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噬菌体展示肽库英文说明书Ph.D.-12 Manual

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Phage display

Phage display


coated microtitre wells
19
Wash to remove unbound phage particles
20
Elute bound phage
21
Amplify eluted phage Repeat selection Analyze
a) ELISA b) Specificity c) Sequencing d) Affinity e) Activity
感染 和扩增
E.coli
22
举例
• 呼吸道合胞病毒感染呼吸道上皮细胞靶向 肽的筛选及验证
23
4
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噬菌体展示系统的应用及优缺点
应用范围
诊断 被动免疫 蛋白质结构分析 药物导航 蛋白质纯化
抗体
30
蛋白质—蛋白质 蛋白质—DNA 蛋白质—其他
受体—配体 信息传递 拮抗剂 抑制剂
Phage display
——基于将某个蛋白与其遗传信息之间直接 联系的筛选方法
Liu Yun
1
概 述
噬菌体展示技术（Phage Display techniques，
PDT）起源于1985年，是一种用于筛选和改造功能性多 肽、蛋白质强有力的生物技术，广泛应用于蛋白组学、 基因克隆等多个分子生物学领域。 目前噬菌体展示技术的研究进展非常迅速，在抗原 决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节 分子的分离和人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑 制剂的研究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的不 同领域得到了应用，并对这些领域产生了深远的影响。
1990年Scott等首次将随机序列肽与丝状噬菌体表面蛋 白g 融合展示在噬菌体表面，建立了噬菌体展示随机肽库。
Phage display technology(1)

Phage display technology(1)


Ph.D.缺点
首先，所建的肽库容量只能达到109，要想构建 大片段的肽库很困难。 其次，需要解决肽库的多样性问题。 第三，少数多肽由于疏水性过强，或由于影响外 膜蛋白的折叠而不能展示在噬菌体表面。
Ph.D.应用
1. 抗体：抗狂犬病毒的单链抗体等等。 2. 疫苗 3. 多肽类药物 4. 肿瘤药物导航载体
展示系统
Display System
噬菌体展示系统的分类 Classification of phage display systems
Ph.D.步骤
以单克隆抗体筛选蛋白质抗原表位为例 将单抗包被聚乙烯平皿后，再加入噬菌体展示肽 库，使其充分与单抗反应后，洗去未结合的游离 噬菌体，再用洗脱液将结合状态的噬菌体洗脱下 来。将其浸染宿主大肠杆菌扩增后回收，再进行 下一轮筛选。通常经过3、4轮的筛选，并且每次 增加筛选强度，这样就可获得与单抗结合较紧密 的噬菌体克隆。通过序列测定和分析，就能推知 该噬菌体克隆所携带的外源短肽序列，从而确定 该单抗所针对的抗原表位。
壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳 蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的 重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。
Ph.D.原理
将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬 菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源多肽或蛋 白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重 新组装而展示在噬菌体表面。保持相对独立的空间结 构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与 固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结 合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分 子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后 经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的 “吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体 得到高度富集。
噬菌体展示技术筛选脑靶向功能肽及其修饰纳米粒的脑内递药研究

噬菌体展示技术筛选脑靶向功能肽及其修饰纳米粒的脑内递药研究

噬菌体展示技术筛选脑靶向功能肽及其修饰纳米粒的脑内递药研究一、概述在生物医学领域中，脑靶向递药系统一直是研究的热点和难点。

由于血脑屏障的存在，许多药物难以有效进入大脑，从而限制了其在中枢神经系统疾病治疗中的应用。

开发新型的脑靶向递药技术，对于提高药物在脑部的浓度和疗效，降低副作用具有重要意义。

噬菌体展示技术以其独特的优势在药物研发和生物医学领域得到广泛应用。

该技术通过将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。

利用噬菌体展示技术，我们可以筛选到与特定靶标具有高亲和力的多肽或蛋白，为药物研发和疾病治疗提供新的候选分子。

本研究旨在利用噬菌体展示技术筛选具有脑靶向功能的多肽，并将其修饰到纳米粒表面，构建新型的脑靶向递药系统。

通过优化筛选条件和方式，我们成功获得了多个具有脑靶向功能的多肽序列，并通过实验验证了其脑靶向性。

我们还将这些多肽以共价连接的方式修饰到聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸共聚物（PEGPLGA）纳米粒表面，以提高药物的稳定性和脑部递送效率。

