大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因序列特征[设计+开题+综述]

文章编号㊀１６７２Ｇ６６３４(２０１９)０４Ｇ００１１Ｇ０７D O I ㊀１０．１９７２８/j．i s s n １６７２Ｇ６６３４．２０１９．０４．００３人免疫球蛋白重链可变区基因的特征分析石㊀彬１,２㊀马嘉欣２㊀涂文静２㊀吴皓明２㊀陈先恋１(１．遵义医科大学附属医院,贵州遵义５６３０００;２．遵义医科大学检验医学院,贵州遵义５６３０００)摘㊀要㊀目的:分析五类免疫球蛋白重链可变区基因的特征．方法:收集I MG T /L I GM ＧD B 数据库中人类五类I g 重链可变区的基因序列,利用I MG T /H i g h V ＧQ U E S T 分析其基因取用㊁V 区A A 变化㊁C D R ３氨基酸长度和构成以及连接多样性．结果:I g M ㊁I g G 和I g E 均较多地取用I G H J ４㊁I G H V １Ｇ６９和I G H V ５Ｇ５１,且在I g M ㊁I g G ㊁I g A 与I g E 中可观察到几个相似的优势V ＧJ 配对．I gD 具有较高的V 区突变,主要体现在F R ３区的高突变(A A 变化值为７．２ʃ２．４),而I g M 的每个结构域的突变均明显低于其他类I g ．此外,I gD 具有较高P 插入发生率和插入核苷酸数明显多于其他四类I g ．结论:本研究从基因特征上描绘了人类五类I g 相互间的相似性与差异性,这些结果可为抗体工程领域提供重要参考数据．关键词㊀I g;重链可变区基因;C D R ３;I MG T /L I GM ＧD B 中图分类号㊀R ３９２．９文献标识码㊀A０㊀引言I g (i m m u n o g l o b u l i n ,I g )是由B 细胞合成㊁分泌的参与介导体液免疫应答重要的效应分子．I g 重链可变区互补决定区３(c o m p l e m e n t a r i t y d e t e r m i n i n g r e gi o n ,C D R ３)是其特异性识别和结合抗原的关键区域[１,２]．与大多数脊椎动物一样,人类I g 基因具有高度的多样性,其多样性产生的机制主要包括重链可变区的V ㊁D ㊁J 基因片段的重排㊁各基因片段连接区的核苷酸的插入与删除以及重排后的体细胞超突变[３,４]．根据重链的不同,I g 可划分为I g G ㊁I g M ㊁I g A ㊁I g D 和I g E 五大类别．I g G 在血液中的含量最高,是再次免疫应答的主要抗体;I g M 主要出现于初次免疫应答,产生最早且抗体效价高;而I gA 在局部粘膜免疫应答发挥重要作用;I g D 主要表达于B 细胞膜表面,发挥细胞识别的作用;而I gE 则主要参与介导超敏反应[５]．尽管过去的研究早已证实五类I g 的蛋白结构与功能均有不同程度的差异[５],然而,对于其I g 重链可变区基因的结构和特征,目前尚缺乏系统的描述．本研究对国际权威数据库I MG T /L I GM ＧD B [６,７]存储的所有五类I g 重链可变区基因数据进行比较,分析它们的可变区基因特征及其相互间的相似性和差异性,这些结果将有助于学者们更好地理解I g 基因特性,可为抗体疫苗设计㊁人工抗体合成及I g 免疫组库研究等提供重要参考数据[８,９]．１㊀材料与方法１．１㊀研究对象在国际权威免疫遗传信息数据库I MG T /L I GM ＧD B 中,储存了数十年来的世界各实验室提交的免疫球蛋白基因数据,通过检索方式获取I MG T /L I GM ＧD B 数据库中人类五类免疫球蛋白的重链可变区基因序列．检索条件选择为:S p e c i e s :H o m o s a p i e n s (h u m a n );M o l e c u l e t y p e :c D N A ;C o n f i g u r a t i o n t y p e :r e a r r a n ge d ;F u n c t i o n a l i t y :p r o d u c t i v e ;C h a i n t y p e :I G ＧH e a v y ．