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限制性核酸内切酶消化DNA ppt课件

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江西省新余市第四中学高三一轮复习人教版生物选修三课件专题111限制性核酸内切酶(共12张PPT)

江西省新余市第四中学高三一轮复习人教版生物选修三课件专题111限制性核酸内切酶(共12张PPT)

多能产生不同的DNA片段种类数是（ ）
A.3 B.4
C.9 D.12
C
8、一环状DNA分子，设其长度为1，已知某种限制性核酸内切酶 在该分子上有3个酶切位点，如图中箭头A、B、C所指。如果该 DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生0.2、0.3、0.5 三种不同长度的DNA片段。现有多个上述DNA分子，若在每个分 子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后， 这些DNA分子最多能产生长度不同的线状DNA的种类数是（ ）
图2 图1
（4）若用图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后形成重组
质粒，则应该选择的限制酶是 BamHⅠ 。在导入重组质粒后，为
筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需用添加 抗生素B 的培养基。
经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确
表达，其最可能的原因是
。
同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接
A 作正确的是（ ）
A．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割 B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割 C．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割 D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
4、下面是5种限制性内切酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图 (↓表示剪切点、切出的断面为黏性末端)：
C 请指出下列哪组表达正确（ ）
少有一个酶切位点被该酶切断，则理论上讲，经该酶酶切后，这些
C 线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是（ ）
A.3 B.4
C.9 D.12
7、如果一个环状DNA上有三种限制酶a、b、c的酶切位点。现有
多个该环状DNA分子，若在每个DNA分子上至少有一个酶切位点
被该酶切断，则理论上讲，经该酶酶切后，这些环状DNA分子最

质粒DNA的制备限制性内切酶切割重组PPT课件( 37页)

质粒DNA的制备限制性内切酶切割重组PPT课件( 37页)
1.质粒DNA的提取与纯化(P70碱法)
2.限制性内切酶的酶切鉴定(P82)
3.定性鉴定:DNA 的琼脂糖凝胶电 泳
4.定量检测：DNA 的紫外分光光度法 测定(P39)
实验目的
掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的 作用 ;
掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切 酶
一.质粒DNA的提取
(1)重组质粒;
(2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶;
(3)反应缓冲液。
32
2.3 实验步骤
(1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育12h） (3)电泳鉴定（下次实验课内容）
33
2.4 双酶切体系
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ
ddH2O
10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶 切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。
26
1.2 分类
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
1.3 作用
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
1.4 命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
•
3、命运给你一个比别人低的起点是想告诉你，让你用你的一生去奋斗出一个绝地反击的故事，所以有什么理由不努力!
•
4、心中没有过分的贪求，自然苦就少。口里不说多余的话，自然祸就少。腹内的食物能减少，自然病就少。思绪中没有过分欲，自然忧就少。大悲是无泪的，同样大悟
无言。缘来尽量要惜，缘尽就放。人生本来就空，对人家笑笑，对自己笑笑，笑着看天下，看日出日落，花谢花开，岂不自在，哪里来的尘埃!

基因操作工具酶PPT课件

基因操作工具酶PPT课件

α- 32P-dATP
EcoR I 酶切末端
同位素标记的EcoR I 酶切末端
Back
3.3 Taq DNA聚合酶
显著特点：热稳定性。70℃反应2h残留活性90 %； 93℃ 反应 2 h残留活性60% ；94℃ 反应 2 h残 留活性40%。
应用：（1）对DNA的特定片段进行体外扩增； （2） DNA序列测定。
Back
2 DNA连接酶
2.1 定义及功能 2.2 种类及作用机理 2.3 使用时的注意事项
Home
2.1 定义及功能
DNA连接酶（DNA ligase）： 可使一段DNA 3`-OH末端和5`-P 末端
形成3`,5`-磷酸二酯键，把两DNA片段 连在一起封闭双链上形成的切口的酶。
OH P
5`
• 若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个 字母（大写）
• 若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先 后顺序用罗马字母表示。
例如：EcoRⅠ 从大肠杆菌R株分离的第一种限制酶命名为 EcoRⅠ， 其中E 代表属名（Escherichia)，co 代表种名（coli)， R 代表株系（RY13），Ⅰ 代表该菌株中首次分离到。
应用：缺口平移法制备DNA分子杂交探针
缺口
DNase I DNA聚合酶 I
DNA聚合酶 I dNTP*
缺口
缺口平移法制备DNA分子探针 Back
3.2 Klenow聚合酶
活性： 5`→3`聚合活性，3`→5` 外切酶活性，无5`→3`
外切酶活性。 用途： （1）填补或标记DNA的3`隐蔽末端； （2）催化合成cDNA第二链； （3）DNA序列测定
5-7 bp非对称序 列

