免疫共沉淀步骤

蛋白质免疫共沉淀步骤
蛋白质免疫共沉淀是一种用于检测蛋白质相互作用的实验方法，其步骤通常包括以下几个方面：
1. 样品制备，首先需要准备含有目标蛋白质的样品，可以是细
胞提取物或者纯化的蛋白质溶液。

样品需要经过适当的处理，比如
离心、裂解等，以提取目标蛋白质。

2. 抗体结合，将目标蛋白质的抗体固定在载玻片、琼脂糖珠或
磁珠等固相载体上，形成免疫复合物。

3. 共沉淀，将制备好的抗体-蛋白质复合物与样品混合，允许
它们发生特异性结合，形成免疫共沉淀复合物。

4. 洗涤，对免疫共沉淀复合物进行洗涤，以去除非特异性结合
的蛋白质和其他杂质。

5. 蛋白质溶解，将免疫共沉淀复合物溶解于适当的缓冲液中，
以便后续的分析。

6. 分析，最后，可以使用Western blot、质谱分析、酶联免疫吸附实验（ELISA）等技术对共沉淀的蛋白质进行检测和分析。

这些步骤可以帮助研究人员确定目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用，从而揭示细胞信号传导、蛋白质复合物组装等重要生物学过程。

同时，在进行蛋白质免疫共沉淀实验时，需要严格控制实验条件，选择合适的抗体以及适当的质控措施，以确保实验结果的准确性和可重复性。

免疫共沉淀实验原理及详细步骤免疫沉淀（immunoprecipitation，简称IP）是一种广泛应用于生物学和生物化学研究中的实验方法，用于检测和分离复合物中的特定蛋白质。

它结合了特异性抗体与蛋白质-抗体相互作用的原理，利用抗体选择性地沉淀出目标蛋白质，并与其相关的复合物。

本文将详细介绍免疫共沉淀实验的原理及步骤。

免疫共沉淀实验利用抗体与目标蛋白质相互结合的特异性，通过该特异性结合，将目标蛋白质及其相关的复合物选择性地沉淀出来。

该实验主要包括以下几个步骤：1.抗体与抗原的结合：在实验中，需要选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。

2.抗体与蛋白质-抗体复合物的沉淀：将抗体结合的蛋白质与复合物从样本中沉淀。

3.洗涤：洗涤沉淀的复合物，去除非特异性结合的蛋白质和杂质。

4.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。

1.细胞预处理：在进行免疫共沉淀实验之前，需要将细胞或组织进行必要的处理，例如刺激剂的刺激或疾病模型的建立。

可以选择不同条件下的实验处理组和对照组进行对比。

同时，还需要对实验样本进行适当的裂解，以确保目标蛋白质的充分释放。

2.抗体选择：选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。

抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，也可以是特异性抗体。

此外，需要选择适当的免疫沉淀试剂盒，确保实验的准确性。

3.抗原结合：将适当的抗体与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。

这一步骤可以在实验前进行或将其加入样本中进行。

为确保抗原-抗体结合的充分性，可以进行一定的反应时间和反应温度。

4.免疫沉淀：将抗原-抗体复合物选择性地沉淀出来。

可以采用多种方法进行免疫沉淀，例如蛋白A/G琼脂糖，特效筛选柱等。

通过离心或过滤等方式从沉淀中收集复合物。

5.洗涤：洗涤步骤用于去除非特异性结合的蛋白质和杂质。

洗涤液的组成可以根据实验需要进行调整。

洗涤步骤需要进行多次，确保洗涤得到干净的复合物。

6.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。

免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）原理：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）步骤：
✧配制100 ml 的modified RIPA buffe：
✧称取790 mg 的Tris-Base，加到75 ml 去离子水中，加入900
mg 的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl 调节PH 值到7.4；
✧加10 ml 10% 的NP-40；
✧加2.5 ml 10% 的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清；
✧加1 ml 100 mM 的EDTA，用量筒定容到100 ml，2～8 ℃保
存；
✧理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑
蛋白酶肽，亮抑酶肽, 胃蛋白酶抑制剂各100 μl；PMSF，Na3VO4，NaF 各500 μl），但是PMSF 在水溶液中很不稳定，
30 分钟就会降解一半，所以PMSF 应该在使用前现加，其他抑
制剂成分可以在水溶液中稳定 5 天。