通过该检索,获得了原始序列(I g M 序列５８２条,I g D 序列１３２条,I g G 序列１８３９条,I g A 序列５０１条,I gE 序列１１２条)．收稿日期:２０１８Ｇ１１Ｇ１３基金项目:国家自然科学基金项目(８１７６０３００)资助通讯作者:石彬,男,汉族,博士,副教授,研究方向:免疫组库与免疫信息,E Ｇm a i l :s h i b i n _s u pe r m a n ＠１６３．c o m．第３２卷㊀第４期２０１９年８月㊀㊀㊀聊城大学学报(自然科学版)J o u r n a l o fL i a o c h e n g U n i v e r s i t y (N a t ．S c i ．)V o l ．３２N o ．４A u g．２０１９１．２㊀数据处理将原始序列的F A S T A格式提交至I MG T/H i g h VＧQ U E S T[１０,１１]软件对搜索到的重链可变区基因序列进行比对和鉴定．通过I MG Ts u m m a r y文件,过滤掉符合以下条件之一的序列:(１)N o r e s u l t s;(２)U n k n o w; (３)W a r i n g s;(４)U n p r o d u c t i v e;(５)１０４/１１８氨基酸位点非C/W;(６)连接区未鉴定;(７)C D R区未鉴定;(８)重复序列．最终获取用于分析的u n i q u e p r o d u c t i v e的序列为I g M序列５４７条,I g D序列１３０条,I g G序列１８１６条,I g A序列４７２条,以及I g E序列９７条(具体过滤信息见表１)．１．３㊀软件与统计I MG T/H i g h VＧQ U E S T(版本１．２．０)用于鉴定序列(V H,D H,J H和C D R３),功能评估和序列数据统计分析;I MG T/VＧQ U E S T(版本３．２．３２)用于鉴定C D R３的位置;M i c r o s o f tO f f i c eE x c e l(版本２０１０)用于序列的存储㊁过滤和统计;G r a p h P a dP r i s m７用于绘图和假设检验．氨基酸和核苷酸数目用m e a nʃS D表示,其数据的假设检验在两组数据的比较时采用t检验,而在多组数据的比较时采用A N O V A．检验水准以p＜０．０５定义为具有统计学差异,图中 ∗ 表示p＜０．０５．表１㊀数据过滤I g类别原始序列N o r e s u l t s U n k n o w U n p r od u c t i v e１０４/１１８位点非C/W连接区未鉴定C D R区未鉴定重复序列u n i q u ep r o d u c t i v eI g M５８２７８２３９２４５４７I g D１３２０００１０１０１３０I g G１８３９４３１３１１１１１８１６I g A５０１９０００６３１１４７２I g E１１２４２０００１８９７㊀㊀㊀注:表中的数值表示序列数目．２㊀结果２．１㊀基因取用人类I G H V基因包含７１个等位基因[１２,１３],图１显示了五类I G H V亚群基因的频率．与其他I g显著不同的是,I g D表现为对I G H V４Ｇ３４的偏向取用(８４．６％),而其他类别I g对该基因的取用均不超过６％．I g A 对I G H V１Ｇ６９的取用频率为２．８％,而I g M㊁I g G与I g E对其多出了数倍的取用(分别为１３．３％㊁８．９％㊁１０．３％)．值得关注是,I G H V５Ｇ５１在I g M㊁I g G㊁I g A与I g E四类I g中均显示了较高频率的取用(分别为１０．１％㊁１０．２％㊁９．５％㊁１４．４％)．进一步的VＧJ基因配对的热图显示,各类I g的配对图谱有明显差别(图２)．I g M㊁I g G㊁I g A与I g E对I G H J４的取用频率均接近５０％,而I g D对其取用仅为２．３％．I g D对I G H J３的取用高达７８．５％,而其他四类I g对其取用均低于２３％．有趣的是,尽管不同I g间的基因取用差别明显,但五类I g依然存在三种相似的优势VＧJ配对模式,包括I G H V５Ｇ５１/I G H J４㊁I G H V５Ｇ５１/I G H J３以及I G H V３Ｇ３０/ I G H J４(表２)．