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EGFP在肿瘤细胞中的表达分析彭超222008371042030西南大学生命科学学院，重庆 400715摘要：肿瘤基因靶向治疗已经成为目前肿瘤治疗研究最活跃的领域之一，其目的是在不损伤正常细胞的前提下，进行选择性杀伤或抑制肿瘤细胞。
目前已有大量靶分子被分离和鉴定，如端粒酶、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶等，其中端粒酶是目前所发现的恶性肿瘤最广谱的分子标记，在绝大多数恶性肿瘤中被激活，而在正常体细胞中一般为阴性表达。
近年来研究人员利用人端粒酶逆转录酶（human telomerase reversetranscriptase，hTERT）基因在端粒酶阳性肿瘤细胞中高效表达的特点，构建用hTERT 启动子调控其它抗肿瘤基因的表达载体，靶向破坏肿瘤细胞已取得了较大进展。
由于慢病毒载体具有可感染细胞并整合DNA序列的、可转移较大的基因片段等优点。
本研究通过构建由hTERT 基因启动子介导绿色荧光蛋白基因表达的慢病毒载体, 并转染肿瘤细胞, 检测该启动子在端粒酶阳性的肿瘤细胞中eGFP 的表达情况。
关键词：eGFP hTERT 肿瘤TOPO克隆脂质体介导法第一部分文献综述靶向诱导肿瘤细胞凋亡近年来研究发现，肿瘤的形成与凋亡功能的失调密切相关，提出肿瘤的发生可能是肿瘤细胞异常增殖和其凋亡调控功能受到抑制共同作用的结果。
一些研究人员利用hTERT 启动子的肿瘤特异性，在其下游连接凋亡相关的抑癌基因或细胞因子，导入端粒酶阳性的肿瘤细胞，从而靶向诱导肿瘤细胞发生凋亡，已取得良好效果[7]。
Caspases 是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，在细胞的凋亡过程中发挥重要作用，其中Caspase-3是细胞凋亡的执行者。
Yang 等[8]利用构建的hTERT/re-Caspase-3系统，同时转染端粒酶阳性的鼻咽癌细胞CNE1、结肠癌细胞HRT-18、胃癌细胞MGC 和端粒酶阴性的正常上皮细胞Hacat，孵育48h 后，荧光显微镜下观察，肿瘤细胞呈典型的核固缩、核碎裂、核溶解的凋亡形态；流式细胞仪分析显示，三种端粒酶阳性的肿瘤细胞（CNE1、HRT-18和MGC）凋亡率为15%~20%，而端粒酶阴性的Hacat仅为1.5%~3.5%；动物试验将hTERT/re-Caspase-3直接注射在裸鼠肿瘤内，以不含Caspase-3的hTERT/SEAP 为对照，连续7d 后观察发现，hTERT/re-Caspase-3能显著抑制裸鼠肿瘤的生长，证实了hTERT/re-Caspase-3的体内外靶向抗肿瘤作用。
EGFP的原核表达分析首都师范大学生命科学学院100048摘要：利用PCR反应扩增出所需要的EGFP基因，与pTrc His蛋白表达载体重组，转化大肠杆菌BL21,提取质粒，诱导EGFP蛋白表达，进行进一步的分离纯化并用SDS-PAGE和Western-blot 做检测。
这个实验让我们充分熟悉了整个流程。
关键词：绿色荧光蛋白蛋白的诱导表达、分离纯化表达蛋白检测 E.coli材料和方法：1、主要材料及仪器1.1、菌株和质粒：大肠杆菌BL21为本实验室保存；重组筛选质粒pTrcHis购自Invitroge公司。
1.2、培养基：LB培养基（液/固）内含氨苄青霉素浓度为100 ug/ml。
1.3、器材和试剂器材：移液枪、PCR仪、离心机—（HetticZENTRIFUGEND-78532 Tuttlingen）、SIGMA2-16K(4℃离心机)、SIGMA 3-18K(离50ml大离心管)、紫外透射观察仪、水浴锅、核酸电泳仪（BIO-RAD）、超声波破碎仪（SONICSVIbra cell）、气浴恒温振荡器（THZ-82江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）、SDS-PAGE电泳装置、WesternBlotting电转移装置、水平摇床（WD-9405）、胶片观察灯（WD-9406）、封口机、超净台、250ml锥形瓶。