Co-IP实验步骤
一、制备细胞样品
1.10cm盘细胞用PBS清洗两次，加入1mL RIPA裂解液和10μL PMSF
（100mM稀释至1mM）；
2.充分混匀吹打后，冰上裂解4h，充分吹打吸入1.5mL EP管中，
-80℃保存；
3.取出样品，1200rpm离心10min，取上清弃沉淀，测定蛋白浓度。

二、Co-IP，拉出蛋白
1.每管取出少量蛋白样（15~30μL）作为input；
2.将磁珠充分混匀后，取出50μL于1.5mL EP管中，置于磁力架上，
弃上清。

（有几个样品就准备几管）；
3.加入200μL Ab binding&washing Buffer（可用PBST代替），加入对
应抗体，加入后轻弹混匀，360°混合仪上旋转30min；
4.500rpm离心使管壁液体下来，弃上清，200μL PBS清洗（旋转
5min）；
5.加入1000μg 蛋白样品于EP管中，轻弹混匀，旋转1h，弃上清；
6.加入200μL washing buffer（或PBST）清洗3次；
7.加入100μL washing buffer 悬浮磁珠并将溶液转移至新的EP管中；
8.弃上清，加入6μL 5×loading buffer，24μL Elution buffer（或ddw，
洗脱液）；
9.100℃煮10min，吸取上清；
10.进行WB或SDS-PAGE。

注意事项：
1.标记：样品名+抗体名；
2.抗体上必须标有“IP”字样，有推荐用量；
3.Co-IP中pull down 抗体与WB抗体的来源（M,R）必须不同；
4.PBST=PBS + 0.02% 吐温。

免疫共沉淀实验方法免疫共沉淀实验方法是一种常用的蛋白质相互作用研究方法，通过利用抗体与目标蛋白之间的特异性结合来寻找与目标蛋白相互作用的蛋白质。

下面将详细介绍免疫共沉淀实验方法的步骤和注意事项。

步骤一：制备样品首先需要制备含有目标蛋白的样品，可以是细胞提取物、组织提取物或纯化的蛋白。

样品需要在低温下保存，并在实验前加入适量的蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂以保持蛋白的完整性。

步骤二：制备抗体制备抗体需要选择与目标蛋白特异性结合的抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

抗体需要在低温下保存，并在实验前进行免疫球蛋白纯化和浓度调整。

步骤三：免疫共沉淀实验1. 将制备好的样品加入到含有抗体的蛋白A/G琼脂糖中，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置2小时或过夜。

2. 将混合物加入到预先平衡好的蛋白A/G琼脂糖中，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置2小时或过夜。

3. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。

4. 重复步骤3，洗涤3次。

5. 加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。

6. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。

7. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。

8. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。

9. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。

10. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。

11. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。

12. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。

13. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。

免疫共沉淀操作步骤免疫共沉淀（immunoprecipitation）是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白与其他分子的相互作用。

本文将介绍免疫共沉淀的操作步骤，包括前期准备、取样、免疫共沉淀、洗涤、洗脱和分析结果等。

一、前期准备1. 准备所需试剂：PBS缓冲液（含0.1%的Tween-20）、蛋白质抽提缓冲液（含有适当的蛋白酶抑制剂）、抗体（单克隆或多克隆抗体）、控制组织或细胞苗、蛋白质A/G磁珠等。

2.对样品进行处理：收集样品，如细胞或组织，并用蛋白质抽提缓冲液裂解细胞膜或组织。

3. 确定抗原-抗体反应的条件：进行Western blot或其他实验，确定抗体和目标蛋白的最佳工作浓度和最佳条件。

二、取样1.将裂解的细胞或组织样品通过离心等手段去除细胞碎片和残留的细胞核。

2.将上清液收集到新的离心管中，并测定样品的总蛋白浓度，以便后续计算抗体的用量。

3.根据总蛋白浓度将样品分成相等的小样本，并放入不同的离心管中。

三、免疫共沉淀1.将试验管中的抗体与适量的蛋白质A/G磁珠混合，孵育一段时间，使抗体与磁珠形成固定复合物。

2.将磁珠与固定复合物加入到每个含有样品的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。

3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中，以减少非特异性结合的背景。

4.用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。

5.转移沉淀到新的离心管中，并用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除残留的非特异性结合蛋白质。

