下载文档原格式
噬菌体展示技术及其在动物病毒性疾病中的应用许达;黄小健;李春玲;陈金顶;李淼;宋帅【摘要】Phage display is the technology that allows expression of exogenous (poly) peptides on the surface of phage particles. In recent years, phage display technology has made a great progress in applications about animal viral diseases, and showed a clear advantage in some areas, such as screening viral epitope, antiviral peptides and vaccine design et al. This review focuse on introducing its theory and applications in viral diseases. And hope to make a guide to follow-up study.%噬菌体展示技术是在20世纪80年代中期兴起的一项技术,该技术可以实现外源蛋白质或多肽基因的表达产物与噬菌体衣壳蛋白融合,进而展示到噬菌体表面.近年来,噬菌体展示技术在动物病毒性疾病中的应用范围越来越广,在筛选动物病毒抗原表位及抗病毒多肽、疫苗研制等领域显示出了明显的优势.文章就噬菌体展示技术的基本原理及噬菌体展示技术在动物病毒性疾病方面的应用作一综述,以期对后续噬菌体展示技术在病毒性疾病的诊断、防制等方面的应用作指导.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2012(039)005【总页数】4页(P60-63)【关键词】噬菌体展示技术;病毒;抗原表位;抗病毒多肽;疫苗【作者】许达;黄小健;李春玲;陈金顶;李淼;宋帅【作者单位】广东省农业科学院兽医研究所,广东省兽医公共卫生实验室,广东广州510640;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;广东省动物疫苗供应站,广东广州510520;广东省农业科学院兽医研究所,广东省兽医公共卫生实验室,广东广州510640;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;广东省农业科学院兽医研究所,广东省兽医公共卫生实验室,广东广州510640;广东省农业科学院兽医研究所,广东省兽医公共卫生实验室,广东广州510640【正文语种】中文【中图分类】Q782噬菌体展示技术是一种可用于筛选功能性多肽的生物技术，George（1985）首次报道成功地将R1核酸内切酶基因在丝状噬菌体（filamentous bacteriophage，fd）的外壳表达，从而建立了噬菌体展示技术。
噬菌体展示抗体文库的研究噬菌体展示抗体文库（phage display antibody library）是一种重要的抗体工程技术，它通过将抗体的可变区域（variable region）与噬菌体的外膜蛋白表达进行融合，实现了大规模高通量的抗体筛选，并广泛应用于生物学研究、新药研发、诊断和治疗等领域。
噬菌体是一种寄生细菌的病毒。
噬菌体展示技术利用噬菌体的良好特性和抗体的高特异性，将两者相结合，形成了噬菌体展示抗体文库。
该文库中包含了大量的噬菌体，每个噬菌体表面都带有抗体的可变区域，这些可变区域可以与抗原特异性结合。
通过对已知抗原进行抗体文库的筛选，可以高效地获得对特定抗原具有高特异性和高亲和力的抗体。
噬菌体展示抗体文库的构建需要以下步骤：首先，收集包含抗体基因的淋巴细胞，通常是从免疫应答良好的动物或人体中获得。
然后，将这些基因片段用反转录酶转录成cDNA，再与适当的表达载体连接，并将其导入到噬菌体中。
接下来，通过大规模复制生成噬菌体展示抗体文库。
这个文库中的抗体基因含有大量的变异位点，可以编码出不同的抗体变异区域。
最后，通过筛选的方法将具有特定结合能力的抗体获得并纯化出来。
噬菌体展示抗体文库技术的优势在于：首先，抗体文库具有极高的多样性，这使得可以从中筛选出具有不同特异性和亲和力的抗体。
其次，噬菌体展示技术具有高通量的特点，可以一次筛选大量的抗体变体。
此外，噬菌体展示抗体文库的构建和筛选过程相对简单，成本相对较低。
最后，通过不断优化和改进，这种技术在高通量筛选中表现出极高的鉴定能力和效率。
噬菌体展示抗体文库技术在生物学研究和新药研发中具有广泛的应用。
例如，通过噬菌体展示抗体文库技术，可以鉴定出与疾病相关的抗原，并用于疾病的早期诊断和监测。
此外，噬菌体展示技术还可用于新药研发领域，通过研究抗体和抗原的相互作用，发现潜在的治疗靶点，并设计和优化高亲和力和高特异性的抗体药物。
总之，噬菌体展示抗体文库技术在抗体工程领域具有重要的意义。
噬菌体展示技术吴楚1,诸慧2 (1.温州大学生命与环境科学学院,浙江温州325027;2.温州科技职业学院,浙江温州325000)摘要 概述了噬菌体展示技术的基本原理,常用的噬菌体表面展示系统以及噬菌体展示技术的应用、展望等方面,并在抗原表位分析和疫苗的研制、人工抗体、多肽药物的开发等方面,进行了探讨。