试剂：PCR反应体系缓冲液（10~50 mMTris-HCl，50 mM KCl，1.5 mMMgCl2）、DNA聚合酶（Taq E）、dNTPs混合物（每种2.5mM）、博大泰克PCR产物快速回收试剂盒、限制性核酸内切酶（BglII、EcoRI）、0.5M EDTA、琼脂糖凝胶（1g琼脂糖、100ml1xTAE、10ulEB）、电泳缓冲液（50 xTAE、Tris—乙酸、EDTA）、溴酚兰、蔗糖、甘油、连接酶（购于Promega公司的T4DNA连接酶及10×ligation buffer）、0.1MCaCl2、碱裂解液（溶液I：50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl，pH=8.0、10mM EDTA；溶液II：0.2 M NaOH，1％SDS；溶液III：5 M KAc，11.5 ml冰醋酸，加水定容至100ml）、RNaseA、无水乙醇、PBS缓冲液、裂解缓冲液（含20mM咪唑）、冲洗液（含100mM咪唑）、洗脱液（含500mM咪唑）、5×样品缓冲液、30%凝胶贮液、4×分离胶缓冲液、4×浓缩胶缓冲液（4℃保存）、TEMED原液、10%过硫酸铵、Tris-甘氨酸电极缓冲液（pH=8.3）、考马斯亮蓝G250染色液、GFP抗体（200ug/ml，用pH=7.5 TBS配置)、转移缓冲液、TBS、封闭液（5%脱脂奶粉）、显色液（氯萘酚，30mg/ml于甲醇中）、ddH2O、脱色液（（100 ml冰乙酸:100 ml乙醇:800 ml蒸馏水）2、方法2．1、EGFP基因的PCR扩增及其电泳检测在一灭菌的0.2mL小离心管中依次加入(总体积为50ml)：10×buffer(Mg2+)5ml4×dNTPs （每种 2.5mM ）8mlEGFP-F1mlEGFP-R1mlTemplate(模板)34mlTaq E1ml--------------------------------------------------------------------------------Total volume 50µl循环参数94 ℃3min94 ℃30s55 ℃30s 27cycle72 ℃1min72 ℃10min4 ℃保存2.2、PCR扩增产物的回收———试剂盒法1)、柱平衡：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500ml的平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。
西南大学本科实验教学改革行动计划项目——综合性、设计性实验项目建设项目名称：EGFP在肿瘤细胞中的表达分析--基因工程课程综合性实验项目项目负责人：杨应斌负责人所在部门：生命科学学院填表日期：2010年6月16日EGFP在肿瘤细胞中的表达分析引言利用肿瘤组织特异性启动子调控自杀基因在肿瘤组织的靶向表达，是肿瘤基因治疗研究中的一种策略。
目前常用的肿瘤组织特异性启动子有：前列腺特异性抗原（PSA）启动子、癌胚抗原（CEA）启动子、人类端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子等。
其中hTERT在85%以上的不同组织起源的各种类型的恶性肿瘤中，都可以检测到较高水平的表达，而在正常哺乳动物体细胞中，除生殖细胞等少数几种细胞可检测到活性以外，其它组织细胞均为阴性。
由于hTERT启动子和其它启动子相比，具有广谱（在大多数肿瘤细胞中有活性）、转录活性高、靶向性好等优点，因而被认为是肿瘤基因治疗领域里较有潜在应用价值的启动子。
现已有使用hTERT启动子成功对骨肉瘤、结肠癌、肝细胞肝癌等恶性肿瘤进行靶向基因治疗的报道。
人类骨髓干细胞不具有端粒酶活性已经被报道，然而Burns JS的研究发现，长时间在体外培养的干细胞可能发生癌变，其原因是其开始表达端粒酶。
而肿瘤细胞之所以能够无限增殖，也与其有比正常细胞活跃的端粒酶有关。
hTERT基因的转录机制严格控制着端粒酶的活性的表达，而hTERT基因的转录被hTERT基因启动子调控，hTERT基因启动子是一种在肿瘤细胞中特异启动的启动子，因此，我们构思可以利用hTERT基因启动子，在其下游接入自杀基因，并将其克隆入慢病毒载体中，再借助慢病毒将此融合基因导入骨髓干细胞中，筛选出含有由hTERT基因启动子控制自杀基因的供体骨髓干细胞，当这种移植的骨髓干细胞在植入体内后有形成肿瘤细胞的趋势时，就可以通过自杀基因的表达使用前体药物对有瘤变趋势的骨髓干细胞进行杀灭，这样既不会对受体产生副作用，又可以由此解决骨髓干细胞移植的安全性问题。
NK4基因重组慢病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达李霏，李松林，尹元琴（中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所，沈阳１１０００１）摘要目的构建共表达人NK4基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP ）基因的重组慢病毒载体，转染人高侵袭转移肝癌细胞LM3（HCCLM3），观察其转染效率及表达情况。
