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免疫沉淀（Immunoprecipitation）实验操作方法实验原理：免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP是利用特异性抗体从样品中特异性“捕捉”目的蛋白/片段的技术，其首要条件是将特异性抗体作固相化固定，目前常Frdbio用的思路是利用Protein A/G的琼脂糖凝胶，通过与抗体的Fc段特异性结合，间接固定特异性抗体；特异性抗体固定以后。
目前多用预先结合固化在Agarose beads上的protein A/G（Agrose-proteinA/G），使之与抗体结合，就可以特异性抓取目的蛋白/抗原/片段，与亲和层析纯化的原理完全相同，实验过程：利用Agarose beads的重量，通过离心即可特异分离富集目的抗原/蛋白/片段。
实验步骤：样品前处理：以细胞为例1、蛋白量的估算：一般3×106细胞/处理(即六孔板一个孔，约200ug总蛋白)；实验者根据自己实验用量自己选择；福因德科技2、细胞的裂解：（溶液配制见附录，配制溶液需要加蛋白酶抑制剂，如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂。
注意抑制剂的要现加现用。
）1）冰上操作，裂解细胞前用1×PBS（4）洗1遍，加入细胞裂解液200ul/孔（3×106细胞），冰上静置5分钟后刮下细胞并收集至EP管中；2）超声：强度45％，5秒×10次。
（如果效果不好需要适当调整超声波的强度）3）离心细胞裂解液：4℃10000rpm 10 分钟，取上清。
3、Agrose-proteinA/G清洗：取相应量的Agrose-proteinA/G到EP管中（剪枪头）并用500ul 1×PBS（4℃）清洗（1ug抗体对应15ul Agrose-proteinA/G），5000rpm×2分钟，吸掉上清，如此重复清洗3次以上。
4、细胞裂解液预清洗：Friendbio将步骤2裂解的细胞与步骤3清洗好的Agrose-proteinA/G 4℃摇床孵育1个小时，5000rpm×2分钟，取上清备用。
免疫共沉淀详细操作方法一、准备实验材料和试剂1.细胞培养基和细胞培养酶：根据实验需要选择不同种类的培养基和酶。
2.细胞系：选择适当的细胞系，如HEK293T细胞等。
3.抗体：选择特异性强、亲和力高的单克隆或多克隆抗体。
4. 蛋白提取缓冲液：例如，含10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、0.5% NP-40等。
5.磷酸盐缓冲液：例如，PBS（含1.5mMKH2PO4、6.5mMNa2HPO4、137mMNaCl、2.7mMKCl，pH7.4）。
6. 免疫共沉淀缓冲液：例如，含50 mM Tris-HCl（pH7.4）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、0.5% NP-40、5%甘油。
7.带有亲和树脂的免疫沉淀缓冲液：例如，蛋白A或蛋白G亲和树脂结合的PBS。
二、细胞处理和蛋白质提取1.培养细胞：将细胞培养在合适的培养基中，并在37℃、5%CO2的培养箱中培养至适当的细胞数。
2.细胞刺激：根据实验需要，将细胞进行刺激处理，如药物刺激、细胞因子刺激等。
3.细胞裂解：将培养的细胞用蛋白提取缓冲液裂解，放在冰上离心，使细胞溶解并得到细胞裂解液。
4.蛋白质含量测定：使用BCA或其他合适的方法测定细胞裂解液中蛋白质的含量。
三、制备免疫复合物1.免疫数据：将所需的抗体预先装载到蛋白A或蛋白G亲和树脂上。
2.预清洗亲和树脂：将亲和树脂与免疫共沉淀缓冲液混合，使其均匀混合，然后以适当的速度离心，去除上清液。
3.免疫共沉淀：将适当量的蛋白质样品加入预清洗的亲和树脂和免疫共沉淀缓冲液中，使其充分混合，并以适当的速度旋转培养，使抗体与目标蛋白结合形成免疫复合物。
4.温和洗涤：使用免疫共沉淀缓冲液轻轻洗涤免疫复合物，以去除非特异性结合的蛋白质。
四、蛋白质沉淀1.洗涤亲和树脂：使用洗涤缓冲液多次洗涤亲和树脂，以去除非特异性结合的蛋白质。
说明书（CO-IP26149）Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒 261492181.6 描述26149 Pierce 免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒，包含足够进行 50 次免疫沉淀反应的试剂（每次使用 25ul 树脂固相化抗体）试剂盒组分：加强型AminoLink偶联树脂，2 mL 固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100ul 50%的浆液含有50ul固相树脂）20×交联缓冲液，25mL，使用时稀释至：0.01M Na ，0.15MNaCl；pH 7.2氰基硼氢化钠溶液（5 M），0.5 mL淬灭缓冲液，50 mL ，1M Tris-HCl洗涤缓冲液，60 mL，1M NaClIP 