus velezensis芽孢优化抗菌蛋白分离纯化AbstractWatermelon fusarium wilt is a fungal vascular system disease which is infested by Fusarium oxysporum f.sp.niveum.It's a devastating disease.Watermelon fusarium wilt caused serious losses to waermelon production in China.And it severely restrict the development of the watermelon production.In order to identify a strain which is effective in controlling the Fusarium oxysporum, 346strains were isolated and screened from the soil of the watermelon root.A strain named 5-20strain with a rather higher activity was obtained.Though the morphology characteristics, physiological and biochemical properties and16S rDNA sequence of this strain,the5-20 strain was finally identified as a kind of Bacillus velezensis.The further studies on the antifungal protein-Producing conditions of the strain was carried out.Through single factor experiment and orthogonal experiment,the optimal shaking flask fermentation condition was determined as follow:media composed of3%cornmeal,3% peptone,0.05%CuSO4·7H2O,0.05%ZnCl2,initial pH7.0and10%inoculum volume,media volume50/250(mL/mL),fermentation time36h.A distinguished elevation of the antagonistic activity was observed with about39.9%.The difference in activity is obvious:the area of inhibition zone was509.25mm2for those optimized and379.94mm2for those common.Spore is the best preparation form of microbial agents.Strain B.velezensis5-20which was isolated and screened by our lab has better antagonistic activity against Watermelon fusarium.In order to improve the formation rate and spore quantity of antagonistic bacterium strain5-20,We investigated the main factors influencing sporulation using shake-flask fermentation method.The optimal shaking flask fermentation condition was determined as follow:media composed of0.5%cornmeal,2%soybean meal,0.3%MnSO4,0.3% FeSO4·5H2O.Initial pH7.0,incubation time18h and bottle filling capacity75mL/250mL, 10%inoculum volume,fermentation time48h,fermentation temperature30℃,rotating speed 220r/min.Under this optimum condition,the spore formation rate achieves96.75%.Biomass achieves2×109spore/mL.The proteins were extracted by ammonium sulphate precipitation from the fermented broth of B.velezensis5-20.Assays for proteins activity were done on plate.The antifungal protein was stable at pH6.0~10.0,the optimal reaction temperature and pH value were25℃and pH7.0respectively.The activity was enhanced by the addition of Mn2+and Mg2+.Key word Fusarium oxysporum Bacillus velezensis Spore PurificationAntibacterial protein Separation引言引言西瓜被称为“夏季水果之王”，是世界上重要的园艺作物，是世界十大水果之一，其栽培面积与总产量均在世界水果前列[1]。

西瓜枯萎病又称萎蔫病或蔓割病，是西瓜生产上危害最严重的病害之一。

近年来，西瓜枯萎病害频频发生，并有蔓延之势，严重影响了西瓜的品质和产量，使广大农民朋友遭受巨大的经济损失[2,3]。

目前，病害的生物防治，因其具有不易诱导抗药性、无污染、防效持久等特点，成为控制植物病害的重要方法[4-11]。

在目前缺乏有效药物的情况下，采用“以菌治菌”的生物防治措施逐渐引起人们的重视，并被认为是最具有发展潜力的防治方法之一[12]。

微生物在自然界中以群体的形式存在，利用土壤环境中有益的微生物产生拮抗病原微生物的拮抗物质，或通过竞争土壤营养遏制病原微生物的生长，或寄生于病原微生物，或通过代谢产物诱导植物产生抗病性等作用，达到防治病害的目的。

本文拟从西瓜根际土壤中筛选出对西瓜枯萎病致病菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）具有较高拮抗作用的5-20菌株，进行菌种鉴定确定其分类地位，优化了液态发酵条件，提高产抗菌蛋白量和产芽孢培养条件，提高芽孢形成率及芽孢数量。

并从该拮抗细菌的抗菌成分中分离纯化出抗菌蛋白，为进一步克隆抗菌蛋白基因提供理论依据，也为西瓜枯萎病的防治提供一种很有前景的防治策略。

河北大学理学硕士学位论文第1章绪论1.1西瓜枯萎病1.1.1西瓜枯萎病概述西瓜是葫芦科，西瓜属，一年生蔓性草本植物。

果瓤脆嫩，味甜多汁，含有丰富的矿物盐和多种维生素，是夏季主要的消暑果品。

西瓜生产在世界园艺业中占有重要地位，种植面积和产量在世界十大水果中仅次于葡萄、香蕉、柑橘和苹果居第五位。

西瓜清热解暑，对治疗肾炎、糖尿病及膀胱炎等疾病有辅助疗效。

果皮可腌渍、制密饯、果酱和饲料。

种子含油量达50%，可榨油、炒食或作糕点配料。

20世纪80年代以来，我国西瓜的栽培面积迅猛增加，西瓜种植面积目前己占世界西瓜总面积的1/2以上，产量占世界总产量的2/3以上，我国己经成为世界西瓜产业的第一大国。