关键词 噬菌体;展示技术;亲和富集法筛选中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)03-00990-03基金项目 温州大学科研项目(2003Y 31);温州市科技计划项目(G 20204084)。
作者简介 吴楚(1974-),男,浙江温州人,讲师,从事环境微生物学研究。
收稿日期 2008211206 噬菌体展示技术(Phage Display T echniques ,PDT )是将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示在其表面,同时将遗传密码信息整合到噬菌体的基因组中的一种技术。
该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内,即在噬菌体的表面展示特定蛋白质,而在噬菌体核心DNA 中则含有该蛋白的结构基因。
另外,这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来,可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。
随着肽展示库展示内容的多样化及展示库质量的提高,人们利用目标蛋白来筛选噬菌体展示库,能很容易获得相应的配体,通过分析所获肽段的序列及结构,就能准确地分析出蛋白分子间,如抗原抗体反应、受体与配体、酶与底物之间的相互作用机制及相应分子的特征。
因此,自1985年G eorge S m ith 首次将外源抗原决定簇与丝状噬菌体的次要外壳蛋白融合以来[1],噬菌体展示被用于免疫学、细胞生物学及药物开发等领域,成为生物学后基因组时代一个强有力的实验技术。
1 噬菌体展示技术的基本原理噬菌体展示技术是一种将基因表达产物和亲和筛选相结合的技术[2],它以改构的噬菌体为载体,把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质的基因,使其基因表达产物在噬菌体表面展示,进而通过亲和富集法筛选有特异肽或蛋白质的噬菌体。
噬菌体展示随机肽库技术的医学研究应用史云龙;刘永明【摘要】噬菌体展示随机肽库是将编码外源性多肽的DNA序列插入噬菌体外壳蛋白基因,产生由数十亿种随机肽段与噬菌体外壳蛋白以融合形式呈现在噬菌体表面的重组噬菌体库.近年来,噬菌体展示随机肽库已成为筛选蛋白和多肽的重要生物技术,并被广泛应用于医学研究.笔者就其在肿瘤和自身免疫性疾病研究以及疫苗研制中的应用现状进行综述.【期刊名称】《华夏医学》【年(卷),期】2016(029)003【总页数】5页(P171-175)【关键词】噬菌体展示随机肽库;多肽筛选;抗原表位【作者】史云龙;刘永明【作者单位】桂林医学院生物化学与分子生物学教研室,广西桂林541004;桂林医学院生物化学与分子生物学教研室,广西桂林541004【正文语种】中文【中图分类】R37;R392.33噬菌体展示随机肽库（phage display random peptide library，PDPL）技术诞生于20世纪80年代。
1985年，Smith将源自限制性内切酶EcoRI的基因片段插入丝状噬菌体的基因Ⅲ中，得到了在外壳蛋白中融合表达该基因片段编码多肽的重组噬菌体颗粒[1]。
这些融合表达的EcoRI肽段可被EcoRI抗体所捕获，表明展示在噬菌体外壳表面的外源性蛋白与天然蛋白有着相同或相近的空间结构和生物活性。
1990年，Scott等[2]成功将PDPL技术应用于抗原表位的筛选。
目前，噬菌体展示随机肽库已是包含数十亿个随机肽段序列的大容量肽库，对蛋白靶分子而言是一种丰富的资源库。
30多年来，PDPL已发展成为筛选蛋白和多肽的重要生物技术，并被广泛应用于医学研究。
PDPL是将编码外源性多肽的DNA序列插入噬菌体外壳蛋白基因，产生由数十亿种随机肽段与噬菌体外壳蛋白以融合形式呈现在噬菌体表面的众多重组噬菌体。
PDPL作为一项新的技术平台，其特点，一是首次有能力通过基因信息与蛋白质功能无缝连接的方式同时研究众多的蛋白质变异体，并已被广泛而有成效地用于探索受体与配体相互作用结合位点、寻找高亲和力配体分子等蛋白质与蛋白质相互作用的研究[3]；二是不仅能筛选天然蛋白质上的线性抗原表位，而且还能筛选天然蛋白质不存在的模拟表位[4]。
目录简介 (2)培养基和溶液 (5)常规M13方法 (6)淘选程序（固定靶分子） (8)结合克隆的特征 (12)其他淘选方法（液相结合法） (15)其他抗原表位作图方法（Protein A/G捕获法） (16)附录：优化肽结合相互作用 (19)文库的氨基酸分布 (21)试剂盒组成：（如无特殊说明，试剂盒中所有成分均需-20℃保存）：•随机十二肽噬菌体展示文库100 µl, 1.5×1013 pfu/ml。
贮存于含50%甘油的TBS溶液中。
复杂度~2.7×109个转化子。
•-28 gIII测序引物5’-HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’, 100 pmol, 1 pmol/µl •-96 gIII测序引物5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’, 100 pmol/µl, 1 pmol/µl •E.coli ER2738宿主菌F’lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf::Tn 10 (TetR)/fhuA2 supE thi Δ(lac-proAB) Δ(hsdMS-mcrB)5 (rk –m k–McrBC–)。