裂解/洗涤缓冲液，2 50mL，0.025MTris，0.15M NaCl，0.001M EDTA，1% NP-40，5%甘油；pH 7.4改良型杜氏PBS （20×），25mL，使用时稀释至：0.008M Na 、0.14MNaCl、0.01M KCl；pH7100×条件缓冲液，5mL，中性pH 缓冲液洗脱缓冲液，50 mL，pH 2.8，含有伯胺非还原型泳道标记上样缓冲液，（5×），5 mL，0.3M Tris•HCl，5% SDS，50%甘油，泳道标记示踪染料；pH 6.8Pierce 离心柱-带螺帽，100 个柱子，包含相应配件微量离心收集管，2 mL，100个微量离心样品管，1.5mL，50个Pierce对照用琼脂糖树脂（4％琼脂糖珠交联），2 mL 固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100ul50%的浆液含有50ul的固相树脂）干燥保存。
常温运输。
产品简介 Thermo Scientific Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒通过将纯化的抗体直接固定在琼脂糖基质上，从细胞裂解液或其它复杂混合物中分离天然蛋白复合体。
免疫共沉淀是研究蛋白:蛋白相互作用的一种常用方法，即用抗体去免疫沉淀特定抗原（诱饵蛋白）并且共沉淀任何与该抗原相互作用的蛋白（目标蛋白）。
免疫沉淀免疫共沉淀免疫沉淀和免疫共沉淀是常用的免疫学实验技术，用于检测蛋白质间的相互作用以及蛋白质的表达水平。
本文将分别介绍免疫沉淀和免疫共沉淀的原理、步骤和应用。
一、免疫沉淀免疫沉淀是通过抗体的高选择性与目标蛋白质结合，再利用沉淀剂将抗体和结合的蛋白质分离出来。
其原理是利用抗体与抗原的特异性结合，形成免疫复合物，并通过沉淀剂使复合物从溶液中沉淀下来。
免疫沉淀的步骤如下：1. 准备样品：将待测蛋白质提取出来并进行预处理，如裂解细胞、去除细胞碎片等。
2. 结合抗体：将抗体与待测蛋白质进行孵育，使其发生特异性结合。
3. 沉淀复合物：加入沉淀剂（如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G磁珠），使免疫复合物沉淀下来。
4. 去除上清：将上清去除，保留沉淀的免疫复合物。
5. 洗涤：通过洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。
6. 脱离抗体：使用洗涤缓冲液将免疫复合物与抗体分离开。
7. 分析：将沉淀的免疫复合物进行后续分析，如Western blot、质谱等。
免疫沉淀的应用：1. 确定蛋白质间的相互作用：通过沉淀目标蛋白质及其相互作用的蛋白质，可以鉴定蛋白质间的相互作用关系。
2. 鉴定蛋白质的修饰：通过沉淀修饰蛋白质及其相关蛋白质，可以鉴定蛋白质的翻译后修饰。
3. 确定蛋白质的表达水平：通过沉淀目标蛋白质及其相关蛋白质，可以确定目标蛋白质的表达水平。
二、免疫共沉淀免疫共沉淀是在免疫沉淀的基础上进行的一种技术，旨在检测蛋白质与其他分子（如蛋白质、RNA）之间的相互作用。
其原理是利用抗体与目标蛋白质结合，再利用沉淀剂将抗体、目标蛋白质以及与其相互作用的分子沉淀下来。
免疫共沉淀的步骤如下：1. 准备样品：将待测蛋白质提取出来并进行预处理，如裂解细胞、去除细胞碎片等。
2. 结合抗体：将抗体与待测蛋白质进行孵育，使其发生特异性结合。
3. 沉淀复合物：加入沉淀剂，使免疫复合物及其相互作用的分子沉淀下来。
4. 去除上清：将上清去除，保留沉淀的免疫复合物及其相互作用的分子。
说明书Pierce®免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒26149 2181.6货号描述26149 Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒，包含足够进行50次免疫沉淀反应的试剂（每次使用25 μL树脂固相化抗体）试剂盒组分：加强型AminoLink®偶联树脂，2 mL固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100 μL 50%的浆液含有50 μL固相树脂）20×交联缓冲液，25 mL，使用时稀释至：0.01M Na3PO4，0.15M NaCl；pH 7.2氰基硼氢化钠溶液（5 M），0.5 mL淬灭缓冲液，50 mL ，1M Tris-HCl洗涤缓冲液，60 mL，1M NaClIP裂解/洗涤缓冲液，2 × 50mL，0.025M Tris，0.15M NaCl，0.001M EDTA，1% NP-40，5%甘油；pH 7.4改良型杜氏PBS （20×），25mL，使用时稀释至：0.008M Na3PO4、0.002M K3PO4、0.14M NaCl、0.01M KCl；pH 7100×条件缓冲液，5 mL，中性pH缓冲液洗脱缓冲液，50 mL，pH 2.8，含有伯胺非还原型泳道标记上样缓冲液，（5×），5 mL，0.3M Tris•HCl，5% SDS，50%甘油，泳道标记示踪染料；pH 6.8Pierce离心柱-带螺帽，100个柱子，包含相应配件微量离心收集管，2 mL，100个微量离心样品管，1.5 mL，50个Pierce对照用琼脂糖树脂（4％琼脂糖珠交联），2 mL固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100 μL 50%的浆液含有50 μL固相树脂）储存：收到试剂盒后将其储存于4°C。
