指纹图谱方法

DNA指纹图谱法的基本操作：从生物样品中提取DNA（DNA一般都有部分的降解），可运用PCR 技术扩增出高可变位点（如VNTR系统，串联重复的小卫星DNA等）或者完整的基因组DNA，然后将扩增出的DNA酶切成DNA片断，经琼脂糖凝胶电泳，按分子量大小分离后，转移至尼龙滤膜上，然后将已标记的小卫星DNA探针与膜上具有互补碱基序列的DNA片段杂交，用放射自显影便可获得DNA指纹图谱。

琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA片段的常规方法。

利用低浓度的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。

如有必要，还可以从凝胶中回收DNA条带，用于各种克隆操作。

琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。

用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kbp的DNA。

长度100kb或更大的DNA，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。

在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。

它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。

DNA分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。

DNA分子迁移的速率受分子大小，构象。

电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。

三. 实验材料和试剂1. DNA样品2.化学试剂和溶液（1）DNA样品反应缓冲液：100mM Tris，200mM NaCl，20mM MgCl2，2mM DTT，pH 8.0 （2）EcoRⅠ限制性内切酶（3）PstⅠ限制性内切酶（4）电泳缓冲液（50×TAE）Tris 242g冰醋酸57.1mlEDTA（0.5mol/L pH 8.0）100ml使用时用蒸馏水稀释50倍。

（5）样品缓冲液（DNA sample loading dye）0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青40%（W/V）蔗糖（6）溴化乙锭（EB）10mg/ml（7）琼脂糖agarose（电泳级）（8）DNA分子量标记物：Lambda HindⅢDNA markers3. 仪器设备和消耗品电泳仪、电泳槽、样品梳、微波炉、水浴锅、移液器（10μl，200μl，1000μl）、离心管、一次性枪头（200μl，1000μl）。

样品前处理：1.冷冻保存：-80℃组织应在离体30min内，快速取材，放入专用冷冻管中，并编上号，登记在册。

1.从组织提取基因组DNA一、材料外囊、外膜、“外膜”附近肝组织、正常肝组织（多组标本）二、设备移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。

三、试剂1、分离缓冲液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。

2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。

四、操作步骤:1. 切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。

2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。

3. 加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。

4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37℃保温1-2小时, 直到组织完全解体。

5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm离心数秒钟。

6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。

待分层后,3000rpm离心 5分钟。

7. 取上层水相至干净离心管, 加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。

8. 移去上层乙醚,保留下层水相。

9. 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。

室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。

10. 用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE 中,-20℃保存。

11. 如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10重沉淀DNA。

基因组DNA的检测（即定性及定量分析）上述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。

DNA(脱氧核糖核酸)是细胞染色体中的遗传基因,其分子各个片段就代表各个遗传信息。

由于DNA指纹图谱直接反映DNA水平上的差异,它成为当今最先进的遗传标记系统。

DNA指纹图谱技术主要有:限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polym or2 phism,简称RF LP)、随机扩增多态性(Random am plified polym orphic DNA,简称RAPD)、小卫星DNA (Mini2satellite DNA)、微卫星DNA (Microsatellite DNA)、内部简单重复序列(ISSR)、扩增片段长度多态性(Am plified fragment length polym or2 phism,简称AF LP)等等。

一、DNA指纹图谱的方法11RF LP方法RF LP方法是G rodzicker等人于1974年发明的。

它是一种利用限制性酶切片段长度差异来检测生物个体之间差异的分子标记技术。

RF LP方法于上个世纪80年代开始应用于植物,在水稻、小麦、玉米、蕃茄和马铃薯等作物上的研究都已有报道。

但RF LP的多态信息含量是相对而言的,在一些作物上RF LP探针可进行品种间及种间的鉴别,而在小麦、马铃薯、大豆等作物上的多态性较低。

特别是小麦,它是严格的自花授粉作物,基因组较大,多态性很低(即使在相当分散的品种间也是如此)。

因而,RF LP方法在指纹图谱中的应用受到限制。

21RAPD方法RAPD方法是Willams等人于1990年发明的。

它是利用扩增DNA片段长度差异来检测生物个体的分子标记技术。

它可在对物种没有任何分子生物学研究的情况下,对其进行基因组指纹图谱的构建。

其相对于RF LP方法较简便,DNA用量也较少,且省去了使用放射性同位素,受到了许多学者的重视。

Welth1991年曾用RAPD分析玉米杂交种的品种纯度,He等人1992年曾用RAPD识别小麦品种,在花生、小麦、水稻等作物上也曾进行过深入研究。

中药指纹图谱相似度评价方法的比较一、本文概述中药指纹图谱作为一种全面、综合地反映中药内在质量的技术手段，已经在中药质量控制、真伪鉴别以及新药研发等领域得到了广泛应用。