本研究不仅为脑靶向递药系统的开发提供了新的思路和方法，还为中枢神经系统疾病的治疗提供了新的候选药物和递送策略。

通过进一步的研究和优化，我们相信这种新型的脑靶向递药系统将在未来为更多的患者带来福音。

1. 介绍脑靶向药物递送的重要性与挑战脑靶向药物递送是神经科学领域的一个关键研究方向，对于治疗脑部疾病具有重要意义。

由于血脑屏障的存在，许多药物难以有效穿透并进入脑组织，这使得脑内疾病的治疗面临着巨大的挑战。

开发高效的脑靶向药物递送系统成为当前研究的热点和难点。

脑靶向药物递送的重要性主要体现在以下几个方面：对于脑部疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、脑肿瘤等，有效的药物递送能够显著提高治疗效果，改善患者的生存质量。

脑靶向递送系统能够实现药物的精准定位，减少对其他组织器官的副作用。

噬菌体随机肽库_中文说明书_phage_display

噬菌体随机肽库_中文说明书_phage_display

目录简介 (2)培养基和溶液 (5)常规M13方法 (6)淘选程序（固定靶分子） (8)结合克隆的特征 (12)其他淘选方法（液相结合法） (15)其他抗原表位作图方法（Protein A/G捕获法） (16)附录：优化肽结合相互作用 (19)文库的氨基酸分布 (21)试剂盒组成：（如无特殊说明，试剂盒中所有成分均需-20℃保存）：•随机十二肽噬菌体展示文库100 µl, 1.5×1013 pfu/ml。

贮存于含50%甘油的TBS溶液中。

复杂度~2.7×109个转化子。

•-28 gIII测序引物5’-HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’, 100 pmol, 1 pmol/µl •-96 gIII测序引物5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’, 100 pmol/µl, 1 pmol/µl •E.coli ER2738宿主菌F’lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf::Tn 10 (TetR)/fhuA2 supE thi Δ(lac-proAB) Δ(hsdMS-mcrB)5 (rk –m k–McrBC–)。

该菌株以含50%甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。

贮存于-70℃。

•链霉亲和素Streptavidin, 冻干粉1.5 mg•生物素，10 mM 100 µl Ph.D.TM是New England Biolabs, Inc. 的注册商标。

概述噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。

噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快速鉴定。

噬菌体展示技术

噬菌体展示技术


In phage display, a heterologous peptide or protein is displayed on the surface of the phage through transcriptional fusion with a coat-protein gene ,producing novel phage particles that have a variety of potential uses. Foreign proteins can usually be displayed on more than one phage coat protein and in varying amounts. Generally, the smaller the foreign protein or peptide the more copies can be displayed, although this also depends on the phage used, the coat protein and the antigen displayed.
噬菌体展示技术(Phage Display techniques,PDT)起源于1985年,是一 种用于筛选和改造功能性多肽,蛋白质 强有力的生物技术,广泛应用于蛋白组 学,基因克隆等多个分子生物学领域.
目前噬菌体展示技术的研究进展非 常迅速,在抗原决定簇的定位,蛋白质 相互作用位点的确定,特异调节分子的 分离和人工抗体和疫苗的制备,诊断技 术,酶抑制剂的研究开发,多肽药物的 研制等生物技术研究的不同领域得到了 应用,并对这些领域产生了深远的影响.
1985年Smith首次通过基因工程的手段,将 外源基因插入丝状噬菌体基因组中,从而使表 达的外源肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白一起展示 在噬菌体表面,由此建立了噬菌体展示技术.
噬菌体展示随机肽库技术的医学研究应用

噬菌体展示随机肽库技术的医学研究应用

噬菌体展示随机肽库技术的医学研究应用史云龙;刘永明【摘要】噬菌体展示随机肽库是将编码外源性多肽的DNA序列插入噬菌体外壳蛋白基因,产生由数十亿种随机肽段与噬菌体外壳蛋白以融合形式呈现在噬菌体表面的重组噬菌体库.近年来,噬菌体展示随机肽库已成为筛选蛋白和多肽的重要生物技术,并被广泛应用于医学研究.笔者就其在肿瘤和自身免疫性疾病研究以及疫苗研制中的应用现状进行综述.【期刊名称】《华夏医学》【年(卷),期】2016(029)003【总页数】5页(P171-175)【关键词】噬菌体展示随机肽库;多肽筛选;抗原表位【作者】史云龙;刘永明【作者单位】桂林医学院生物化学与分子生物学教研室,广西桂林541004;桂林医学院生物化学与分子生物学教研室,广西桂林541004【正文语种】中文【中图分类】R37;R392.33噬菌体展示随机肽库（phage display random peptide library，PDPL）技术诞生于20世纪80年代。