将DSS于4°C干燥保存。
常温运输。
产品简介Thermo Scientific Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒通过将纯化的抗体直接固定在琼脂糖基质上，从细胞裂解液或其它复杂混合物中分离天然蛋白复合体。
免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
说明书Pierce™交联磁珠式免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒888052309.4货号描述88805 Pierce交联磁珠式免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒，包含足够完成40个反应的试剂，每个反应使用25 µL磁珠试剂盒组成:Pierce 蛋白 A/G 磁珠1 mL，贮存于含有 0.05% NaN3的水中，浓度为10 mg/mLPierce 免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液，2 × 50 mL，pH 7.4，0.025M Tris，0.15M NaCl，0.001M EDTA，1% NP40，5% 甘油20×交联缓冲液，25 mL, 稀释后含10 mM 磷酸钠， 150 mM NaCl；pH 7.2DSS（辛二酸二琥珀酰亚胺酯），No-Weigh™形式， 8 × 2 mg 微型管中和液，1.0 mL，pH 8.5洗脱液，25 mL，pH 2.0电泳上样缓冲液，非还原性，（5×）, 5 mL，pH 6.8，0.3M Tris·HCl，5% SDS，50%甘油，泳道标记示踪染料贮存条件：收到本产品后于4°C贮存。
冰盒运输。
目录产品简介 (2)流程简述 (2)重要产品信息 (2)所需额外试剂和仪器 (3)Pierce经典磁珠式免疫沉淀试剂盒流程 (3)A. 将抗体结合于蛋白A/G磁珠上 (3)B. 交联结合的抗体 (4)C．哺乳动物细胞裂解 (4)D. 手动抗原免疫沉淀 (5)E. 自动免疫沉淀 (5)问题解决 (7)网站附加信息 (7)Thermo Scientific KingFisher 仪器的常见问题 (8)Thermo Scientific相关产品 (8)产品简介Thermo Scientific™ Pierce™ 交联磁珠式免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒通过共价键将抗体交联于Thermo Scientific™ Pierce™ 蛋白 A/G磁珠上能够高效完成抗原免疫沉淀（IP）及免疫共沉淀（Co-IP）实验。
说明书Pierce®免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒26149 2181.6货号描述26149 Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒，包含足够进行50次免疫沉淀反应的试剂（每次使用25 μL树脂固相化抗体）试剂盒组分：加强型AminoLink®偶联树脂，2 mL固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100 μL 50%的浆液含有50 μL固相树脂）20×交联缓冲液，25 mL，使用时稀释至：0.01M Na3PO4，0.15M NaCl；pH 7.2氰基硼氢化钠溶液（5 M），0.5 mL淬灭缓冲液，50 mL ，1M Tris-HCl洗涤缓冲液，60 mL，1M NaClIP裂解/洗涤缓冲液，2 × 50mL，0.025M Tris，0.15M NaCl，0.001M EDTA，1% NP-40，5%甘油；pH 7.4改良型杜氏PBS （20×），25mL，使用时稀释至：0.008M Na3PO4、0.002M K3PO4、0.14M NaCl、0.01M KCl；pH 7100×条件缓冲液，5 mL，中性pH缓冲液洗脱缓冲液，50 mL，pH 2.8，含有伯胺非还原型泳道标记上样缓冲液，（5×），5 mL，0.3M Tris•HCl，5% SDS，50%甘油，泳道标记示踪染料；pH 6.8Pierce离心柱-带螺帽，100个柱子，包含相应配件微量离心收集管，2 mL，100个微量离心样品管，1.5 mL，50个Pierce对照用琼脂糖树脂（4％琼脂糖珠交联），2 mL固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100 μL 50%的浆液含有50 μL固相树脂）储存：收到试剂盒后将其储存于4°C。