方法采用DNA 重组技术，将NK4基因克隆至带EGFP 的慢病毒表达载体pLenti6.3-内部核糖体进入位点序列（IRES ）-EGFP 中，并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带NK4基因的质粒pLenti6.3-NK4-IRES -EGFP 共转染293T 细胞，包装慢病毒并测定滴度。
以不同感染复数（MOI ）的重组慢病毒感染293T 细胞，筛选最适MOI ，以最适MOI 重组慢病毒感染HCCLM3细胞，观察转染效率。
Western blot 法测定细胞中NK4蛋白表达水平。
结果成功构建共表达NK4基因和EGFP 基因的慢病毒载体pLenti6.3-NK4-IRES -EGFP ，并对其包装、纯化及浓缩后测定病毒滴度为1.08×108TU/mL 。
重组慢病毒感染HCCLM3细胞筛选其最适MOI 为7。
转染后HCCLM3细胞中可见明显的NK4蛋白表达，而未转染细胞中无NK4蛋白的表达。
结论成功构建了NK4基因的重组慢病毒载体，有效地转染HCCLM3细胞后可高表达NK4蛋白。
关键词NK4；慢病毒载体；人高侵袭转移肝癌细胞LM3；基因转染中图分类号R73文献标志码A文章编号0258-4646（2011）12-1081-04doiCNKI:21-1227/R.20111226.1615.028网络出版地址/kcms/detail/21.1227.R.20111226.1615.028.htmlConstruction of NK4Recombinant Lentiviral Vector and Its Expression in HCCLM3Cells 肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma ，HCC ）是世界上常见的恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率的第5位［1］。
hSp17/EGFP共表达卵巢癌细胞模型的建立的开题
报告
一、研究背景及意义
卵巢癌是一种高度致命性的妇科恶性肿瘤，具有难以早期诊断和高复发率的特点。
目前，卵巢癌的治疗手段主要包括手术切除和化疗，但这些方法往往不能有效治愈患者。
因此，建立新的治疗策略和开发新的治疗药物成为卵巢癌研究的重点。
在卵巢癌研究中，建立合适的细胞模型是必不可少的。
EGFP是一种绿色荧光蛋白，广泛应用于细胞显微镜检测、蛋白定位和药物筛选等方面。
因此，利用EGFP共表达的方法建立卵巢癌细胞模型，可以为卵巢癌的研究提供重要的工具和平台。
二、研究内容和方法
本研究拟建立hSp17/EGFP共表达的卵巢癌细胞模型。
具体步骤如下：
1.获取卵巢癌细胞株SKOV3和hSp17-cDNA。
2.将hSp17-cDNA克隆到pEGFP-C1载体中，构建hSp17/EGFP表达质粒。
3.通过脂质体转染的方法将hSp17/EGFP表达质粒转染到SKOV3细胞中。
4.筛选出稳定的hSp17/EGFP共表达细胞株。
5.通过荧光显微镜观察EGFP的表达情况，通过western blotting检测hSp17的表达水平。
6.利用细胞增殖实验和细胞凋亡实验分析hSp17对SKOV3细胞增殖和凋亡的影响。
三、研究进展和预期结果
目前已完成步骤1和步骤2，成功克隆出hSp17/EGFP表达质粒。
下一步将进行细胞转染和筛选，并通过荧光显微镜和western blotting确认模型的建立和表达情况。
预计该模型可以为卵巢癌的研究提供新的手段和平台，并为药物筛选和新治疗方法的开发提供新的思路和突破口。
EGFP在肿瘤细胞中的表达分析黄娟西南大学生命科学学院，重庆 400715目录摘要............................................... 错误！未定义书签。
Abstract............................................ 错误！未定义书签。
第一章文献综述..................................... 错误！未定义书签。
1.1 HTERT基因在肿瘤治疗中的研究进展............. 错误！未定义书签。
1.1.1 HTERT基因的发现........................ 错误！未定义书签。
1.1.2 HTERT基因的结构和特征.................. 错误！未定义书签。
1.2 HTERT基因在肿瘤治疗中的生物学意义........... 错误！未定义书签。
1.2.1 端粒与端粒酶........................... 错误！未定义书签。
1.2.2 端粒酶与肿瘤的关系..................... 错误！未定义书签。