1985年，Smith将源自限制性内切酶EcoRI的基因片段插入丝状噬菌体的基因Ⅲ中，得到了在外壳蛋白中融合表达该基因片段编码多肽的重组噬菌体颗粒[1]。

这些融合表达的EcoRI肽段可被EcoRI抗体所捕获，表明展示在噬菌体外壳表面的外源性蛋白与天然蛋白有着相同或相近的空间结构和生物活性。

1990年，Scott等[2]成功将PDPL技术应用于抗原表位的筛选。

目前，噬菌体展示随机肽库已是包含数十亿个随机肽段序列的大容量肽库，对蛋白靶分子而言是一种丰富的资源库。

30多年来，PDPL已发展成为筛选蛋白和多肽的重要生物技术，并被广泛应用于医学研究。

PDPL是将编码外源性多肽的DNA序列插入噬菌体外壳蛋白基因，产生由数十亿种随机肽段与噬菌体外壳蛋白以融合形式呈现在噬菌体表面的众多重组噬菌体。

PDPL作为一项新的技术平台，其特点，一是首次有能力通过基因信息与蛋白质功能无缝连接的方式同时研究众多的蛋白质变异体，并已被广泛而有成效地用于探索受体与配体相互作用结合位点、寻找高亲和力配体分子等蛋白质与蛋白质相互作用的研究[3]；二是不仅能筛选天然蛋白质上的线性抗原表位，而且还能筛选天然蛋白质不存在的模拟表位[4]。

噬菌体培养试剂盒产品说明书(中文版)主要用途

噬菌体培养试剂盒产品说明书(中文版)主要用途

噬菌体培养试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
噬菌体培养试剂是一种旨在通过噬菌体特殊培养基，使敏感宿主细菌充分吸附具有毒力的 P1 噬菌体，获得繁殖的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用 于后续载体 DNA 萃取、克隆、转导、噬菌体展示技术等技术。产品严格无菌，即到即用，性能稳定，噬 菌体繁殖效价高。
噬菌体感染复数＝噬菌体效价（PFU/毫升）÷
注意事项
1． 本产品为 10 次操作 2． 整个操作须无菌操作 3． 使用时，切莫污染母液 4． 通常的敏感宿主细菌为大肠杆菌 CSH109、CSH108、CSH123、K12MC4100 等菌株 5． 如果噬菌斑过密或过稀，用户根据实际情况，可以调整不同稀释倍数的噬菌体进行铺板检测 6． 本公司提供系列噬菌体实验产品
准备 1 个 15 毫升锥形离心管
加入 xx 微升来自操作步骤 7 的宿主细菌菌液
加入 xx 微升上述制备的第 6 管稀释地 P1 噬菌体液，混匀
放进 37℃恒温水槽孵育 10 分钟
进微波炉里加热融化
置入 37℃恒温水槽孵育 15 分钟
移取 xx 毫升 胶顶液（Reagent E）到上述 15 毫升锥形离心管，混匀
二、 噬菌斑检测（PLAQUE ASSAY）
实验开始前，将试剂盒里的 固养液（Reagent 从D）4℃冰箱里取出，放进微波炉里加热融化，避 免溢出；然后移出 10 毫升到 90mm 直径的细菌培养板里，均匀铺平。然后进行下列操作：
1、 移取 xx 毫升 培养液（Reagent A）到无菌的 15 毫升锥形离心管 2、 加入 500 微升用户自备的过夜新鲜培养的敏感宿主细菌 3、 放进 37℃摇床孵育 1 小时，速度为 220RPM 4、 放进 4℃台式离心机离心 10 分钟，速度为 6000g 5、 小心抽去上清液 6、 加入 xx 毫升 稀释液（Reagent C），混匀细胞颗粒群 7、 等待下列噬菌体稀释制备操作后使用，见操作步骤 19 8、 准备 7 个 1.5 毫升离心管，标记为 1 至 7 号管 9、 分别加入 xx 微升 稀释液（Reagent C） 10、 加 xx 微升上述制备的 P1 噬菌体到 1 号管，混匀 11、 移取 xx 微升 1 号管稀释的 P1 噬菌体到 2 号管，混匀 12、 移取 xx 微升 2 号管稀释的 P1 噬菌体到 3 号管，混匀 13、 移取 xx 微升 3 号管稀释的 P1 噬菌体到 4 号管，混匀 14、 移取 xx 微升 4 号管稀释的 P1 噬菌体到 5 号管，混匀 15、 移取 xx 微升 5 号管稀释的 P1 噬菌体到 6 号管，混匀 16、 移取 xx 微升 6 号管稀释的 P1 噬菌体到 7 号管，混匀 17、 下表为 P1 噬菌体稀释倍数
噬菌体培养试剂盒产品说明书(中文版)主要用途