表２㊀五类I g的t o p３优势VＧJ配对I g类别１２３I g M I G HV１Ｇ６９/I G H J４(６．０％)I G H V５Ｇ５１/I G H J４(５．３％)a I G H V６Ｇ１/I G H J４(４．４％)I g D I G H V４Ｇ３４/I G H J３(６８．５％)I G H V４Ｇ３４/I G H J６(１６．２％)I G HV４Ｇ６１/I G H J３(７．７％)I g G I G H V５Ｇ５１/I G H J４(３．８％)a I G H V５Ｇ５１/I G H J３(３．７％)b I G H V３Ｇ３０/I G H J４(３．４％)cI g A I G HV３Ｇ７３/I G H J４(５．１％)I G HV３Ｇ３０/I G H J４(３．８％)c I G H V５Ｇ５１/I G H J４(３．６％)aI g E I G HV１Ｇ６９/I G H J６(７．２％)I G H V５Ｇ５１/I G H J４(６．２％)a I G H V５Ｇ５１/I G H J３(５．２％)bI G H V４Ｇ３０Ｇ４/I G H J４(５．２％)㊀㊀注:１/２/３分别代表频率排名前三的配对;括号中数值表示配对频率;相同模式的配对用相同小写字母上标注释．２．２㊀V区的A A变化I g V区的体细胞超突变与抗体亲和力成熟关系密切,由于其突变水平高,因此,一般较少使用核苷酸水平的突变评价,而是推荐使用A A变化(A m i n o a c i d c h a n g e s,氨基酸变化)对其进行分析[１４,１５]．完整的V区包含F R１㊁C D R１㊁F R２㊁C D R２㊁F R３㊁C D R３和F R４,但由于C D R３和F R４参与了重排进程,因此,我们在分析V区的体细胞高频突变时未包含这两个结构域．图３显示了五类I g的V区A A变化为０时的I g M序列(２８．０％)２１㊀聊城大学学报(自然科学版)图１㊀五类I G HV基因亚群的频率图２㊀五类I g 的VＧJ 基因配对热图明显多于其他四类I g (均低于３．２％)．值得注意的是,A A 变化数小于或等于１０时,I g D 序列仅占比６．９％,I g M 序列比例为９１．４％,而其他I g 均在４０％Ｇ６０％．而当A A 变化数大于或等于１１时,I g D 序列比例高达９３．１％．I gM 序列的A A 变化均值为３．７ʃ４．６,显著低于其他类I g (t 检验,每个p ＜０．０５),而I g D 序列的A A 变化均值为１４．７ʃ４．３,显著高于其他类I g (t 检验,每个p ＜０．０５)．I g G ㊁I g A 与I gE 的A A 变化均值分别为１１．７ʃ５．９㊁１１．０ʃ５．５以及９．６ʃ５．２．因此,这些结果提示I g D 倾向于较高的V 区突变水平,而I gM 具有较低的V 区突变水平．进一步的V 区各结构域(F R １㊁C D R １㊁F R ２㊁C D R ２和F R ３)的A A 平均变化数表明,I g M 的每个V 区结构域的突变水平均低于其他类I g (A N O V A ,每个p ＜０．０５),而I g D 则主要体现在F R ３区的高突变水平(A A 变化值为７．２ʃ２．４,图４)．图３㊀五类I g 的A A 变化的分布３１第４期石彬,等:人免疫球蛋白重链可变区基因的特征分析２．３㊀C D R ３区构成分析I g 可变区的互补决定区(c o m p l e m e n t a r i t y d e t e r m i n i n g r e g i o n ,C D R )包含重/轻链C D R １㊁C D R ２以及C D R ３,其中重链C D R ３是识别和结合抗原的关键区域[１,２]．通过筛选,我们发现I g M ㊁I g D ㊁I g G ㊁I g A 和I gE 图４㊀五类I g 各结构域的A A 变化的独特型C D R ３序列数目分别为４８３㊁７４㊁１６５６㊁４０７和８５．图５显示五类I g 的CD R ３A A 长度分布谱虽不同,但I g M ㊁I g G ㊁I g A ㊁I gE 的C D R ３平均长度较为相似．值得注意的是,I g D 的C D R ３平均长度显著多于其他四类I g (A N O V A ,p ＜０．０５)(图６)．