工具酶(限制性内切酶)优秀PPT

工具酶(限制性内切酶)优秀PPT
7
Ⅱ型限制性内切酶
1. 能在其识别序列内部或附近特异地切开 DNA 链。它们产 生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用 于 DNA分析和克隆的限制性内切酶。
2. Ⅱ型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组 成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。
3. 它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称 序列；
嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ，而且含量很大。幸 运的是，Hind Ⅲ不切割T7 DNA，因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 Hind Ⅲ将不产生任何问题（Old 等，1975）。
在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分 析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个（Hedgepeth 等， 1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。
• 这类酶很少能达到完全切割。
11
某些识别和切割独特的酶
12
BsmBⅠ
13
Ⅳ 型限制性内切酶
• 识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。
14
15
• 限制性内切酶切割后产生一个 3' -羟基和一 个 5' -磷酸基。只有当镁离子存在时，它们 才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺 苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小， 亚基约 200-350 个氨基酸。
16
某些识别和切割独特的酶
17
限制性内切酶命名
• 由于发现了大量的限制和修饰酶，所以需要一个统 一的命名体系。Smith 和 Nathans（1973）提出 了一个合适的体系，人们今天使用的就是这个体系 的一个简化版。其主要特征是：

限制性内切酶.正式版PPT文档

限制性内切酶.正式版PPT文档

回文序列 • 5'......GAA TTC......3' • 3'......CTT AAG......5'
• 从两侧读都是核苷酸的序列都是5'-GAATTC-3'
限制性内切酶的命名
• 限制性核酸内切酶的命名最早由 ห้องสมุดไป่ตู้mith 等1973 年提出,。
• 1980 年 Robert s 进行系统化和 分类。
同尾酶
许多不同的限制酶切割 DNA 产生的末端是相同的，且是对称的。 它们可产生相同的粘性突出末端。这些酶切割 DNA 得到的产物可进行末
端连接。 以下几种酶产生的末端是相同的· EcoRⅠ G↓AATCC MfeⅠ C↓AATTC ApoⅠ R↓AATTY
限制性内切酶的切割方式
影响限制性内切酶活性的因素
Ⅱ型酶对DNA序列的识别一般具有以下几个特征
①大多数酶的识别序列很严格，少有变动的余地
②识别序列的碱基数一般为4~8对，一般都富含C和G. ③大多数识别位点具有180度旋转对称的回文序列，即有一个 中心对称轴，从这个轴朝两个方向读都完全相同。
④识别序列中的碱基被甲基化修饰后会影响部分酶的切割 效果
限制性内切酶
主要内容 • 限制性内切酶的概念 • 限制性内切酶图谱 • 限制性内切酶的图谱分析法
限制性内切酶
是一类能识别双链DNA特定序列，并使磷酸二酯键断开的内切脱氧 核糖核酸酶， 限制性内切酶根据酶的组成，裂解方式和所需因子的不同分为三种 类型，分别是Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。 Ⅰ型酶主要指的是：一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多 亚基蛋白复合体。它们可在远离识别位点处任意切割 DNA 链。 能识别特异性的DNA 序列, 但没有固定的切割位点