噬菌体培养试剂盒产品说明书(中文版)主要用途

和克隆，以及Cre-lox系统的基因工程的工具。P1vir，P1的毒力突变株可以进入裂解周期（xx，用于基因通
用转导。
产品内容
培养液（Reagent A） 裂解液（Reagent B） 稀释液（Reagent C） 固养液（Reagent D） 胶顶液（Reagent E） 产品说明有 固养液（Reagent D）的 90mm 直径的细菌培养板，确保铺满整个表面
放进 37℃培养箱孵育 16 小时：可见透亮区域的为噬菌斑
放进 4℃冰箱里
计数噬菌斑
计算噬菌体原液和繁殖效价以及噬菌体感染复数（multiplicity of infection；MOI）
噬菌体效价（PFU/毫升）＝
1
台式离心机：用于沉淀细胞或残渣
实验步骤
一、 噬菌体繁殖
1、 移取 xx 毫升 培养液（Reagent A）到无菌的 125 毫升三角烧瓶 2、 加入 100 微升用户自备的过夜新鲜培养的敏感宿主细菌（例如 1 X 108/毫升） 3、 放进 37℃摇床孵育 1 小时，速度为 220RPM 4、 加入 100 微升用户自备的P1 噬菌体，总量为 5 X 109 5、 放进 37℃摇床孵育 2 小时，速度为 220RPM，或可见明显的细胞溶解 6、 转移上述培养噬菌体到新的无菌的 15 毫升锥形离心管 7、 加入 xx 毫升 裂解液（Reagent B） 8、 盖上盖子，上下反复倾倒混匀 30 秒 9、 放进台式离心机离心 15 分钟，速度为 10000g 10、移取上清液相到新的无菌的 15 毫升锥形离心管 11、加入 xx 微升 裂解液（Reagent B） 12、即刻放进 4℃冰箱里保存 13、或即刻进行各种后续操作
2
管号 1 2 3 4 5 6 7
从噬菌体展示随机肽库中淘选多肽药物参考模板

从噬菌体展示随机肽库中淘选多肽药物参考模板

从噬菌体展示随机肽库中淘选多肽药物Selection of Peptide drugs from Phage-displayedRandom Peptide Library生命科学学院99级沈抒殚摘要以凝血酶为靶分子，利用噬菌体展示和亲和淘选技术，从随机十五肽库中筛选到结合凝血酶的3个特异结合肽克隆，并对其中结合活性最强的短肽进行了序列测定。

ELISA鉴定结果表明，3个克隆对于凝血酶都有一定的结合能力，且都与凝血酶的天然抑制剂水蛭素产生竞争。

关键词：噬菌体展示，随机肽库，淘选，凝血酶AbstractThrombin as target molecule, and with the new bio-technique of phage display and biopanning, 3 special binding peptide clones were selected out from a phage-displayed random 15-peptide library. The sequence of the clone, which had the highest affinity with thrombin, has been determined. Data of ELISA showed that all the three clones could be combined to thrombin to some extent. And all of them could compete with hirudin, which is the natural inhibitor of thrombin.Key words: phage display, random peptide library, biopanning, thrombin一、前言噬菌体展示随机多肽库噬菌体展示随机多肽库技术是以噬菌体展示技术（phage display）为基础的。

噬菌体展示肽库说明书

噬菌体展示肽库说明书

E. coli ER2738 host strain F´ proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15 zzroAB) Δ(hsdMS-mcrB)5 (rk– mk– McrBC–). Host strain supplied as 50% glycerol culture; not competent. Store at –70°C.
-96 gIII sequencing primer 5´- HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG –3´, 100 pmol, 1 pmol/µl
-28 gIII sequencing primer 5´- HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C –3´, 100 pmol, 1 pmol/µl
Introduction
Phage display describes a selection technique in which a library of peptide or protein variants is expressed on the outside of a phage virion, while the genetic material encoding each variant resides on the inside (1-3). This creates a physical linkage between each variant protein sequence and the DNA encoding it, which allows rapid partitioning based on binding affinity to a given target molecule (antibodies, enzymes, cell-surface receptors, etc.) by an in vitro selection process called panning (4). In its simplest form, panning is carried out by incubating a library of phage-displayed peptides on a plate (or bead) coated with the target, washing away the unbound phage, and eluting the specifically bound phage (Figure 1). The eluted phage are then amplified and taken through additional binding/amplification cycles to enrich the pool in favor of binding sequences. After 3–4 rounds, individual clones are characterized by DNA sequencing and ELISA.
噬菌体和细菌表面展示多肽的表面展示载体的使用概述

噬菌体和细菌表面展示多肽的表面展示载体的使用概述

噬菌体和细菌表面展示多肽的表面展示载体的使用概述近几年，结合胞外选择技术，在噬菌体和细菌表面展示多肽的表面展示载体的使用，能够产生和操作各种配体，如酶、抗体及肽。