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产品简介Thermo Scientific Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒通过将纯化的抗体直接固定在琼脂糖基质上，从细胞裂解液或其它复杂混合物中分离天然蛋白复合体。
说明书（CO-IP26149）Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒 261492181.6 描述26149 Pierce 免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒，包含足够进行 50 次免疫沉淀反应的试剂（每次使用 25ul 树脂固相化抗体）试剂盒组分：加强型AminoLink偶联树脂，2 mL 固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100ul 50%的浆液含有50ul固相树脂）20×交联缓冲液，25mL，使用时稀释至：0.01M Na ，0.15MNaCl；pH 7.2氰基硼氢化钠溶液（5 M），0.5 mL淬灭缓冲液，50 mL ，1M Tris-HCl洗涤缓冲液，60 mL，1M NaClIP 裂解/洗涤缓冲液，2 50mL，0.025MTris，0.15M NaCl，0.001M EDTA，1% NP-40，5%甘油；pH 7.4改良型杜氏PBS （20×），25mL，使用时稀释至：0.008M Na 、0.14MNaCl、0.01M KCl；pH7100×条件缓冲液，5mL，中性pH 缓冲液洗脱缓冲液，50 mL，pH 2.8，含有伯胺非还原型泳道标记上样缓冲液，（5×），5 mL，0.3M Tris•HCl，5% SDS，50%甘油，泳道标记示踪染料；pH 6.8Pierce 离心柱-带螺帽，100 个柱子，包含相应配件微量离心收集管，2 mL，100个微量离心样品管，1.5mL，50个Pierce对照用琼脂糖树脂（4％琼脂糖珠交联），2 mL 固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100ul50%的浆液含有50ul的固相树脂）干燥保存。
常温运输。
产品简介 Thermo Scientific Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒通过将纯化的抗体直接固定在琼脂糖基质上，从细胞裂解液或其它复杂混合物中分离天然蛋白复合体。
免疫共沉淀是研究蛋白:蛋白相互作用的一种常用方法，即用抗体去免疫沉淀特定抗原（诱饵蛋白）并且共沉淀任何与该抗原相互作用的蛋白（目标蛋白）。
免疫共沉淀实验技术（IP）一、原理：IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
1、实验仪器：高速组织捣碎机：SWISS KINEMATIC Ltd. Co（型号：PT1600E）电泳仪：北京六一仪器厂（型号：DYY-8C）电泳槽：北京六一仪器厂（型号：DYCZ-24D）转印槽：北京六一仪器厂（型号：DYCZ-40D）低温高速离心机：Sigma 公司（型号：Sigma 2-16k）超低温冰箱：SANYO（型号：MDF-382E）分光光度计：上海尤尼柯（型号：WFZ-UV-2000）脱色摇床：上海琪特分析仪器有限公司（型号：STS-2）2、主要试剂：HRP标记山羊抗小鼠二抗：北京中山（货号：ZB-2305）蛋白质预染分子量marker：FermentasA蛋白-sepharose珠：Pharmacia Biotech公司产品NC膜：Millipore公司（型号：0.45um）化学发光底物底物：PIERCE公司电泳类生化试剂均为美国amresco公司产品其他生化试剂为国药集团上海化学试剂公司产品总蛋白测定试剂盒：南京建成生物工程研究所二、操作流程1、样品准备1）取细胞加入500μl上样Buffer(无溴酚蓝)和50ul 10mg/ml PMSF，混匀，超声波破碎细胞2）4℃，12000rpm离心10min3）取上清夜，-70℃冻存24hr5）4℃12000rpm再次离心10min，取上清分装，一份用于定蛋白，另一份加入溴酚蓝(0.1%(W/V))后于100℃加热4min，后于-20℃保存待用。
2、定蛋白及计算电泳上样量根据总蛋白测定试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量，电泳上样量定为40ug3、免疫沉淀1）准备A蛋白-Sepharose珠：用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠2）准备A蛋白-Sepharose珠.一抗复合物：按每50 μl A蛋白-Sepharose珠中加入10ul 一抗，4℃孵育1 h，8000rpm离心5 min，PBS洗涤3次，加50ulPBS3）取100 μg总蛋白，加入50ul A蛋白-Sepharose珠.一抗复合物，4℃轻摇2h，PBS洗涤3次，之后加入50ul 1×SDS凝胶上样缓冲液，100℃变性3 min，以游离抗原、抗体、珠子，8000 rpm室温离心5 min，蛋白上清储于-20℃备用。