四、洗涤1.将磁珠与背景低的洗涤缓冲液混合，孵育一段时间，混匀后在冰上孵育。

2.将磁珠与洗涤缓冲液加入到每个含有沉淀的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。

3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中。

4.用洗涤缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。

五、洗脱1.将洗涤缓冲液去除，加入适量的脱附缓冲液，孵育一段时间，混匀并在冰上孵育。

免疫共沉淀(CO-IP)实验方法与操作步骤CO-IP是用于检测或探究蛋白与蛋白之间相互作用的实验，属于IP实验的扩展，在样品溶液中，捕获和纯化通过天然相互作用及靶标结合的其他大分子蛋白，基于抗原抗体的特异性免疫结合，以饵蛋白为诱饵蛋白，通过饵蛋白抗体捕获，磁珠吸附结合，进而将饵蛋白结合的互作蛋白捕获得到，纯化定量定性分析。

实验操作步骤：1.样本准备组织和细胞是最常见的样本类型。

组织用液氮研磨，研磨时少量多次加入液氮，研磨时用研磨杵按住组织旋转研碎，需戴护目镜或是头盔。

细胞直接消化或刮下离心，预冷1XPBS清洗1-2次，消化是影响细胞膜表面蛋白构象，尤其是层黏连蛋白和粘附蛋白改变，导致细胞贴壁不牢，进而脱落，对细胞内蛋白影响几乎没有，细胞刮下来也行，虽然存在物理机械损伤，但损伤相基本可忽略。

2.细胞裂解使用弱裂解液，不要直接用WB裂解蛋白的裂解液，做免疫共沉淀，要保留细胞内天然构建结合，强裂解液会使蛋白变性，弱性裂解液在于表面活性剂，比如NP-40、Triton X-100。

3. 磁珠清洗及抗体孵育磁珠用之前摇一摇，按照使用量吸取，不要用小枪头，用1ml大枪头，且是无菌无酶，加入适量抗体与buffer，混入磁珠即可。

4. 磁珠-抗体-裂解液孵育此为核心步骤，磁珠与抗体孵育完成后，buffer清洗3次，加裂解液。

清洗是为去除未结合至磁珠表面的游离抗体，防止游离未结合的抗体结合到饵蛋白，降低结合总量。

磁珠-抗体复合物清洗完，加裂解液孵育，注意要颠转孵育，不能静置，磁珠是固体，溶液沉降，颠转孵育，不但能使磁珠不沉降，而且使磁珠-抗体与蛋白结合更充分全面。

放置4℃，颠转过夜。

5.清洗纯化磁珠-抗体-蛋白复合物关键步骤，需清洗6次，清洗少了会导致假阳性，清洗次数过多结合蛋白损失大，清洗时要用两种buffer，一种低盐，一种高盐，尽量去除未结合的蛋白，防止假阳性出现。

6.检测检测分为三种，根据实验目的区分。

一是银染：按照input组、目的组、IgG 组、beads组跑胶银染，查看蛋白差异性；二是WB检测：根据预测结合的靶蛋白，进行WB检测，看有无条带，确认是否结合（要做内参）；三是MS（质谱）检测：质谱检测是根据产物蛋白，进行酶解消化成多肽，再测定多肽，获取序列，比对蛋白数据库，查看潜在结合蛋白有哪些，探讨结合蛋白。

免疫共沉淀详细操作方法免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）是一种常用的蛋白质亚细胞定位、相互作用以及鉴定蛋白质结构和功能的实验方法。