噬菌体展示(phage display)是在噬菌体表面表达已融合到噬菌体外壳蛋白的重组蛋白或多肽;细菌展示是在细胞表面表达融合到定位信号的重组蛋白。

用这两个相辅相承的技术，可以设计全套配体，并用亲和选择法筛选到具有预期特性的配体。

应用噬菌体展示，可合成、筛选到许多我们想要的蛋白(如融合肽、抗体、酶)，这些蛋白具有预期的催化特性或结合亲和力，或者具有用于胞内、胞外诊断、人体疾病免疫治疗和生物催化作用时所需的特异性。

而细菌表面展示可广泛应用在各种抗原决定簇、异源酶、单链抗体及重组肽库的表达上。

本文简述了噬菌体和细菌表面展示的基础，及这两个前导技术在生物技术领域的应用。

噬菌体展示噬菌体展示已证明是一有力的技术，可以获得容纳几万甚至几亿的不同肽或蛋白质的文库，并已应用于重组肽库(识别肽受体配基)的亲和筛选，确定单克隆抗体的抗原表位，选择酶作用底物以及筛选克隆的全套抗体。

噬菌体展示的一项成功应用是，用大的噬菌体抗体库分离单克隆抗体和片段。

相应的在过去的几年中快速发展了许多有效的技术、方法，用于设计、构建大的抗体库及抗体的筛选。

使用最普遍的是感染阳性大肠杆菌的单链丝状噬菌体，利用其它噬菌体的展示系统也同时发展起来，包括在λ噬菌体头和尾，T4衣壳及MS2外壳的展示。

单链丝状噬菌体将编码成千上万特异配体的DNA片段，插入噬菌体编码外壳蛋白的基因中(通常为P?,也有P?、P?或P?)，抗体基因与噬菌体基因连接后，抗体就会和外壳蛋白相融合，接着是将融合的外壳蛋白结合到新的噬菌体颗粒上，这些颗粒是在细菌周围间隙被装配的。

基因融合产物和其亚序列结合到成熟噬菌体外壳后即被呈现在噬菌体表面，而遗传物质仍保留在噬菌体颗粒中。

该技术将基因型和表型连在一起，将识别抗原和进行再扩增的能力结合起来，不经人体免疫，绕过杂交瘤，仅仅通过几轮“吸附—洗脱—扩增”的筛选富集过程。

噬菌体展示技术

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第二步：磁珠生物素化抗原复合物与抗体库结合
17
第三步：洗涤—洗去非特异和弱结合旳噬菌体
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第四步：洗脱—将特异性结合旳噬菌体洗脱下来
19
第五步：扩增—将洗脱旳噬菌体扩增 扩增产物进行下一轮筛选
背面旳筛选逐渐加大筛选压力
多克隆和单克隆噬菌体ELISA
ELISA阳性克隆测序，最终得 到特异性结合旳克隆序列
噬菌体展示系统 Phage on display 1
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及处理方案
2
什么是噬菌体表面展示技术
Smith在1985年首次证明外源DNA能够插入丝状噬菌体基 因III中，并与pIII蛋白融合展示。
• 有供筛选旳抗生素标识基因。
• Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和 病毒包装所需要旳全部蛋白和酶。
13
筛选旳措施－亲和淘选
直接包被淘选法： 直接将靶分子包被在固相表面 优点：简朴直接。 缺陷：偶尔会造成配体结合位点难以进入 可能是因为分子旳立体封阻 或者是靶分子表面旳部分变性而引起 液相淘选法： 将靶蛋白与噬菌体抗体库先结合，之后再亲和捕获靶分子-噬菌体 复合物。 优点：克服直接包被旳出现旳问题 缺陷：轻易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合旳克隆。
23
谢谢
24
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
6
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 构成，5个拷贝，位于噬菌 体旳尾部。
2. 由三个功能区构成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上