图７显示了五类I g 的２０种A A 的取用(显示了２０种A A 的缩写,从左往右按照疏水性由强到弱排列),表明I g DC D R ３更多地取用精氨酸(R )㊁脯氨酸(P )㊁苏氨酸(T )㊁甘氨酸(G )㊁丙氨酸(A ),其相对较少地取用谷氨酸(E )㊁组氨酸(H )㊁酪氨酸(Y )㊁色氨酸(W )㊁苯丙氨酸(F )．而其他四类I g C D R ３在A A 取用上较为相似．２．４㊀连接多样性连接多样性是由于在VңD 和DңJ 连接处的回文序列 P 核苷酸(P 区)和 N 核苷酸(N 区)的插入以及核酸外切酶修剪产生的核苷酸删除所致[１６,１７]．值得注意的是,I gD 的P 区(P ３ V＋P ５ D＋P ５ J )插入发生率为４３．１％,明显高于其他类I g (均值为(２３．６ʃ２．１)％)．且表３显示I g D 在P 区添加的平均核苷酸数为２．９ʃ３．４,显著多于其他四类I g (t 检验,每个p ＜０．０５)．此外,五类I g 的N 区(N １＋N ２)插入发生率较为相似(均超过９８％)．I g M 的N 插入平均核苷酸数相对较少(１１．５ʃ７．６),而I g D 与I g G 的N 插入平均核苷酸数相对较多(分别为１４．３ʃ１０．６㊁１４．０ʃ８．３)．在核苷酸删除方面,I g M 与I gD 删除的平均核苷酸数相对较少(均为１８．３ʃ８．２),I gE 的平均核苷酸删数相对较多(２０．８ʃ９．５,表３)．进一步地调查插入和删除谱(即不同插入或删除核苷酸数的分布)显示,I g D 的P /N 插入谱和删除谱均明显不同于其它类I g(图８)．I gD 的P 插入主要体现在较多数目(５Ｇ７个核苷酸)的核苷酸插入比例较多,而其N 插入和删除均有明显的峰值．有趣的是,其他四类I g 的P 插入谱极为相似．图５㊀五类I g 的CD R ３长度分布４１㊀聊城大学学报(自然科学版)图６㊀五类I g 的C D R ３长度比较㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀图７㊀五类I g 的CD R ３氨基酸构成图８㊀五类I g 的N /P 插入和删除谱㊀㊀㊀㊀表３㊀五类I g 插入与删除的平均核苷酸数I g 类别P 插入N 插入删除I g M ０．４ʃ０．８a１１．５ʃ７．６１８．３ʃ８．２I gD ２．９ʃ３．４１４．３ʃ１０．６b１８．３ʃ８．２I g G ０．４ʃ０．８a １４．０ʃ８．３b １９．４ʃ６．８I g A ０．３ʃ０．８a １２．５ʃ６．８１９．５ʃ８．８I g E ０．４ʃ０．７a １２．３ʃ６．９２０．８ʃ９．５c注:P 插入组中I g D 与其他I g 两两比较有差异的用a 上标表示,N 插入组中I g M 与其他I g 两两比较有差异的用b 上标表示,删除组中I g M 与其他I g 两两比较有差异的用c 上标表示．３㊀讨论在I g 形成的过程中,多个不连续的V ㊁D ㊁J 基因会发生随机重排,并在核酸酶的辅助下组装成完整的I g转录本[１８,１９]．早期研究已证实,重链可变区的C D R ３是I g 特异性识别和结合抗原的关键区域[１,２],其氨基酸含量以及排序将影响I g 的功能．五类I g 在功能表现上各有不同已是众所周知,然而,目前国内外鲜有关于比较人类五类I g 重链可变区基因研究报道．为了更好地理解人类I g 形成机制和特征,本研究对I MG T /L I GM ＧD B 数据库中储存的所有人类免疫球蛋白重链可变区基因进行了分析．基因取用结果表明,五类I g 在V /J 基因取用偏好性上存在部分相似性．例如,I g M ㊁I g G 与I gE 均较多地取用I G H V １Ｇ６９,I g M ㊁I g G ㊁I g A 与I g E 均较多地取用I G H V ５Ｇ５１,I g M ㊁I g G ㊁I g A 与I g E 对I G H J ４的取用频率均接近５０％,并且I g M ㊁I g G ㊁I g A 与I g E 间可以观察到几个相似的优势V ＧJ 基因配对;然而,I g D 与其他四类I g 差异明显,这可能与I g G ㊁I g A ㊁I g E 来源于I g M 的类别转换有关．V 区A A 变化分析显示,I g D 具有较高的V 区突变水平,主要体现在F R ３区高突变水平(A A 变化值为７．２ʃ２．４)．