它基于抗体与特定的抗原的非共价结合，通过这种特异性识别和结合，可以将目标蛋白质从混合溶液中富集出来。

下面将为您详细介绍免疫共沉淀的操作步骤：1.制备样品：-收集需要分析的生物样品（如细胞或组织），并在冰上快速移至离心管中，避免样品被降解。

-加入细胞裂解液：将离心管放入冰上，加入细胞裂解液（含有蛋白酶抑制剂）使细胞完全裂解。

-离心：将样品进行离心，去除细胞碎片和细胞核等杂质。

- 确定样品浓度：使用蛋白质浓度检测方法，如BCA法或Bradford 法，测定样品中的总蛋白质浓度。

2.抗体偶联：-预处理蛋白A/G琼脂糖磷酸盐瓶：向蛋白A/G琼脂糖磷酸盐瓶中加入足够的磷酸盐缓冲液，摇匀致溶，并将其放置在冰上。

-加入抗体：根据需要添加用于免疫共沉淀的抗体到磷酸盐缓冲液中，每次添加约10-20μg抗体。

-偶联抗体：将抗体与蛋白A/G琼脂糖磷酸盐瓶中的磷酸盐缓冲液混合，放置在冰上静置30分钟以上。

- 离心：将含有抗体的磷酸盐缓冲液进行离心，去除沉淀，得到滴度为1mg/mL的液体。

3.预结合抗体与琼脂糖的结合：- 加入琼脂糖磷酸盐瓶：将经离心的滴度为1mg/mL的抗体溶液加入含有蛋白A/G琼脂糖磷酸盐瓶中，放置在冰上静置过夜。

-离心：离心管中的混悬物进行离心，除去上清液，得到含有预结合抗体的固体。

4.免疫共沉淀：-加入样品：将样品加入到含有预结合抗体的蛋白A/G琼脂糖磷酸盐瓶中，放置在冰上静置2-4小时或过夜，使抗体结合到目标蛋白质上。

-离心：将混合物进行离心，去除上清液。

-洗涤：加入洗涤缓冲液，使混合物重悬，轻轻混匀，然后离心去除上清液，重复此步骤2-4次。

-溶解蛋白质或沉淀：根据需求，可以选择加入蛋白酶抑制剂和PBS 溶解蛋白质或沉淀物。

5.应用：-SDS-：使用SDS-技术，将免疫共沉淀的样品和对照样品进行分离。

免疫共沉淀实验流程及步骤
1) 制备细胞裂解液：收集4x107细胞，用PBS洗涤后，加入1 ml RIPA buffer(含蛋白酶抑制剂)，充分混匀，冰上裂解30 min;4℃，12000 rpm离心10 min，收集上清液。

2) 免疫共沉淀：在细胞裂解液中加入50 μl 50% Protein A/G Beads，4℃翻转混合孵育1 h进行预清除，离心后取0.5 ml上清液，加入3 μg诱饵蛋白X抗体，另取0.5 ml上清液加入等量同源的IgG 抗体作为对照，4℃摇晃结合过夜;第二天每管加入50 μl 50% ProteinA/G Beads，4℃摇晃结合3 h;用RIPA Buffer洗涤5次，每次5 min。

3) Western Blot分析或MS质谱分析：沉淀中加入25 μl 2×SDS loading Buffer，煮沸10 min后离心取上清，用靶蛋白Y的抗体进行Western Blot分析，以检测目标蛋白是否存在相互作用;或进行MS质谱分析，以找到更多与诱饵蛋白X在体内存在相互作用的蛋白。

染色质免疫共沉淀步骤
染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究蛋白质与DNA 相互作用的技术。