指纹图谱相似度评价则是评估中药指纹图谱质量、稳定性的重要指标，其评价方法的优劣直接关系到中药质量评价的准确性。

本文旨在对现有的中药指纹图谱相似度评价方法进行比较分析，探讨各种方法的优缺点，以期为提高中药质量控制水平提供理论支持和实践指导。

本文将首先介绍中药指纹图谱相似度评价的基本概念和研究意义，然后重点阐述几种常用的相似度评价方法，包括夹角余弦法、相关系数法、谱峰匹配法等。

在此基础上，本文将通过对比分析这些方法的计算原理、适用范围、优缺点等方面，为读者提供一个全面、深入的相似度评价方法比较视角。

本文将展望中药指纹图谱相似度评价方法的未来发展趋势，以期为推动中药现代化、国际化进程提供有益参考。

二、中药指纹图谱相似度评价方法概述中药指纹图谱相似度评价是中药质量控制领域的一个重要研究方向，旨在通过科学、客观的方法来评估中药的内在质量。

随着现代分析技术的不断发展，越来越多的相似度评价方法被应用于中药指纹图谱的研究中。

这些方法大致可以分为以下几类：谱图直观比较法：这是最简单直接的相似度评价方法，通过直接观察指纹图谱的峰形、峰位和峰强度等信息，对中药样品进行直观的比较和判断。

这种方法简单易行，但主观性较强，容易受到观察者的经验和技能影响。

相似度计算法：这类方法通过数学公式或算法，对中药指纹图谱进行量化分析，从而得出样品间的相似度。

常用的相似度计算法包括相关系数法、夹角余弦法、欧氏距离法等。

这些方法具有客观性强、结果可重复等优点，但也需要选择合适的计算参数和阈值。

模式识别法：模式识别技术，如人工神经网络、聚类分析、主成分分析等，也被广泛应用于中药指纹图谱的相似度评价中。

这些方法能够通过学习和训练，自动识别指纹图谱中的特征信息，并对中药样品进行分类和识别。

食品安全快速检测指纹图谱方法开发近年来，食品安全问题成为社会关注的焦点。

为了提高食品安全检测的效率和准确性，科学家们开发了一种新的检测方法——食品安全快速检测指纹图谱方法。

这种方法基于生物技术和化学分析技术，能够快速、准确地判断食品的质量和安全性。

本文将详细介绍食品安全快速检测指纹图谱方法的开发原理、应用场景和优势。

食品安全快速检测指纹图谱方法的开发原理主要基于两个关键技术：生物技术和化学分析技术。

首先，通过使用高通量测序技术，可以获取食品样品中的DNA或RNA序列信息。

然后，利用生物信息学方法对这些序列进行比对和分析，得到食品的特征指纹图谱。

接下来，利用化学分析技术，对食品样品进行色谱、质谱或光谱等分析，获取食品中的化学成分信息。

最后，将生物和化学信息进行综合分析，建立食品安全指纹图谱数据库，并通过模式识别算法进行快速检测和识别。

食品安全快速检测指纹图谱方法可以应用于各个环节的食品安全检测和溯源。

首先，在生产环节，可以对原料和生产过程中的食品进行检测，确保食品的质量和安全性。

其次，在运输和储存环节，可以监测食品的保存状态，及时发现问题，防止食品变质和污染。

最后，在销售和消费环节，可以对市场上的食品进行抽检，保障食品供应链的安全。

与传统的食品安全检测方法相比，食品安全快速检测指纹图谱方法具有几个明显的优势。

首先，它可以快速检测大量样品，提高检测效率。

传统方法通常需要较长时间才能得到结果，而指纹图谱方法只需几个小时就能完成检测。

其次，该方法具有较高的准确性和可靠性。

由于使用了多个指纹特征和多个指标分析，能够更全面地评估食品的质量和安全性。

再次，这种方法可以定量分析食品中的成分含量。

通过比较不同样品的指纹图谱，可以准确判断食品是否有变质或掺假现象。

最后，该方法还可以与大数据、云计算等新技术结合，构建食品安全大数据平台，便于信息共享和监管。

尽管食品安全快速检测指纹图谱方法在食品安全领域有着广阔的应用前景，但仍然存在一些技术挑战和问题需要克服。

中药指纹图谱操作指南说明：本实验研究规程指南为在原技术要求的基础上规范中药注射剂色谱指纹图谱试验研究而制订。

本指南未能概括的内容，通过实践可自行补充调整，但申报资料或复核资料中须有相应的说明和申述。

指南中的"色谱指纹图谱"指采用柱色谱及薄层色谱等各种色谱技术实验研究的指纹图谱。

光谱指纹图谱将另行规定。

一、供试品收集供试品收集是研究指纹图谱最初也是最关键的步骤，由于不可能对一个药材的所有样本进行试验，而且生长环境条件对药材代谢产物有影响，所以要收集有代表性的供试品。

收集不少于10批供试品的含义是指样本的数和量要有足够的代表性。

(一) 原料药材：在药材的化学成分与中医临床疗效的之间的关联尚未能阐明的现阶段，基本上是在承认其传统的功能主治及临床验证的基础上进行指纹图谱的实验研究。

原料药材的指纹图谱主要是反映其自然状态的内在质量情况，研究其指纹图谱是以此作为选择原药材投料或混批提取的依据，同时作为研究注射剂成品指纹图谱相关性的基础。

由于自然条件的变化，药材个体之间指纹图谱的差异是正常的，在品种鉴定无误的基础上，力争药材有较为固定和稳定的来源，个体之间的指纹图谱主要特征大致相似即可，使成品指纹图谱特征的稳定有起码的保证。

药材的"批" 不是工业生产的"批"，是指相互独立的供试品，即不能将同一地点或同一渠道同一时间获得的供试品分成若干份供试品，以保证试验结果的代表性。

由于收集药材供试品受主观和客观的条件限制，供试验的供试品严格讲均没有统计学的意义，所以供试品数越多越好，10批是最低的要求。

供试品应保证其真实性，应有完整采样原始记录，内容包括：药材名称供试品来源（真实记录供试品来自何处：传统产地收集或是资源丰富的产地收集，或者来自GAP基地供应；还是产地购买、市场购买或委托购买，等，以便于生产原料的采购选择和测试数据的可追溯）。

收集时间（购买时间）及收集人货源情况调查（货源是否充足和稳定）基原鉴定及鉴定人：产地或GAP基地收集的药材结合植物形态鉴定品种。