高中生物质粒DNA的酶切鉴定(28页)公开课ppt课件

高中生物质粒DNA的酶切鉴定(28页)公开课ppt课件
质粒DNA的酶切鉴定
实验目的
1、学习限制性内切酶的特性 2、掌握酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法
高中教材分析
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶是一类能识别双链 DNA 分子特
异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的
重要工具，常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶
等一起称为工具酶。 限制性核酸内切酶还可以用于基因组酶切图谱的鉴 定。
2)限制性核酸内切酶的类型及特性
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺 序，并在识别点附近 1000 bp 的一些核苷酸上切割 DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专 一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技 术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结外观察 分析仪 上观察酶切的结果。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能 形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取 决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH的 缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。
BamH I
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
Sau 3A
BglⅡ
19
5) 影响内切酶切割效率的因素 (1) DNA的纯度； (2) DNA的甲基化程度； (3) 酶切消化反应的温度； (4) DNA的分子结构； (5) 溶液中离子浓度及种类； (6) 缓冲液的 pH值。
质粒
EcoR1
1) 寄主控制的限制与修饰现象 2) 核酸限制性内切酶的类型和特征 4) 同裂酶和同尾酶 5) 核酸限制性内切酶的命名法 6) 影响核酸限制性内切酶活性的因素
1)寄主控制的限制与修饰现象 restriction modification system

DNA的限制性酶谱分析ppt课件

DNA的限制性酶谱分析ppt课件
实验5 限制性酶切分析
.
1
一. 实验目的
通过本实验了解限制性内切酶的作用原 理，限制性酶切技术及限制性酶切图谱的 分析方法。
.
2
二. 实验原理
限制性内切酶是一类能识别并切割双链 DNA分子中特定核苷酸序列的核酸内切 酶。
.
3
限制性酶切反应体系的组成
1，DNA 2，缓冲液 提供限制性酶作用所需的离子浓度及种 类；提供限制性酶作用所需的 pH值 3，限制性内切酶
.
4
限制性酶切图谱的分析
DNA在限制性酶切后往往会形成多条片段， 从片段的数量和大小大致可以推断DNA限 制性酶切位点的多少及相对位置。
我们往往利用DNA分子量Marker读出酶 切片段的大小。
.
5
DNA分子量Marker
100 bp Marker
.
6
三. 实验方法
1．在0.5 ml 离心管中混和如下试剂()：
.
8
3．取10µl反应液，1％琼脂糖凝胶电泳检测， 同时以 DNA（EcoRI/HindIII）作为分子量 Marker
4.记录实验结果：对照分子量Marker，记录所 得片段的数量和大小，并分析 DNA有几个 HindIII酶切位点
.
9
.
10
.
11
.
12
.
13
.
14
后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用
DNA：
2 µl
10×酶切缓冲液：
2 µl
无菌水：
14 µl
HindIII：
1 µl
EcoRI
1 µl
2．37℃水浴 45 min
.

第2讲 限制性核酸内切酶

第2讲 限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶
Restriction endonucleases
切割位点
识别位点处。
切开双链DNA。形成粘性末端（cohesine ends） 或平齐末端（blunt ends）。如：
粘性末端（sticky ends，cohesine ends） 含有几个核苷酸单链的末端。
分两种类型：
① 5’端凸出（如EcoR I切点）
由限制性物理图谱可获得如下信息：
①DNA大小； ②零点（环形图谱的起止点）； ③Ori； ④选择标记;
举例
常用的切割方法：单酶切、双酶切和部分酶切。
A
B
4kb
1.5kb 1kb 0.5kb
7kb 6kb 4.5kb 4kb 3kb 2.5kb 2kb 1.5kb 1kb 0.5kb
1kb 1.5kb 0.5kb 4kb
② 3’端凸出（如Pst I切点）1. 完全消化Fra bibliotek切割方式
内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。
1 23
4
12 3
4
2. 不完全消化 / 局部消化 只有有限数量的酶切位点被切开。
1 23
4
1
4
通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶 的用量可达到局部消化的目的。
DNA分子的限制性图谱 （restriction mapping，RM）
A为完全酶切 B为部分酶切
限制性物理图谱即限制性内切核酸酶作图。简单 地说就是DNA分子中限制性内切核酸酶切割位点 的定位，即DNA分子中各种不同限制性内切核酸 酶的酶切位点的线性排列图。
即标明限制酶在DNA分子上的限制性位点的数目、 限制性片段大小及其线性排列的顺序。
RM的表现形式（3种）： ①环形（图） ②线条形（图） ③环行与线条形相结合（图）