以下是一般的染色质免疫共沉淀的基本步骤：
1. 细胞固定：将细胞培养物在适当的条件下进行固定，以维持DNA-蛋白质复合物的结构。

2. 细胞裂解：使用细胞裂解液将细胞破碎，释放出染色质。

3. 抗体结合：将特异性抗体加入到裂解液中，使其与目标蛋白质结合。

4. 免疫沉淀：使用抗体-抗原复合物的特异性结合，通过免疫沉淀的方法将与抗体结合的染色质-蛋白质复合物沉淀下来。

5. 洗涤：对沉淀进行多次洗涤，以去除非特异性结合的物质。

6. DNA 提取：将沉淀中的DNA 提取出来。

7. DNA 分析：对提取的DNA 进行分析，例如PCR、芯片分析或高通量测序等，以确定与目标蛋白质结合的DNA 区域或基因。

需要注意的是，具体的实验步骤可能会因实验目的、细胞类型和使用的试剂而有所不同。

在进行染色质免疫共沉淀实验时，建议遵循相关的实验方案和标准操作流程，并根据实际情况进行优化和调整。

此外，染色质免疫共沉淀技术需要一定的实验技能和经验，包括细胞培养、抗体选择、洗涤条件的优化等。

免疫共沉淀实验方法与操作步骤免疫共沉淀（Immuno-precipitation，简称IP）是一种用于研究蛋白质间相互作用的分子生物学技术。

该技术主要通过将抗体与蛋白质结合，然后利用纯化方法将其他与该蛋白质相互作用的蛋白质一起沉淀下来。

以下是免疫共沉淀实验的方法和操作步骤：实验方法：1.设计实验：首先要明确要研究的目标蛋白质的特性，选择合适的实验条件和抗体。

2.制备样品：提取和纯化目标蛋白质样品，可以使用细胞裂解、分离技术等方法获得纯度较高的样品。

3.选择抗体：根据目标蛋白质的性质和已有的文献，选择合适的抗体。

可以选择专一性较高的单克隆抗体，或使用多个抗体以增加实验结果的可靠性。

4.交联抗体：使用足够浓度的亲和素，将抗体与纯化的亲和素交联。

5.准备阻断物：阻断物可以用于防止非特异性结合，在进行共沉淀实验时添加适量的BSA、奶粉等阻断物。

6.制备阳性对照：在同一实验中添加阳性对照，以验证实验的可行性及抗体的有效性。

7.孵育样品：将目标蛋白质样品与抗体复合物孵育在特定的缓冲液条件下，通常需要孵育12至24小时，以确保充分的结合。

8.添加亲和素：添加与抗体结合的亲和素（如蛋白A、蛋白G等），使抗原-抗体结合物与亲和素结合。

9.沉淀抗原-抗体复合物：通过添加亲和素的磁珠、琼脂糖或琼脂脂球等材料，将抗原-抗体复合物沉淀下来。

10.洗涤：使用高浓度的洗涤缓冲液，将非特异性结合和杂质物质洗掉。

11.洗涤完毕后，用洗涤缓冲液再洗30s,然后将磁珠用有效药液（如样本缓冲液）悬浮。

12.洗涤和沉淀：重复洗涤步骤2至3次以增加纯度，然后使用洗涤缓冲液将沉淀的样品转移到新的离心管中。

13.洗涤完毕后，去除冗余的缓冲液。

14.脱附和洗脱：使用脱附缓冲液将目标蛋白质从磁珠上脱附下来。

15.分析和检测：将洗脱的蛋白质样品用于Western blotting、质谱分析等方法进行进一步的研究和检测。

操作步骤：1.将目标蛋白质样品溶解在特定的细胞裂解缓冲液中，并在冰上孵育30分钟。

百泰派克生物科技
免疫共沉淀Co-IP
免疫共沉淀，简称Co-IP，是一种广泛应用于发现和检测蛋白质与蛋白质相互作用的技术，优点是可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合物。

百泰派克生物科技提供Co-IP分析蛋白互作的服务。

Co-IP技术通过利用某一特定蛋白（诱饵蛋白）的特异性抗体间接捕获与该诱饵蛋白结合的蛋白，来鉴定天然状态下的蛋白与蛋白相互作用。

作为免疫沉淀（IP）实验技术的一种，Co-IP实验不仅可以捕获和纯化主要目标-诱饵蛋白，而且还可以捕获和纯化通过天然相互作用与诱饵蛋白结合的其他大分子。

相对于其他鉴定蛋白质互作的方法，Co-IP的优点主要是可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合物。

免疫共沉淀（Co-IP）实验步骤
免疫共沉淀实验主要包括了4个步骤：1.制备蛋白质混合物（细胞裂解液或组织提取物）；2.用结合有特异性抗体的亲和珠孵育蛋白质混合物；3.通过多个洗涤步骤清除未结合的蛋白质；4.通过SDS-PAGE，蛋白质印迹或质谱（MS）分析检测相互作用蛋白。