免疫共沉淀实验方法与操作步骤免疫共沉淀（Immuno-precipitation，简称IP）是一种用于研究蛋白质间相互作用的分子生物学技术。
该技术主要通过将抗体与蛋白质结合，然后利用纯化方法将其他与该蛋白质相互作用的蛋白质一起沉淀下来。
以下是免疫共沉淀实验的方法和操作步骤：实验方法：1.设计实验：首先要明确要研究的目标蛋白质的特性，选择合适的实验条件和抗体。
2.制备样品：提取和纯化目标蛋白质样品，可以使用细胞裂解、分离技术等方法获得纯度较高的样品。
3.选择抗体：根据目标蛋白质的性质和已有的文献，选择合适的抗体。
可以选择专一性较高的单克隆抗体，或使用多个抗体以增加实验结果的可靠性。
4.交联抗体：使用足够浓度的亲和素，将抗体与纯化的亲和素交联。
5.准备阻断物：阻断物可以用于防止非特异性结合，在进行共沉淀实验时添加适量的BSA、奶粉等阻断物。
6.制备阳性对照：在同一实验中添加阳性对照，以验证实验的可行性及抗体的有效性。
7.孵育样品：将目标蛋白质样品与抗体复合物孵育在特定的缓冲液条件下，通常需要孵育12至24小时，以确保充分的结合。
8.添加亲和素：添加与抗体结合的亲和素（如蛋白A、蛋白G等），使抗原-抗体结合物与亲和素结合。
9.沉淀抗原-抗体复合物：通过添加亲和素的磁珠、琼脂糖或琼脂脂球等材料，将抗原-抗体复合物沉淀下来。
10.洗涤：使用高浓度的洗涤缓冲液，将非特异性结合和杂质物质洗掉。
11.洗涤完毕后，用洗涤缓冲液再洗30s,然后将磁珠用有效药液（如样本缓冲液）悬浮。
12.洗涤和沉淀：重复洗涤步骤2至3次以增加纯度，然后使用洗涤缓冲液将沉淀的样品转移到新的离心管中。
13.洗涤完毕后，去除冗余的缓冲液。
14.脱附和洗脱：使用脱附缓冲液将目标蛋白质从磁珠上脱附下来。
15.分析和检测：将洗脱的蛋白质样品用于Western blotting、质谱分析等方法进行进一步的研究和检测。
操作步骤：1.将目标蛋白质样品溶解在特定的细胞裂解缓冲液中，并在冰上孵育30分钟。
免疫共沉淀（GE Immunoprecipitation Starter Pack）(一)基本原理研究细胞内蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术，其基本原理是，当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保存了下来，这时在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体FC片段特异性结合的结合于Agarose珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A/G(其亲和力对pH值非常敏感，随pH值的降低而急剧降低)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A/G PLUS-Agarose”，经沸水浴，复合物中的四组分又被分开。
然后经Western blotting检测目的蛋白是否为预测蛋白。
这种方法的优点是：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用的蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
（二）实验方法免疫共沉淀的实验过程比较简单，分为三个阶段：a.细胞裂解液的制备；b.细胞裂解液非特异性本底的预处理；c.免疫复合物的形成与纯化。
1. 10cm培养皿培养细胞，实验当天细胞约长满80–90%。
2. 吸除细胞培养液，用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS。
3. 加入1ml预冷的包含1×Protease Inhibitor Cocktail（Roche）的细胞裂解液，4℃孵育10-15min，不时敲击10cm培养皿壁。
4.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿上刮下来后将裂解液转移至预冷1.5mlEP管。
免疫共沉淀具体实验步骤(免疫共沉淀,实验步骤,琼脂糖,蛋白)2016-02-21 22:58:28 来源：<ahref="/" target="_blank"></a>琼脂糖蛋白免疫共沉淀实验步骤抗体相互作用免疫血清标题: 免疫共沉淀具体实验步骤(免疫共沉淀,实验步骤,琼脂糖,蛋白)摘要: [免疫共沉淀具体实验步骤(免疫共沉淀,实验步骤,琼脂糖,蛋白)] 各位大侠好，最近我在做肿瘤的一个蛋白的相互作用，想利用免疫共沉淀技术去寻找与这个蛋白有相互作用的蛋白质，但是在具体操作上有些疑问：1、我一次性收集的细胞，大约0 5ML，需要加多少裂解液（RIPA+PMSF）；2、Protein G琼脂糖珠（已分装）的预处理；3、是否需要将总蛋白用非免疫血清和琼脂糖珠反应，去除非特异性结合蛋白，再来加抗体，接着加琼脂糖珠。