而I gM 具有相对较低的V 区突变水平,其每个结构域的突变水平均明显低于其他类I g ,这与以往的人体疾病与健康的I gM 库的结果相似[２０,２１]．５１第４期石彬,等:人免疫球蛋白重链可变区基因的特征分析６１㊀聊城大学学报(自然科学版)此外,连接多样性的结果表明,I g D具有较高P插入发生率,且P插入的核苷酸数明显多于其他四类I g．同时,I g D具有较多的N插入和较少的删除,因此,结果显示I g D拥有相对较长的C D R３长度(约１７A A)．而其他四类I g长度均较为接近(约１５A A),与以往小样本实验观察的结果一致[２０]．此外,I g D的C D R３更多的取用精氨酸(R)㊁脯氨酸(P)㊁苏氨酸(T)㊁甘氨酸(G)㊁丙氨酸(A)．C D R３区由于其在抗原识别和结合过程中发挥的关键作用,被广泛应用于人工抗体合成和抗体疫苗设计领域[８,９]．实际上,抗体是I g的分泌形式,它们的基因转录本是完全一致的．早期研究证实,C D R３区单个氨基酸残基的改变可影响抗体的结构和功能[２２],且C D R３的长度也与不同类别的抗原识别有关[２３]．C D R３在应用于合成特定功能的抗体时,需构建大批量的合成库以筛选出高亲和力的抗体,而其中多数低亲和力或无功能的抗体将会被过滤掉[２]．因此,我们分析的五类I g的C D R３的特征信息可为不同型别抗体相关的合成设计提供参考数据．当前, I MG T/L I GMＧD B中人的I g重链可变区基因数据仍不充足且缺少细致的分类,因此,利用N G S对不同疾病患者和健康志愿者进行大规模的I g组库测序和构建I g大数据专用的分类存储数据库很有必要的,这些工作的开展与积累或将为抗体工程领域带来新的曙光．４㊀结论本研究利用I MG T/H i g h VＧQ U E S T分析了I MG T/L I GMＧD B来源的人类五类I g重链可变区基因数据,从基因特征上解读了人类五类I g相互间的相似性与差异性,这些结果可作为基于N G S结果的I MG T 标准化比较㊁抗体工程领域的参考数据．参㊀考㊀文㊀献[１]㊀F l a j n i k M F．C o m p a r a t i v e a n a l y s e s o f i m m u n o g l o b u l i n g e n e s:s u r p r i s e s a n d p o r t e n t s[J]．N a tR e v I m m u n o l,２００２,２(９):６８８Ｇ６９８．[２]Z e m l i n M,K l i n g e rMJ,Z e m l i nC,e t a l．E x p r e s s e dm u r i n e a n dh u m a nC D RＧH３i n t e r v a l s o f e q u a l l e n g t h e x h i b i t d i s t i n c t r e p e r t o i r e s t h a td i f fe r i n t h e i r a m i n o a c i d c o m p o s i t i o na n d p r e d i c t e d r a n g e of s t r u c t u r e s[J]．JM o l B i o l,２００３,３３４(４):７３３Ｇ７４９．[３]J u n g D,G i a l l o u r a k i sC,M o s t o s l a v s k y R,e t a l．M e c h a n i s ma n d c o n t r o l o fV(D)J r e c o m b i n a t i o n a t t h e i m m u n o g l o b u l i nh e a v y c h a i n l o c u s [J]．A n n uR e v I m m u n o,２００６,２４:５４１Ｇ５７０．[４]W a n g Y,S u n d l i n g C,W i l s o nR,e t a l．