免疫共沉淀详细步骤1.准备样品：首先，准备含有目标蛋白质的细胞提取物或纯化的蛋白质样品。

样品的制备通常包括细胞培养、细胞裂解和蛋白质提取等步骤。

2.预处理样品：根据实验需要，对样品进行预处理。

例如，可以使用蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂来避免蛋白质的降解或被磷酸化。

此外，也可以通过交联反应来固定蛋白质与其相互作用的分子，以增加免疫共沉淀的稳定性。

3.选择适当的抗体：根据目标蛋白质的特异性，选择适当的单克隆或多克隆抗体。

这些抗体可以是经过商业购买的，也可以是实验室自行制备的。

4.免疫沉淀：将适当的抗体与蛋白质样品混合，形成免疫复合物。

为了增加抗原与抗体的结合效率，可以在混合物中添加增强抗体结合的缓冲剂，如牛血清白蛋白（BSA），牛血清或鱼籽酸-Na等。

将混合物孵育在4°C下，允许抗体与抗原结合。

5.加入固相支持：免疫复合物通常不稳定，为了将其固定，需要将其与固相支持材料结合。

常用的固相支持材料包括蛋白A/G琼脂糖或抗体包被的琼脂糖小珠。

将适当量的支持材料添加到混合物中，并在4°C下搅拌孵育一段时间，以允许免疫复合物与支持材料结合。

6.沉淀：将混合物通过离心使免疫复合物沉淀到底物质上，将上清液去除。

7.洗涤：用洗涤缓冲液多次清洗底物质来除去非特异性的结合物质，以提高纯度。

洗涤缓冲液的成分可以根据实验样品的特点和所用抗体的特性来调整。

8.洗涤后处理：根据实验需要，可以加入洗涤后处理剂，如酶解抑制剂、的士速根-Na、蛋白酶抑制剂等。

9.构建免疫复合物：为了从固相支持上解离免疫复合物，可以使用低pH或高盐浓度的洗涤缓冲液。

免疫复合物被解离后，可以用于进一步的分析，如免疫印迹、质谱分析等。

10. 分析：通过适当的方法对免疫复合物进行分析。

常用的分析方法包括SDS-、Western blot、质谱分析等。

免疫共沉淀方法在蛋白质相互作用研究中具有重要的应用价值。

在实验过程中，需要注意的是选择适当的抗体和固相支持材料，以及适当的控制实验条件，如反应时间和温度等。

免疫共沉淀的详细步骤及方法1.实验准备在进行免疫共沉淀实验前，需要准备实验所需的材料和试剂。

这些材料和试剂包括：抗体，控制抗体，细胞提取液，蛋白质提取缓冲液，蛋白质裂解缓冲液，洗涤缓冲液，沉淀缓冲液，蛋白质样品等。

2.细胞提取及蛋白质提取收集待测细胞，用适当的缓冲液洗涤细胞，并用蛋白质提取缓冲液提取细胞内的蛋白质。

可利用机械或化学方法破裂细胞膜，释放细胞内的蛋白质。

3.预清洗和前处理将蛋白质提取物进行预清洗，以去除非特异性结合物和杂质蛋白质。

预清洗通常包括四次的离心洗涤步骤，使用洗涤缓冲液。

4.抗体交联将抗体与蛋白质提取物进行交联。

将目标抗体或控制抗体与预清洗后的蛋白质提取物特异性结合，并通过化学或免疫学方法交联两者。

5.免疫沉淀实验将交联后的样品经过免疫沉淀实验。

将抗体/蛋白质复合物与蛋白质A/G琼脂糖珠或其他免疫沉淀剂结合，使复合物与琼脂糖珠发生特异性结合。

6.洗涤和收集将免疫沉淀后的琼脂糖珠用洗涤缓冲液进行洗涤，去除非特异性结合物质。

洗涤次数通常为3-5次，每次洗涤约10分钟。

7.热处理和蛋白质裂解将洗涤后的琼脂糖珠在蛋白质裂解缓冲液中进行热处理。

将琼脂糖珠加入含有蛋白酶抑制剂和变性剂的裂解缓冲液中，使蛋白质从琼脂糖珠上释放出来。

8. SDS-和Western Blot分析使用SDS-技术对裂解后的蛋白质进行分离，然后进行Western Blot 分析。

Western Blot分析是通过将蛋白质转移到膜上，并使用特定的抗体进行探测，来检测特定蛋白质。

9.数据分析根据Western Blot结果来分析免疫共沉淀实验结果。