DNA 的限制性内切酶酶切分析

DNA 的限制性内切酶酶切分析
6.观察结果：紫外分析仪上254nm观察，DNA存在处显绿色荧光条带 ，
观察酶切后与未酶切质粒的DNA带位置。
100bp DNA Marker 未酶切质粒
已酶切质 粒
点样孔
3000bp 1500bp 1000bp
500bp
2.96kp 1.9kp
注意事项
1. 第一步确保样品加到反应体系中,若有粘壁，用掌型离心机离 心到底部!
EcoR I
Bcl-2 (1.9kb)
操作步骤（改动）
1.酶切:
20ul反应体系
组分
加入体积
灭菌双蒸水
11ul
10×buffer H(含BSA） 2ul
质粒DNA
5ul
10U/ul EcoRI 2ul
掌型离心机混匀，37℃水浴反应1h
2.制胶(0.8%)：称取0.48g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1×TAE缓 冲液60ml，微波炉加热至沸腾，摇匀，至无颗粒。
3.倒胶：胶冷却至60℃左右(不烫手)，缓缓倒入电泳槽 (先胶布 封口，放好梳子)。 4.点样：1 ul含SYBR Green I的载样buffer
+5ul酶切产物 或+5ul 未酶切的质粒, 混匀。 （点样孔置负极端）
5.电泳：稳压条件下90V电泳，待染料(指示过5V/cm胶长度）
6.电泳时电场强度不超过5V/cm胶长
思考题：
1. DNA的纯度会不会影响酶切产物的质量？如果会，请 说明原因。
2. 比较本实验酶切后与未酶切质粒的电泳图谱，综合前 两个实验，分析可能的原因
2. 当样品在37℃ 水浴时，要盖紧盖子，否则水汽进入管内，使 反应体积大大增加，造成酶切失败
3. RE一定要在低温(－20℃)下贮存(含50％甘油) ，每次吸取后 应放在冰盒，用完后立即放在-20℃，新购的大包装酶应先分装

实验五质粒酶切质粒限制性内切酶消化酶切完整PPT

实验五质粒酶切质粒限制性内切酶消化酶切完整PPT

2) 命名原则
• 1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础 上进行了系统分类
① 限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名 (genus)；第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。 ② 第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)。 ③ 若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的 先后顺序用罗马字母表示。
第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
Eco R V (10442)
35S prom oter UTR
多克隆位点 p U C 1 8 M C S lacZ prom oter
35S prom oter
Eco R V (8842)
绿色荧光蛋白基因 GFP N O S 终止子加尾信号
T-D N A right border
第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源 基因的插入。
第五步：是否含有表达系统元件，即：启动子——核糖体结合位点——克隆位点——转录终止信号。
T ×C第CGG四6步mA：TC 再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源 DNA片段。 dam甲基化酶识别序列切割位点应用多功能单功能
双功能
异源三聚体
同源三聚体
异源二聚体
ATP、 Mg2+ 、SAM
Mg2+
ATP、 Mg2+
距识别序列1kb处
4~6bp回文序列
距识别序列下游 24~26bp处
随机性切割
识别序列内或附近 特异切割
随机性切割
不常用
常用
数量很少，无实际 作用