如果需要先处理非特异性结合蛋白，那么这里的关键词:[琼脂糖蛋白免疫共沉淀实验步骤抗体相互作用免疫血清]……关键词: 琼脂糖蛋白免疫共沉淀实验步骤抗体相互作用免疫血清各位大侠好，最近我在做肿瘤的一个蛋白的相互作用，想利用免疫共沉淀技术去寻找与这个蛋白有相互作用的蛋白质，但是在具体操作上有些疑问：1、我一次性收集的细胞，大约0.5ML，需要加多少裂解液（RIPA+PMSF）；2、Protein G琼脂糖珠（已分装）的预处理；3、是否需要将总蛋白用非免疫血清和琼脂糖珠反应，去除非特异性结合蛋白，再来加抗体，接着加琼脂糖珠。
如果需要先处理非特异性结合蛋白，那么这里的非免疫血清，就是我的阴性对照的抗体（正常鼠IgG）吗？如果不需要处理非特异性结合蛋白，那么是直接在总蛋白里加抗体，孵育后再加琼脂糖珠，继续孵育，去上清，收集复合物，加上样缓冲液是复合物悬浮，100度煮5分钟，离心，收集上清，进行电泳。
染色质免疫共沉淀ChIP中文操作流程1.细胞中加入1%的甲醛，8ml的培养液加入216 ul的甲醛，37度十分钟。
2.配制含有蛋白酶抑制剂的PBS 20 ml和含有蛋白酶抑制剂的SDS溶液1ml3.将细胞拿出来，迅速的移除含甲醛的培养基，加入含蛋白酶抑制剂的PBS洗两遍。
胰酶消化20秒，加入含蛋白酶抑制剂的PBS 1ml。
用细胞刮刀把细胞刮下，收集到1.5ml 的离心管里面。
4.4度2000rpm离心10min，弃上清液，加入200ul含蛋白酶抑制剂的ＳＤＳ溶液。
吹打重悬细胞，冰上孵育１０分钟。
5.超声切割ＤＮＡ，总切割时间４min30sec，超声10sec,间隙10sec。
6.4度13000rpm离心10min，转移上清液到一个新的2ml的离心管，弃沉淀。
7.稀释超声后的上清液到10X的CHIP稀释液，200ul的上清液加入1.8ml的CHIP稀释液，达到最终体积2ml。
8.为去除非特异性，加入75ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，4度旋转30分钟。
9.1000rpm离心3min沉淀Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，收集上清液。
10.上清液加入1抗，4度振荡过夜。
11.加60ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，沉淀抗体/抗原复合物，4度旋转一小时。
12.1000rpm 4度3min收集沉底，移除上清液，开始洗脱过程。
13.低盐免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀14.高盐免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀15.Licl免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀16.TE Buffer，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀，两次17.现在得到的是protein A/antibody/histone/DNA complex，新制备elution buffer (1%SDS,0.1M NaHCO3)。
1免疫共沉淀一、实验原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP），是利用抗原A 与蛋白B 结合，通过A 的抗体（钥匙）沉淀A （锁），再利用精制的prorein A/G （钥匙链）预先结合到磁珠上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，磁珠上的prorein A/G 就能吸附抗原，从而获得抗原A 与蛋白B 的复合体，之后就可以对B 进行检测，从而获得蛋白质与蛋白质相互作用的信息。
二、Co-IP 标准化操作流程样品裂解（裂解液）→样品的预纯化（normal IgG/微珠）→与目标蛋白抗体共孵育（IP 抗体、Normal IgG ）→免疫共沉淀（微珠）→微珠清洗（裂解液）→洗脱→WB 分析或其他分析（WB/一抗、二抗）（一）样品裂解 1.温和裂解（1）温和的裂解液进行裂解，常用的去垢剂成分：NP-40、TritonX-100、IGEPAL CA-630、CHAPS ；（2）成品buffer ；（3）添加蛋白酶抑制剂（防止蛋白被降解）。
2.样本制备流程（1）去掉培养基，用冰PBS 清洗一次。
2（2）去掉PBS，每个板（10cm ）中加0.5mL 冰预冷的1×细胞裂解液，在冰上孵育5min 。
（3）将所有细胞刮下，收集到离心管，置于冰上。
（4）冰浴中对样品用超声处理3次，每次5s 。
（此步骤对膜蛋白提取有较好作用） （5）4 ℃，14000g 离心10min ，将上清转移到新的离心管中，即为细胞裂解物。
（6）BCA 测定浓度。
3.注意事项（1）整个过程冰上操作。
（2）IP 样本一般建议新鲜制备并立即使用，如有需要，可保存在-80 ℃。