可以通过探测特定蛋白质的存在与否，以及与其他蛋白质的互作情况来推断蛋白质间的相互作用或复合物的形成。

总结免疫共沉淀是一种广泛应用于研究蛋白质结构和功能的实验技术。

其详细步骤包括：细胞提取和蛋白质提取，预清洗和前处理，抗体交联，免疫沉淀实验，洗涤和收集，热处理和蛋白质裂解，SDS-和Western Blot 分析，以及数据分析。

免疫共沉淀技术流程一、免疫共沉淀技术的准备工作。

1.1 首先呢，咱们得把要用的材料都准备好。

这就像做饭得先把食材买齐一样。

细胞或者组织样本那是必不可少的，这是咱们整个实验的基础。

就好比盖房子得有砖头一样，没有样本，后面的事儿都白搭。

1.2 还有抗体，这可是关键的“小助手”。

要根据咱们想要研究的蛋白去精心挑选合适的抗体。

这抗体就如同钥匙，得精准匹配蛋白这个“锁”，要是选错了，那可就打不开正确的“大门”，实验结果肯定就不对路了。

另外，各种试剂也得备齐，像裂解缓冲液之类的，这就如同做菜时的调料，缺了它，味道就不对了。

二、细胞裂解与蛋白提取。

2.1 细胞或者组织样本到手后，就得进行裂解了。

这个过程就像是把一个包裹打开，把里面的东西都释放出来。

把样本放到裂解缓冲液里，然后通过一些手段，比如超声破碎或者研磨，让细胞破个“壳”，把里面的蛋白都释放到溶液里。

这一步可得小心点，要是操作太猛了，可能把蛋白都给破坏了，那就“竹篮打水一场空”了。

2.2 蛋白提取出来后，要进行定量。

这就好比我们卖东西得先称称重量一样。

得知道有多少蛋白，这样后续的实验才能按照合适的比例来进行。

要是蛋白量都不清楚，那后面加抗体的量也不好确定，整个实验就会乱了套，成了“没头的苍蝇”到处乱撞。

三、免疫共沉淀反应。

3.1 接下来就是重头戏——免疫共沉淀反应了。

把我们之前选好的抗体加到蛋白溶液里，这时候就看抗体和目标蛋白“看对眼”了。

它们就像一对情侣，特异性地结合在一起。

然后再加入一些能结合抗体的东西，比如说Protein A或者Protein G琼脂糖珠，这就相当于给这对“情侣”找了个“媒人”，让它们更稳定地结合在一起。

3.2 在这个过程中，要给它们足够的时间和合适的条件去反应。

就像谈恋爱得有个过程一样，不能着急。

温度、时间这些条件都得控制好，不然的话，这“恋爱”谈不成，实验也就失败了。

四、清洗与分析。

4.1 反应完成后，得把那些没有结合的杂质给清洗掉。

免疫共沉淀1、收集细胞样品，水平转子1000rpm离心2min，去上清，将细胞沉淀放在液氮里速冻，后置于冰上；2、每管加入200ul的IP裂解液，涡旋仪上震荡30s；3、取20ul上清加入到新的EP管中，然后加入loading buffer，95度加热5min，作为input；4、再向步骤4中的样品管里加入320ul的IP裂解液，震荡1min；5、13000rpm 4度离心10min；6、将上清转移到加入anti-FLAG beads的EP管中，4度摇晃孵育3h；7、13000rpm 4度离心10s，去上清；8、加入500ul IP buffer 洗涤5次；9、加入500ul 50mM Tris-HCl PH7.5洗涤1次，将triton除净；10、每管加入蛋白loading buffer，94度加热10min；11、13000rpm 4度离心2min；12、将样品进行western检测分析。

IP裂解液配方(50 ml)1 M HEPEs (PH7.5) 10 mM 0.5 ml5 M NaCl100 mM 1 ml0.5 M EDTA 1 mM 0.1 ml50% 甘油10% 10 ml10% Triton 1% 5 ml 1片蛋白酶抑制剂dH2O 补水至50 ml 于摇晃器上摇晃混匀，分装成2ml小管，-20度保存。