限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶
目 录
• 限制性核酸内切酶的概述 • 限制性核酸内切酶的分类 • 限制性核酸内切酶的工作原理 • 限制性核酸内切酶的应用 • 限制性核酸内切酶的未来发展
01
限制性核酸内切酶的概述
定义和特性
定义
限制性核酸内切酶是一类能识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定 部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。
在生物科学领域的应用
基因克隆和DNA重组技 术
限制性核酸内切酶是基因克隆和DNA重组 技术中的关键工具，用于切割和重组DNA 片段。
基因诊断和基因治疗
限制性核酸内切酶可用于检测和纠正基因突变，为 基因诊断和基因治疗提供有效手段。
生物制药和生物技术
限制性核酸内切酶在生物制药和生物技术领 域中用于生产重组蛋白、抗体和治疗性核酸 等生物制品。
双活性酶
02
同时具有切割和磷酸酶活性，如BstAPI。
多活性酶
03
同时具有多种活性，如FokI同时具有切割、磷酸酶和甲基化酶
活性。
03
限制性核酸内切酶的工作原理
识别和切割DNA的过程
识别
限制性核酸内切酶能够识别特定的 DNA序列，通常是4-6个核苷酸组成 的序列。
切割
在识别位点处，限制性核酸内切酶将 DNA链切开，形成两个断开的磷酸二 酯键。
产生黏性末端
限制性核酸内切酶切割DNA后，通常产生具有突出末端的片段，也称为黏性末端 。这种黏性末端可以用于DNA的连接和重组。
04
限制性核酸内切酶的应用
在基因工程中的应用
1 2 3
基因克隆
限制性核酸内切酶能够将DNA分子切割成特定序 列的片段，为基因克隆提供精确的DNA片段。