该菌株以含50%甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。
贮存于-70℃。
•链霉亲和素Streptavidin, 冻干粉1.5 mg•生物素，10 mM 100 µl Ph.D.TM是New England Biolabs, Inc. 的注册商标。
概述噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。
噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快速鉴定。
最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板（或磁珠）共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。
被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。
经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。
展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面(3)，包括绘制抗原表位图谱(4-6)、研究蛋白质-蛋白质相互作用（7）和鉴定非肽配体的肽模拟型（8-11。
）生物活性肽分子的鉴定可以通过对固定在平板上的纯化受体进行淘选（12）也可以在完整细胞上进行淘选（13-15）。
蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段亲和tag，然后选用特异性的介质来区分切割和未切割的噬菌体（16）。
另外，大的蛋白质分子[如：抗体（17）、激素（18）、蛋白酶抑制剂（19）、酶（20）和结合蛋白（21）]也可展示在噬菌体上，通过对随机突变文库的筛选，分离出各种具有亲和力或特异性改变的变异株。
Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，因而是一个组合文库。
所展示的十二肽表达在pIII的N末端，即：成熟蛋白的第一个氨基酸就是随机十二肽的第一个氨基酸, 十二肽后面是一段短小的间隔多肽，由Gly-Gly-Gly-Ser 组成，然后是野生型pIII蛋白。
该文库含有~2.7×109个电转化序列，用10 µl本品提供的噬菌体进行扩增，每个序列一次可产生~55个拷贝，对原始文库进行大量测序（见附录）表明该文库序列具有广泛的多样性，无明显的残基位置偏嗜。
建议不要扩增原始文库来进行另外的淘选试验，因为一旦再扩增便会出现序列偏嗜现象。
NEB应用本品分别鉴定出了与链霉亲和素和单克隆抗体相结合的共有结合肽序列（见图2）。
大量实验证明，任何情况下该文库的复杂度都足以产生多个可编码相同肽基序的DNA序列。
图2用Ph.D.-12肽库测定抗原决定簇。
用抗?-内啡肽单克隆抗体对Ph.D.-12展示肽文库进行液相淘选，然后用ProteinA-琼脂糖（第1和第3轮淘选）或Protein G-琼脂糖(第2轮淘选)亲和捕获抗体-噬菌体复合物。
每轮淘选所选到的结合序列与R-内啡肽的前12个氨基酸残基序列比较列于上图内，共有序列元件用方框示出。
结果清楚地显示该抗体的抗原决定簇序列落在R-内啡肽的前四个氨基酸残基（YGGF）处，在第三位有一定的可变性。
第三轮筛有一个筛选到的克隆无插入子。
培养基和溶液LB培养基：每升含：10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl。
高压灭菌，室温贮存。
LB/IPTG/Xgal平板：LB培养基+ 15 g/L琼脂粉。
高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1 ml IPTG/Xgal*，混匀倒平板。
平板4℃避光贮存。
顶层琼脂：每升含：10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl, 1 g MgCl2·6H2O, 7 g 琼脂粉。
高压灭菌，分成50 ml等份。
固体培养基室温贮存，用时微波炉融化。
四环素贮液：以20 mg/ml的浓度溶于乙醇中。
-20℃避光贮存。
用前摇匀。
LB-Tet平板：LB培养基+ 15 g/L琼脂粉。
高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1 ml四环素贮液，混匀倒平板。
平板4℃避光贮存，如果平板显棕色或黑色请勿用。
封阻缓冲液：0.1 M NaHCO3 (pH 8.6), 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3。
过滤除菌，4℃贮存。
TBS: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl。
高压灭菌，室温贮存。
PEG/NaCl: 20% (w/v) PEG-8000, 2.5 M NaCl。
高压灭菌，室温贮存。