1.2.3 针对端粒酶的抗肿瘤治疗................. 错误！未定义书签。
1.3 HTERT基因肿瘤在治疗中的研究进展............. 错误！未定义书签。
1.3.1HTERT基因肿瘤治疗中的发展前景.......... 错误！未定义书签。
1.3.2 HTERT基因在肿瘤在治疗中的存在的问题.... 错误！未定义书签。
1.3.3 HTERT基因在肿瘤治疗中的展望............ 错误！未定义书签。
第二章引言......................................... 错误！未定义书签。
第三章材料与方法................................... 错误！未定义书签。
3.1 实验材料.................................... 错误！未定义书签。
3.1.1 实验动物............................... 错误！未定义书签。
3.1.2 主要仪器与设备......................... 错误！未定义书签。
3.1.3主要试剂、培养基和试剂盒............... 错误！未定义书签。
3.1.4 常用试剂及其配制....................... 错误！未定义书签。
3.1.5 常用生物信息学网站和分析软件........... 错误！未定义书签。
3.2 实验方法.................................... 错误！未定义书签。
3.2.1 猪基因组DNA的提取..................... 错误！未定义书签。
3.2.2 总RNA的提取及cDNA的制备.............. 错误！未定义书签。
3.2.3 EST拼接和引物设计..................... 错误！未定义书签。
3.2.4 PCR及PCR-RFLP分析.................... 错误！未定义书签。
3.2.5 PCR产物的纯化、克隆和测序............. 错误！未定义书签。
3.2.6 印记分析............................... 错误！未定义书签。
3.2.7 基因组织表达半定量分析................. 错误！未定义书签。
3.2.8 基因定位分析........................... 错误！未定义书签。
第四章结果与分析................................... 错误！未定义书签。
4.1 基因组DNA的提取............................ 错误！未定义书签。
4.2 总RNA的提取与cDNA的制备................... 错误！未定义书签。
4.2.1 总RNA的提取........................... 错误！未定义书签。
4.2.2 cDNA的制备与检测...................... 错误！未定义书签。
4.3 四个候选基因的克隆、印记鉴定与基因定位...... 错误！未定义书签。
4............................................ 错误！未定义书签。
4.3.2 猪GTL2基因............................ 错误！未定义书签。
4.3.3 猪RTL1基因............................ 错误！未定义书签。
4.3.4 猪DIO3基因............................ 错误！未定义书签。
第五章讨论......................................... 错误！未定义书签。
5.1 印记基因的分离.............................. 错误！未定义书签。
5.2 印记基因表达的研究方法...................... 错误！未定义书签。
5.2.1 基于“表达的SNP”的分析方法........... 错误！未定义书签。
5.2.2 应用品种间正反交模型分析印记基因的可行性错误！未定义书签。
5.3 四个候选印记基因的表达状况.................. 错误！未定义书签。
5.3.1 DLK1基因.............................. 错误！未定义书签。
5.3.2 GTL2基因.............................. 错误！未定义书签。
5.3.3 RTL1基因.............................. 错误！未定义书签。