（二）预纯化 1.阴性对照的选择与IP 抗体同源同型（亚型）的抗体：如 Rabbit IgG ；Mouse IgG1等。
取与IP 实验等量的裂解液，使用Isotype Control 孵育；与IP 抗体孵育同时进行。
2.Isotype Control 选择3.预纯化的目的（1）减少裂解混合物中的非特异性蛋白的含量。
Pierce® Co-Immunoprecipitation (Co-IP) Kit（26149）中文说明书介绍：Thermo 公司的Pierce®免疫共沉淀试剂盒，可通过将铆钉抗体固定在琼脂糖支撑物上，从裂解液中或其他复杂混合物中，分离出天然蛋白复合物。
Co-IP是一种研究蛋白与蛋白相互作用通用的方法，该方法使用一种诱饵蛋白与抗原进行免疫沉淀反应，然后可通过免疫共沉淀任何与诱饵蛋白具有相互作用的猎物蛋白。
传统的Co-IP方法使用蛋白A或G共同洗脱抗体的重链和轻链，这很可能导致将相关的蛋白一起洗脱下来，掩盖一些重要的结果。
Pierce®免疫共沉淀试剂盒通过将共价结合抗体固定在一个胺类活性反应树脂上解决了这一问题。
该试剂盒包含足够的用于蛋白结合和恢复的缓冲液，完成对照试验的高校离心柱和收集管，这些产品进一步缩短了操作实验的时间。
重要产品信息：略Co-IP实验步骤：A.抗体固定注意：以下试验步骤是针对用无胺和其他载体蛋白稀释的10-75μg亲和纯化抗体（参考重要产品信息一节）。
根据实际使用比例参考这一协议步骤。
参考重要产品信息节表1中的建议抗体用量和树脂体积用量。
1.室温平衡胺连接耦合树脂（AminoLink®Plus Coupling Resin）和试剂；2.为每个Co-IP反应准备2ml 1×Coupling Buffer（超纯水稀释20×Coupling Buffer）；3.轻轻涡旋混匀装有AminoLink®Plus Coupling Resin的瓶子，使其处于悬浮状态。
使用大口径（或剪掉一段枪头端），添加50μl树脂悬液到Pierce提供的离心柱中，将离心柱放入微量离心管中，1000g离心1min，弃滤液；4.添加200μl 1×Coupling Buffer 清洗树脂2次，离心弃滤液；5.将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱底部，去除剩余的液体，插上底塞；6.准备10-75μg亲和纯化抗体用于结合蛋白，调整体积至200μl，使用足够的超纯水和20×Coupling Buffer来制备1×Coupling Buffer。
例如：添加10μl 20×Coupling Buffer，180μl超纯水和10μl浓度为1μg/μl。
可直接添加含有超纯水、20×Coupling Buffer、亲和纯化抗体的树脂在离心柱中。
7.在通风厨中，每200μl反应体系，添加3μl氰基硼氢化钠溶液；注：氰基硼氢化钠属剧毒物质，操作时要小心并穿戴防护服。
8.拧紧离心柱上螺帽，室温涡旋孵育90-120min，确保浆体在孵育过程中处于悬浮状态；9.握紧底塞，拧开并拿走螺帽，将离心柱置于收集管中离心，保存滤液以便验证抗体耦合；10.打开螺帽，添加200μl 1×Coupling Buffer，离心弃滤液，重复此步骤1次；11. 向离心柱中添加200μl Quenching Buffer，离心弃滤液；12. 将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱底部，去除残留液体，插上底塞。
在树脂上添加200μl Quenching Buffer；13. 在通风厨中，添加3μl氰基硼氢化钠溶液，拧紧螺帽；轻轻摇动并孵育15min；14.取出底塞，拧开螺帽，将离心柱置于一收集管中，离心弃滤液；15.打开螺帽，采用200μl 1×Coupling Buffer洗脱树脂，离心。
再次重复此步骤；16.用150μl Wash Solution洗脱树脂6次，每次洗脱后离心；17.不管是进行细胞裂解、Co-IP，还是储存树脂，都需要继续进行下列步骤；18.用200μl 1×Coupling Buffer洗脱树脂2次，每次需离心；19. 将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱，去除残留液体，并插入离心柱底部。
添加200μl 1×Coupling Buffer，系上螺帽，将离心柱置于4℃保存。
如果长期储存，需添加sodium azide（叠氮化钠）至终浓度为0.02%。
B. 哺乳动物细胞裂解方案I：单层培养细胞的裂解1.小心从细胞中弃掉培养基；2.采用Modified Dulbecco’s PBS（改良型Dulbecco PBS缓冲液）清洗细胞1次；3.向细胞中添加冰冷的IP Lysis/Wash Buffer（表2），冰上孵育5min，期间进行周期性混匀。
4.转移溶解物于1个微量离心管中，13000g离心10min ，以便将细胞碎片制成微球；5.转移上层于1个新的离心管用于测定蛋白浓度或进一步的分析实验。
方案II：悬浮培养细胞的裂解1.1000g 离心细胞悬液5min，收集细胞团，弃上层；2.用PBS清洗细胞，使细胞团悬浮起来，1000g 离心5min收集细胞；3. 向细胞团中添加冰冷的IP Lysis/Wash Buffer；每50mg湿的细胞团使用500μl IP Lysis/Wash Buffer（10：1 v/w）。