限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用 ppt课件

限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用 ppt课件
ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的 DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。
2、Ⅱ类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割 某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别
序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重 组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文 对称特异核苷酸序列，产生5'或3'黏性末端（也有一些产生平端或钝端）
Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制3、与命修名饰活：性，其切割位点很难预测。
规则： 第一个字母（大写）：取自该酶的细胞属名 第二、三个字母（小写）：该细胞的种名 第四个字母（罗马数字）：代表同一菌株中 不同限制性内切酶的编号
例如：EcoRⅠ、HindⅢ 等等
ppt课件
3
限制性核酸内切酶切割原理
1、Ⅰ类和Ⅲ类酶： 在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于
解决方法
1.标准底物检测酶活性
2.将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA
3.检查反应系统是否最佳
4.换用对DNA甲基化不敏感的同类酶酶解，重 新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌 株
5. 换 用 不 同 切 割 非 甲 基 化 位 点 的 同 类 酶 消 化 DNA，重新将质粒转至dcm+,dam+菌株中扩增
10chenli?结果分析限制性内切酶酶谱分析往往用于对构建的重组质粒进行初分析所获得的信息将有助于确定构建是否成功及其插入片段的方向orientationl在选择限制性内切酶时应选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点这样可保证酶切片段大小能满足进一步分析的需要
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3
二、实验原理
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割， 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3’)；有 的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端（ 3 ’ 突出和5 ’突出的单链末端）的DNA片段称粘性末端，如 EcoRⅠ、HindⅢ 切割识别序列后产生两个互补的粘性末 端。
6
二、实验原理
凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA， 也可以 分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。 质粒有3种构型： 1、超螺旋的共价闭合环状质粒DNA ； 2、开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂； 3、线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂。 这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同,因此电泳 后呈3条带。超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA和开环质 粒DNA。
不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
15
六、注意事项
5、酶切消化反应的温度： DNA消化反应的温度，是影响限制内切酶活性的一
个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有各自的最 适反应温度。多数限制内切酶的最适反应温度是37℃， 少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37℃。
16
六、注意事项
6、酶切消化反应的时间： 反应时间根据酶的单位与DNA用量之比来定，原则
12μL
质粒
2μL
10×buffer酶切缓冲液 2μL 轻轻混匀，低速
内切酶
短暂离心
EcoRⅠ
4μL
2.37℃，水浴1h。 3.低速短暂离心。 4.加4μL上样缓冲液于离心管中混匀，1%琼脂糖凝胶电泳 （100V,40min）。(取12μL点样)
10
五、实验结果
质粒酶切电泳图
11
六、注意事项
1、操作时注意： （1）分子生物学实验多为微量操作，注意吸样量的准确性。 （2）要求在冰上操作，并充分混匀。 （3）打开EP管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。 （4）水浴时，将EP管盖严，以防水进入管内。
18
谢 谢 各 位
19
实验二 限制性核酸内切酶消化质粒DNA
1
一、实验目的 1.掌握限制性核酸内切酶消化质粒DNA的原理与方法。 2.了解酶切反应条件。
2
二、实验原理
限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中某特定 核苷酸序列，并在识别位点内或附近切割双链DNA的核 酸内切酶。
在一定条件下（如合适温度、盐浓度等），它能 在特定的切割位点裂解DNA分子中的磷酸二酯键而将双 链DNA分子断开。
7
二、实验原理
EcoRⅠ或HindⅢ可以将pGEM-T
Easy质粒DNA切开成为线性DNA。用未
经酶切的pUC质粒DNA为对照，通过电
3000bp
泳迁移率的比较，就可以推测酶切是
否成功。 图片说明：
2000bp 1000bp
600bp
1 未经酶切的质粒DNA
500bp
2 经EcoRⅠ或HindⅢ酶切后的线性DNA 和目的DNA
12
六、注意事项
2.内切酶的使用时注意： (1)不使其污染与浪费； (2)注意加样顺序； (3)注意限制性内切酶体积不应大于反应总体积的1/10，避免星活 性（产生星活性的原因：高甘油含量、酶量过大、低离子强度、 高pH（8.0）、含有有机溶剂、非Mg2+的二价离子存在）。
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六、注意事项
3.质粒DNA对结果的影响： 作为内切酶底物，DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含
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EcoRⅠ 5ˊ-G↓AATTC-3ˊ 3ˊ-CTTAA↑G-5ˊ
5ˊ-G
AATTC-3ˊ
3ˊ-CTTAA +
G-5ˊ
HindⅢ 5ˊ-A↓AGCTT-3ˊ 3ˊ-TTCGA↑A-5ˊ
5ˊ-A
AGCTT-3ˊ
3ˊ-TTCGA +
A-5ˊ
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二、实验原理
质粒是细菌细 胞内独立于染色 体之外能自主复 制的双链环状DNA 分子。本实验用 到的是pGEM-T Easy质粒。
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_
Marker 1
2
+
目的DNA
三、仪器与试剂
主要仪器：恒温水浴箱、离心机、电泳槽与电泳仪
主要试剂：限制性核酸内切酶（EcoRⅠ、HindⅢ ）
10×酶切缓冲液 琼脂糖 上样缓冲液 0.5×TBE缓冲液 质粒DNA
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四、实验步骤
1.建立反应体系：0.5mL无菌的EP管 (总体积20μL)
无菌双蒸水
是DNA:酶=２-３:１。 本实验1小时即可充分酶解。
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六、注意事项
7、限制性内切酶反应的终止，通常有以下两种方法： （1）采用65℃条件下温浴20min，通过加热失活内切酶； （2）加终止反应液（如0.5 mol/L的EDTA使之在溶液中的 终浓度达到10 mmol/L）螯合内切酶的辅助因子Mg2+使内切 酶变性以终止反应.
酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存 在均不同程度影响限制性内切酶的活力。 这种抑制作用可通过下列方式克服： （1）增加酶作用单位数（10-20U/ug DNA）、 （2）增大反应体积以稀释可能的抑制剂 （3）延长反应时间
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六、注意事项
4、反应缓冲液的影响 反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+组成， 其中Mg2+为内切酶辅基； Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间； NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度： 低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl） 高盐（100mM NaCl）