噬菌体展示技术和其应用


2020/3/30
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应用举例：
部分做过的工作
2020/3/30
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一、半合成噬菌体抗体库的构建
构建一个半合成抗体库，不经免疫制备人源抗Tie2 Fab抗体。通过RT-PCR方法，从人脐带血淋巴细胞总 RNA 扩增轻链基因及重链VH段基因，将轻链基因插入 pCOMb3载体中，得人轻链质粒库；从乙肝表面抗体 （HBsAb）的Fd段基因制备含有不同长度随机化CDR3 的FR3-CDR3-J-CH1片段，然后将VH段基因与随机化 的CDR3融合，得到Fd基因片段，再将其插入轻链质粒 库中，得半合成人Fab质粒库。
2020/3/30
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抗体库技术简单流程
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获得抗体基因
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插入载体
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表达
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筛选
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噬菌体展示技术的发展简史
1985年Smith — 证实噬菌体fd基因组能通过基 因工程的手段进行改造[1]。
1988年Parmley — 将已知抗原决定簇与噬菌体 PⅢ N端融合呈现在其表面[2]。
1990年McCafferty — 用噬菌体展示技术筛选溶 菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一 个广力。
2020/3/30
载体克隆容量大 T7载体比M13克隆容量大，而任何克隆到M13上大于1 kbp的片段都不稳定。
插入片段稳定 洗提条件灵活
T7重组子很稳定，而M13重组子 – 尤其是>1 kb的很不稳定
M13稳定性尚可，但是洗提条件颇受限制，SDS、盐、离液剂等，都能造成 不稳定。而T7在1% SDS，5 M NaCl，4 M尿素，2 M盐酸胍，10 mM EDTA, 100 mM DTT，pH 4-10等条件下稳定。

噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用

噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用1985年,SmithGP利用基因工程手段将一段外源肽序列展示在丝状噬菌体的表面[1]。

1988年[2]他们又将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到丝状噬菌体,表达后每个噬菌体粒子的表面展示一种肽段,所有这些展示不同肽段的噬菌体构成了噬菌体展示肽库。

1990年,他们通过亲合筛选,得到了与特定蛋白结合的结合肽,并由于噬菌体表达的肽与编码基因直接相关,扩增和分离目的克隆后,很容易得到其DNA序列[3]。

这样就建立了噬菌体表面展示的随机肽库技术,这项技术一经产生就显示其无与伦比的生命力,被广泛用于生命科学的各个领域,并带来广泛而深远的影响。

传统的药物筛选大多数是从自然界的动、植物及微生物中分离天然的具有特定药理作用的化学物质,然后直接应用或再以此作为药物化学的先导化合物,再进一步设计、加工、合成,筛选有效的功能药物。

此方法具有一定的盲目性,筛选周期长。

而采用分子进化工程技术则会大大加速这一过程。

根据所需要的药物特性,选用适当的方法构建含有大量异质性分子的组合库,用靶分子进行筛选,先筛选药物先导化合物,然后进一步优化设计,最终确定候选的药物结构。

近年来,引入组合策略和模拟进化思想,建立了一种从噬菌体随机肽库中筛选药物先导化合物的新方法[4],即用库容量极大的随机肽库去快速筛选具有较高特异性和亲和力的理想目的肽。

通过此种方法可以快速筛选生物活性肽、蛋白质、受体及其他化合物等新型药物或先导化合物。

这一方法具有传统的药物筛选无法比拟的优越性,将药物开发带入了一个崭新的时代。

1噬菌体展示系统的建立早在1986年Geysen就认为含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的决定族。

在多数情况下,几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分,即蛋白质之间的相互作用或识别是通过局部残基肽段间的相互作用来实现的。