如果使用大量的细胞，首先向细胞团中加入终体积为10%的IP Lysis/Wash Buffer，移液器上下吹打混匀混合物，再向细胞悬液中加入剩余体积的IP Lysis/Wash Buffer；4.冰上5min，孵育溶解产物，期间周期性摇荡；13000g离心10min去除细胞残渣。
转移上清于新的离心管中，用于蛋白质浓度测定或其他分析实验。
C. 使用对照组琼脂糖树脂预澄清裂解物5.对于1mg的裂解物，添加80μl的对照组琼脂糖树脂（40μl的固定树脂）悬浮液到离心柱中；6.离心柱子，以去除存储液；7. 添加100μl 1×Coupling Buffer于柱中，离心弃掉滤液；8.添加1mg裂解物于含有树脂的离心柱中，4℃孵育30min-1h;9.1000g 离心柱子1min，弃掉含有树脂的柱子，保存滤液，它们将被添加到已固定化的抗体中，用于Co-IP实验。
D. Co-IP所有的Co-IP 实验步骤均在4℃下完成，除非另有说明。
诱饵的数量：如猎物蛋白复合体的要求、孵育时间，这些都依赖于体系的使用、抗体的亲和力、诱饵与猎物的相互作用，而且每个体系必须是最佳化的。
此方案使用IP Lysis/Wash Buffer来耦合和洗涤免疫复合体。
试剂盒中提供的20×Modified Dulbecco’s PBS是一个选择性的结合/洗涤缓冲液。
使用这种缓冲液3作用于复合物，复合物有可能会被洗涤剂破坏。
对于每一个Co-IP反应，需要提前用超纯水稀释2ml 1×Modified Dulbecco’s PBS；1.如果互作蛋白是分离的，首先混合诱饵蛋白和猎物蛋白，并准备好合理的实验对照组；2.稀释诱饵蛋白：猎物蛋白混合物和对照组使用IP Lysis/Wash Buffer或者其他适当的缓冲液稀释。
加入离心柱中的总样品体积建议为100-500μl；3.添加200μl IP Lysis/Wash Buffer到含有抗体耦合树脂的离心柱中，清洗2次，离心弃滤液；4. 将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱，去除残留液体，并插上底塞；5.添加诱饵蛋白：添加猎物蛋白复合物和对照组至合适的树脂中。
拧紧螺帽，4℃轻轻震荡孵育1-2h，或者过夜；注：优化每一次的结合时间可能是很有必要的。
对于大样品体积，建议转移抗体耦合的树脂至一个分开的含有蛋白复合物的离心管中。
孵育结束后，通过旋转杯分成0.5ml整数倍进行离心，直到全部样品被处理完。
6.移开底塞，松开螺帽，将柱子置于收集管中。
离心，保存滤液以备后续实验分析用；7.打开螺帽，将柱子置于一新的离心管中，添加200μl IP Lysis/Wash Buffer，离心；8.用200μl IP Lysis/Wash Buffer清洗样品至少2次，每次清洗完需离心；注：针对一些特殊的体系，采用A280，SDS-PAGE or Thermo Scientific Micro BCA Protein Assay评价洗脱液的蛋白含量，目的是确定最佳洗脱次数。
在Co-IP实验中，最终的洗脱液中应该没有蛋白；对于样品中含有高蛋白浓度的洗脱液，增加洗脱次数或许是非常必要的。
E. Co-IP的洗脱注：如果蛋白或者抗体对低pH值比较敏感，使用中性pH值体系（如：Thermo Scientific Gentle Elution Buffer, Product No. 21027）。
针对下游酶催化或功能测定实验，应添加1M pH为9.5的Tris 5μl到收集管中，这将中和洗脱液的pH值，在基础上在进行离心分离。
1.将离心柱放入一新的收集管中，添加10μl的洗脱液，离心；2.不要取出柱子，继续向柱子中加入50μl洗脱液，室温孵育5min。
柱子不需要扣上盖子或者混匀；注：为了获得浓度更高的洗脱产物，可使用少量的洗脱液，但是总产量可能会降低。
3.离心收集滤液，分析滤液中的蛋白含量。
再次进行D1-D3步骤是非常必要的。
从每次离心后的滤液中取出一小部分，分别进行检测分析，以确保抗原完全被洗脱下来。
4.为了保持抗体耦合树脂的活性，需即可进行F步骤：树脂的再生与储存。
F.树脂的再生与储存1. 添加100μl 1×Coupling Buffer于柱中，离心弃掉滤液，重复此步骤1次；2.将底塞放回离心柱上，向离心柱中添加200μl 1×Coupling Buffer，盖上螺帽。
用封口膜封住离心管底部，以防止树脂干燥。
如果是长期储存（比如大于2周），需添加终浓度为0.02%的叠氮化钠。
G.关于SDS-PAGE分析的样品准备1.室温平衡5×Lane Marker Sample Buffer，缓慢上下颠倒样品缓冲液5-10次。
为缩短凝胶时间，添加1M DTT于5 ×Sample Buffer中，使终浓度至100mM。
2.添加5×Sample Buffer至样品中，制成1×的终浓度（如：添加5μl5×Sample Buffer到 20μl的样品中）；3.95-100℃加热样品5min，在加样前，可将样品置于室温中冷却。