IP洗涤液配方(50 ml)试剂终浓度用量1 M HEPEs (PH7.5) 10 mM 0.5 ml5 M NaCl100 mM 1 ml0.5 M EDTA 1 mM 0.1 ml50% 甘油10% 10 ml 10% Triton 1% 5 mldH2O 补水至50 ml 于摇晃器上摇晃混匀，4度保存。

免疫共沉淀技术
免疫共沉淀技术（Immunoprecipitation，简称IP）是一种采用免疫原理分离指定蛋白质或蛋白质复合物的实验技术。

它是一种特殊性抗体与抗原结合形成免疫复合物，并使之在生物液体中形成沉淀簇，再通过一定的方法将其分离出来的技术。

免疫共沉淀技术主要应用于蛋白质组学研究，常用来分析蛋白质的相互联系、互作以及组装状况。

它具有灵敏度高、特异性强、分离效率高等优点，是全基因组项目和蛋白质研究的重要技术手段。

免疫共沉淀技术的实施，主要包括以下四个步骤：第一步：细胞破碎及抗原提取，将细胞以大量的生物溶剂混匀，可以使细胞内的抗原被完全释放出来；第二步：抗体共沉淀，将体外生产的抗体与抗原结合，形成抗原抗体共沉淀复合物；第三步：沉淀物离心分离，通过离心技术将抗原抗体共沉淀复合物从反应液中分离出来；第四步：洗涤纯化，对抗原抗体共沉淀复合物进行洗涤，消除其他物质的干扰，使其纯化。

免疫共沉淀技术的实施，需要专业的实验室设备，以及经验丰富的技术人员，才能保证实验质量。

因此，实施免疫共沉淀技术时，应当选择有资质的实验机构，以提高实验质量和效果。

Co-ImmunoprecipitationPart I: prepare sample预冷PBS，Lysis Buffer，细胞刮子，离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS（斜放控干）；2. 加入预冷的lysis Buffer(加PMSF,Proteinase cocktail，用量视细胞数而定)，冰上裂解10 min。

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃4. MSC: 4℃，12000rpm 离心15min，取上清。

Cancer cells：超声裂解（操作见附件），4℃，12000rpm 离心15min，取上清。

5. PBS 洗两遍Protein A agarose珠子（先静置，3000rpm，1min），用PBS配制成50%浓度（减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠）。

6. Sample预处理：每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃12 rpm 转盘，10min（去除非特异性杂蛋白，降低背景）。

7. 4℃静置，3000rpm，1min，取上清，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积antibody（eg：IgG，Kindlin2）到beads中，4℃，12 rpm 转盘，2h。

11. 加入sample到beads，4℃，12 rpm 转盘，过夜。

12. 4℃静置，3000rpm，5min，弃上清，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，用预冷的PBS洗3遍，1ml/遍，最后一遍用lysis buffer.。

免疫共沉淀实验步骤：1 将转染质粒48 h后的293T细胞用冰1×PBS洗涤一次，加入1ml预冷的IP buffer裂解液（含PMSF），冰上30min裂解细胞。

2将细胞裂解液收集于1ml EP管中，在4℃12000rpm离心10 min，取上清，加入4μg 抗体于4℃振摇2h（抗体的量和振摇时间可根据抗体特异性适当调整）。

（阴性对照组为相同的种属的抗体）3 样本组和对照组中分别加入50 μl prorein A/G 树脂在4℃振摇过夜。

用IP buffer洗涤3次，每次4℃12000rpm离心5min，弃上清。

加入40μl 2×上样缓冲液。

沸水中煮10 min变性蛋白。

取20μl蛋白样品上样，在SDS-PAGE后，转移质PVDF膜，用相应抗体进行检测。

IP buffer20mM Tric-Hcl137mM NaCl10% Glycerol1% Np-401mM EDTA注意事项：（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Trito n X-100)。

（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用（3）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗兔多克隆抗体：正常兔IgG（4）吸取珠子的枪尖最好将口开大（剪掉尖头部分），以免损伤珠子。

(5) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；(6) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；(7) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。