碘化物缓冲液：10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 4 M NaCl。
室温避光贮存。
链霉亲和素贮液：将1.5 mg链霉亲和素冻干粉（本试剂盒提供）溶于1 ml 10 mM磷酸钠(pH7.2)、100 mM NaCl、0.02% NaN3溶液中。
4℃或-20℃贮存，避免反复冻融。
*IPTG/Xgal配方：将 1.25 g IPTG (isopropyl β–D-thiogalactoside)和 1 g Xgal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside)溶于25 ml二甲基甲酰胺中。
溶液-20℃避光贮存常规M13方法M13不是一个裂解性噬菌体，噬菌斑的形成不是由于菌体裂解而是由于细胞生长力减弱所致，因此其噬菌斑是浑浊的而不是清亮的。
菌株保存1. 本试剂盒提供的宿主菌是一个强F+菌株，生长迅速，特别适合于M13噬菌体的增殖。
尽管ER2738是一个recA+菌株，但我们在使用M13或噬菌粒载体的过程中从未发现有体内重组现象发生。
其他F+的商品菌株如：DH5αF’和XL1-Blue或许可以代替ER2738应用,但未曾用本系统检验过。
2. 由于M13是一个雄性特异性大肠杆菌噬菌体，建议用于M13增殖的所有菌液都是从F 因子正向选择培养基上挑菌接种的，而不是直接从本试剂盒提供的甘油菌接种培养的。
ER2738的F因子上含有一个小转座子，赋予该细胞四环素抗性，因此可以在含四环素的平板上铺板筛选含F因子的细胞。
3. 从随产品提供的ER2738甘油菌划线接种LB-Tet平板，倒置平板37℃培养过夜。
用封口膜封闭平板后4℃避光保存，最长可达一个月。
4. 用于感染噬菌体的ER2738菌液既可以在LB也可以在LB-Tet培养基中生长。
只要不对培养物进行连续稀释，在非选择性培养基中F因子的丢失并不严重。
避免噬菌体污染M13噬菌体的衣壳蛋白pIII通过与受体菌的F性纤毛相结合而介导感染。
与野生型噬菌体相比，外源蛋白或多肽融合在pIII蛋白的N端展示明显降低了文库噬菌体的感染力。
因此，当有任何野生型噬菌体污染时，每轮淘选试验之间的扩增步骤会强烈倾向于扩增野生型噬菌体，如果同时没有一个强有力的体外噬菌体结合选择程序来避免，即使痕量水平的污染也会在三轮淘选后使淘选出的噬菌体多数为野生型。
1. 在本手册所述的所有步骤中均使用带滤芯吸头，可以使污染外界环境中噬菌体的可能性大大降低。
2. 由于文库噬菌体源于常规克隆载体M13mp19，其含有lacZα基因，当铺在含IPTG和Xgal 的平板上时，噬菌斑将呈蓝色。
而外界污染的丝状噬菌体在同样的平板上将呈白色噬菌斑，同时这些噬菌斑还会比文库噬菌体的噬菌斑更大更模糊。
因此所有的滴度检测步骤，建议一定要在LB/IPTG/Xgal培养基上铺板，如果有白色噬菌斑，则只挑取蓝色噬菌斑进行测序。
测定噬菌体滴度只有当噬菌体的感染复度MOI (multiplicity of infection)值远低于1时（即细胞过量时），噬菌斑的数量才会随着加入噬菌体的量而呈线性增加。
正因如此，建议检测噬菌体贮液的滴度时，在感染前进行稀释，而不是在高MOI值的情况下稀释被感染的细胞。
低MOI值有助于确保每个噬菌斑仅含一个DNA序列。
1. 接种ER2738单菌落于5-10 ml LB培养基中，摇床培养至对数中期（OD600 ~0.5）。
2. 细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3 ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。
保存于45℃备用。
3. 37℃预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。
4. 在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体。
建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。
每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。
5. 当菌体培养物达对数中期，分成200 µl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。
6. 每管加入10 µl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5 min。
7. 将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。
适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。
8. 待平板冷却5 min后，倒置于37℃培养过夜。
9. 检查平板，计数有~102个噬菌斑的平板上的斑数。
然后用此数目乘以稀释因子即得到每10 µl噬菌体的空斑形成单位（pfu）滴度。
淘选程序最简单直接的淘选方法有：直接将靶分子包被于塑材表面（通过非特异的疏水作用或静电相互作用），洗去过量的未吸附分子，然后将噬菌体库覆盖在已包被的靶分子的表面。
根据靶分子的不同，直接包被法偶尔会导致配体结合位点难以进入，这或许是由于分子的立体封阻或许是由于靶分子表面的部分变性而引起。