1982年,Dulbecco提出将病原体的免疫原与λ噬菌体和其他病毒的衣壳蛋白融合,便可产生能够用作疫苗的表面展示外来多肽的病毒颗粒。

噬菌体展示肽库英文说明书Ph.D.-12 Manual


概述： 噬菌体展示是一项选择技术， 它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达， 融合 蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的 DNA 则位于该病毒粒子内。噬菌体展 示技术使大量随机多肽与其 DNA 编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（抗体、 酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快 速鉴定。最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板（或磁珠）共 温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体（见图 1） 。被洗脱的噬菌体进 行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经 3-4 轮淘选后， 通过 DNA 测序对每个可结合克隆进行定性。 展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面(3)，包括绘制抗原表位图谱(4-6)、研究蛋 白质-蛋白质相互作用（7）和鉴定非肽配体的肽模拟型（8-11。 ）生物活性肽分子的鉴定可 以通过对固定在平板上的纯化受体进行淘选（12）也可以在完整细胞上进行淘选（13-15） 。 蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段亲和 tag，然后选用特异性的介质来区 分切割和未切割的噬菌体（16） 。另外，大的蛋白质分子[如：抗体（17） 、激素（18） 、蛋白 酶抑制剂（19） 、酶（20）和结合蛋白（2变的变异株。 Ph.D.-12 噬菌体展示肽库试剂盒将随机十二肽融合到 M13 噬菌体次要 末端，即：成熟蛋白的第一个氨基酸 就是随机十二肽的第一个氨基酸, 十二肽后面是一段短小的间隔多肽，由 Gly-Gly-Gly-Ser10 µl 本品提供的噬 菌体进行扩增，有广泛的多样性会出现序列偏嗜现象。 NEB 应用本品分别鉴定出了与链霉亲和素和单克隆抗体相结合的共有结合肽序列 （见图 DNA 序列。
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1. 接种 ER2738 单菌落于 5-10 ml LB 培养基中，摇床培养至对数中期（OD600 ~0.5） 。 2. 细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成 3 ml 等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一 管。保存于 45℃备用。 3. 37℃预温 LB/IPTG/Xgal 平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。 4. 在 LB 中准备 10 倍系列稀释的噬菌体。 建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。每 个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。 5. 当菌体培养物达对数中期，分成 200 µl 等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。 6. 每管加入 10 µl 不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育 1-5 min。 7. 将感染细胞加入 45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于 37 ℃预温的 LB/IPTG/Xgal 平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。 8. 待平板冷却 5 min 后，倒置于 37℃培养过夜。 9. 检查平板，计数有~102 个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每 10 µl 噬菌体的空斑形成单位（pfu）滴度。
避光贮存。
常规 M13 方法：
M13 不是一个裂解性噬菌体，噬菌斑的形成不是由于菌体裂解而是由于细胞生长力减弱所
致，因此其噬菌斑是浑浊的而不是清亮的。
菌株保存 1. 本试剂盒提供的宿主菌是一个强 F+菌株，生长迅速，特别适合于 M13 噬菌体的增殖。 尽管 ER2738 是一个 recA+菌株，但我们在使用 M13 或噬菌粒载体的过程中从未发现有 体内重组现象发生。其他 F+的商品菌株如：DH5αF’和 XL1-Blue 或许可以代替 ER2738 应用,但未曾用本系统检验过。 2. 由于 M13 是一个雄性特异性大肠杆菌噬菌体，建议用于 M13 增殖的所有菌液都是从 F 因子正向选择培养基上挑菌接种的，而不是直接从本试剂盒提供的甘油菌接种培养的。 ER2738 的 F 因子上含有一个小转座子，赋予该细胞四环素抗性，因此可以在含四环素 的平板上铺板筛选含 F 因子的细胞。 3. 从随产品提供的 ER2738 甘油菌划线接种 LB-Tet 平板，倒置平板 37℃培养过夜。用封 口膜封闭平板后 4℃避光保存，最长可达一个月。 4. 用于感染噬菌体的 ER2738 菌液既可以在 LB 也可以在 LB-Tet 培养基中生长。只要不对 培养物进行连续稀释，在非选择性培养基中 F 因子的丢失并不严重。 避免噬菌体污染 M13 噬菌体的衣壳蛋白 pIII 通过与受体菌的 F 性纤毛相结合而介导感染。与野生型噬菌体 相比，外源蛋白或多肽融合在生型噬菌体污染时， 每轮淘选试验之间的扩增步骤会强烈倾向于扩增野生型噬菌 体， 如果同时没有一个强有力的体外噬菌体结合选择程序来避免， 即使痕量水平的污染也会 在三轮淘选后使淘选出的噬菌体多数为野生型。
1. 在本手册所述的所有步骤中均使用带滤芯吸头，可以使污染外界环境其含有 lacZα 基因，当铺在含 IPTG 和 Xgal 的平板上时，噬菌斑将呈蓝色。而外界污染的丝状噬菌体在同样的平板检测 步骤，建议一定要在 LB/IPTG/Xgal 培养基上铺板，如果有白色噬菌斑，则只挑取蓝色 噬菌斑进行测序。