5.3.4 DIO3基因.............................. 错误！未定义书签。
5.4 RTL1和DIO3基因的遗传定位................... 错误！未定义书签。
5.5 印记基因与动物遗传育种...................... 错误！未定义书签。
参考文献............................................ 错误！未定义书签。
致谢................................................ 错误！未定义书签。
发表论文及参加课题一览表............................ 错误！未定义书签。
摘要：【目的】构建携带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP)质粒载体，通过将启动子置换成端粒酶（HTERT）启动子，使其能在肿瘤细胞中特异性的表达，观察EGFP的表达情况以及对靶细胞生物活性的特异性的影响。
【方法】以质粒pEGFP-N3为模板进行PCR反应获得完整保留pEGFP-N3的多克隆酶切位点的EGFP基因片段，定向插入更换启动子的pLenti6V5DTop质粒中，其启动子由原来的PCMV置换为HTERT启动子，筛选出正确的重组绿色荧光蛋白基因的重组载体pLenti6V5DTop-EGFP，在阳离子脂质体的作用下导入肿瘤细胞后，获得具有绿色荧光蛋白颗粒的表达产物，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白作为目的基因在体外的表达情况，以及对肿瘤细胞生物活性的影响。
【结果】成功克隆携带有EGFP基因的载体，该载体经导入人的肿瘤细胞后产生稳定的表达产物。
关键词：EGFP基因；pLenti6V5DTop质粒载体；HTERT启动子；pLenti6V5DTop-EGFP；导入；人体肿瘤细胞EGFP gene's expression and analysis in cancer cell of humanjuan huangSchool of Life Science, Southwest China University, Chongqing 400715, ChinaAbstract:【objective】to construct the plasmid carrying enhanced green fluorescent protein (EGFP)gene and to observe the expression of green fluorescent proteinin in human cancer cells.【methods】【results】【conclusion】Key words:green fluorescent protein (EGFP)gene ;pLenti6V5DTop plasmid;HTERT promoter;translate;human cancer cells;第一部分文献综述1.1 HTERT基因在肿瘤治疗中的研究进展1.1.1、HTERT基因的发现1985年Blackburn研究小组首先在四膜虫中发现了催化合成端粒重复序列的端粒酶(Telomerase)［5］。
之后耶鲁大学Morin(1989)在人宫颈癌细胞中也发现了人端粒酶［6］。
端粒酶是一种核糖核蛋白，它由蛋白质和与端粒DNA互补的RNA 所组成，它能以自身的RNA为模板合成端粒DNA，本质上属逆转录酶。
目前，包括人的多种生物的端粒酶RNA组份及其基因已被克隆［7～9，21］，而四膜虫、线虫、酵母、小鼠及人端粒酶的蛋白组份及其基因也已纯化和克隆成功［10～12］。
1.1.2、HTERT的结构和特征在脊椎动物端粒的DNA结构为5’(TTAGGG)n-3’重复序列，调节蛋白（Telomerase Regulatory Factors,TRF1、TRF2），二者C-末端都有特异性的Myb 重复序列同源保守域（telobox），可特异性识别并结合端粒的双链DNA及3’端富G的单链尾。
中间部分都有长约200核苷酸的同源二聚体化域。
所不同的是TRF1的N-末端是酸性基因，而TRF2的N-G末端是碱性基因。
野生型TRF1过表达可导致端粒进行性缩短，而突变型（缺失DNA-结合域）TRF1可延长端粒，表明它调节端粒酶依赖的端粒长度。
TRF1蛋白结合于端粒重复序列上数量可作为负性的长度依赖性的调节因子。
突变（显性失活）TRF2过表达的细胞表现为端粒缩短，结合于双链DNA的TRF2减少，未端单链G尾丢失，引发由P53介导的损伤途径，染色体出现端端融合、有丝分裂的发生率异常升高甚至直接导致细胞凋亡。
提示TRF2的作用在于调节端粒的功能。