概述： 噬菌体展示是一项选择技术， 它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达， 融合 蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的 DNA 则位于该病毒粒子内。噬菌体展 示技术使大量随机多肽与其 DNA 编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（抗体、 酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快 速鉴定。最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板（或磁珠）共 温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体（见图 1） 。被洗脱的噬菌体进 行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经 3-4 轮淘选后， 通过 DNA 测序对每个可结合克隆进行定性。 展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面(3)，包括绘制抗原表位图谱(4-6)、研究蛋 白质-蛋白质相互作用（7）和鉴定非肽配体的肽模拟型（8-11。 ）生物活性肽分子的鉴定可 以通过对固定在平板上的纯化受体进行淘选（12）也可以在完整细胞上进行淘选（13-15） 。 蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段亲和 tag，然后选用特异性的介质来区 分切割和未切割的噬菌体（16） 。另外，大的蛋白质分子[如：抗体（17） 、激素（18） 、蛋白 酶抑制剂（19） 、酶（20）和结合蛋白（2变的变异株。 Ph.D.-12 噬菌体展示肽库试剂盒将随机十二肽融合到 M13 噬菌体次要 末端，即：成熟蛋白的第一个氨基酸 就是随机十二肽的第一个氨基酸, 十二肽后面是一段短小的间隔多肽，由 Gly-Gly-Gly-Ser10 µl 本品提供的噬 菌体进行扩增，有广泛的多样性会出现序列偏嗜现象。 NEB 应用本品分别鉴定出了与链霉亲和素和单克隆抗体相结合的共有结合肽序列 （见图 DNA 序列。
图 1 用噬菌体展示肽库进行淘选
图2 用Ph.D.-12肽库测定抗原决定簇。 用抗--琼脂糖（第1和第3轮淘选）或Protein G-琼脂糖(第2轮淘选)亲和 捕获抗体-噬菌体复合物。每轮淘选所选到的结合序列与-内啡肽的前12个氨基酸残基序列 比较列于上图内， 共有序列元件用方框示出。 结果清楚地显示该抗体的抗原决定簇序列落在 -内啡肽的前四个氨基酸残基（YGGF）处，在第三位有一定的可变性。第三轮筛有一个筛 选到的克隆无插入子。
培养基和溶液：
LB 培养基： 每升含：10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl。高压灭菌，室温贮存。 LB/IPTG/Xgal 平板： LB 培养基 + 15 g/L 琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于 70℃时，加入 1 ml IPTG/Xgal*，混 匀倒平板。平板 4℃避光贮存。 顶层琼脂： 每升含：10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl, 1 g MgCl2·6H2O, 7 g 琼脂粉。 高压灭菌，分成 50 ml 等份。固体培养基室温贮存，用时微波炉融化。 四环素贮液：以 20 mg/ml 的浓度溶于乙醇中。-20℃避光贮存。用前摇匀。 LB-Tet 平板：LB 培养基 + 15 g/L 琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于 70℃时，加入 1 ml 四环 素贮液，混匀倒平板。平板 4℃避光贮存，如果平板显棕色或黑色请勿用。 封阻缓冲液：0.1 M NaHCO3 (pH 8.6), 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3。过滤除菌，4℃贮存。 TBS: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl。高压灭菌，室温贮存。 PEG/NaCl: 20% (w/v) PEG-8000, 2.5 M NaCl。高压灭菌，室温贮存。 碘化物缓冲液： 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 4 M NaI。室温避光贮存。 链霉亲和素贮液： 将 1.5 mg 链霉亲和素冻干粉（本试剂盒提供）溶于 1 ml 10 mM 磷酸钠(pH7.2)、100 mM NaCl、0.02% NaN3 溶液中。4℃或-20℃贮存，避免反复冻融。 *IPTG/Xgal 配 方 ： 将 1.25 g IPTG (isopropyl β–D-thiogalactoside) 和 1 g Xgal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside)溶于 25 ml 二甲基甲酰胺中。溶液-20℃
应用噬菌体表面展示肽库快速筛选肽配体
目 录：
简介 ………………………………………………………………………………………………2 培养基和溶液 ……………………………………………………………………………………5 常规 M13 方法 …………………………………………………………………………………..6 淘选程序（固定靶分子）………………………………………………………………………..8 结合克隆的特征…………………………………………………………………………………..12 其他淘选方法 （液相结合法） ……………………………………………………………………..15 其他抗原表位作图方法 （Protein A/G 捕获法） …………………………………………………..16 附录：优化肽结合相互作用………………………………………………………………………..21
测定噬菌体滴度
只有当噬菌体的感染复度 MOI (multiplicity of infection)值远低于 1 时（即细胞过量时） ，噬菌 斑的数量才会随着加入噬菌体的量而呈线性增加。 正因如此， 建议检测噬菌体贮液的滴度时， 在感染前进行稀释，而不是在高 MOI 值的情况下稀释被感染的细胞。低 MOI 值有助于确保 每个噬菌斑仅含一个 DNA 序列。
试剂盒组成：
（如无特殊说明，试剂盒中所有成分均需-20℃保存） ：
• • • • 随机十二肽噬菌体展示 100 µl, 1.5×1013 pfu/ml。 贮存于含 50%09 个转化子。 -28 gIII 测序引物 5’-HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’, 100 pmol, 1 pmol/µl -96 gIII 测序引物 5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’, 100 pmol/µl, 1 pmol/µl E.coli ER2738 宿主菌 F’ lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf::Tn 10 (TetR)/fhuA2 supE thi Δ(lac-proAB) Δ(hsdMS-mcrB)5 (rk – m k– McrBC–)。该菌株以含 50%甘油的菌体培养物形式提供，非感 受态细胞。贮存于-70℃。 链霉亲和素 Streptavidin, 冻干粉 1.5 mg 生物素，10 mM 100 µl