H i g hＧr e s o l u t i o n l o n g i t u d i n a l s t u d y o fH I VＧ１E n v v a c c i n eＧe l i c i t e dBc e l l r e s p o n s e s t o t h e v i r u s p r iＧm a r y r e c e p t o r b i n d i n g s i t e r e v e a l s a f f i n i t y m a t u r a t i o na n d c l o n a l p e r s i s t e n c e[J]．J I m m u n o l,２０１６,１９６(９):３７２９Ｇ３７４３．[５]F a h e y JL．A n t i b o d i e s a n d i m m u n o g l o b u l i n s I S t r u c t u r e a n d f u n c t i o n[J]．J a m a,１９６５,１９４(１):７１Ｇ７４．[６]L e f r a n cMP,G i u d i c e l l i VR,D u r o u xP,e t a l．I MG T(R),t h e i n t e r n a t i o n a l I mM u n o G e n e T i c s i n f o r m a t i o n s y s t e m(R)２５y e a r s o n[J]．N uＧc l e i cA c id sRe s,２０１４,４３(D a t a b a s e i s s u e):D４１３Ｇ４２２．[７]S h i B,M aL,H eX,e t a l．C o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f h u m a n a n dm o u s e i m m u n o g l o b u l i n v a r i a b l e h e a v y r e g i o n s f r o mI M G T/L I GMＧD Bw i t hI MG T/H i g h VＧQ U E S T[J]．T h e o rB i o lM e d M o d e l,２０１４,１１:３０．[８]K n a p p i k A,G eL,H o n e g g e rA,e ta l．F u l l y s y n t h e t i ch u m a nc o m b i n a t o r i a l a n t i b o d y l i b r a r i e s(H u C A L)b a s e do n m o d u l a rc o n s e n s u sf r a m e w o r k s a n dC D R s r a n d o m i z e dw i t h t r i n u c l e o t i d e s[J]．JM o l B i o l,２０００,２９６(１):５７Ｇ８６．[９]Z h uH,L u oH,Y a n M,e t a l．A u t o a n t i g e nm i c r o a r r a y f o rh i g hＧt h r o u g h p u t a u t o a n t i b o d yp r o f i l i n g i ns y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s[J]．G e n o m i c sP r o t e o m i c sB i o i n f o r m a t i c s,２０１５,１３(４):２１０Ｇ２１８．[１０]L i S,L e f r a n cM P,M i l e s J J,e t a l．I MG T/H i g h V Q U E S T p a r a d i g mf o rTc e l l r e c e p t o r I MG Tc l o n o t y p ed i v e r s i t y a n dn e x t g e n e r a t i o n r e p e r t o i r e i m m u n o p r o f i l i n g[J]．N a tC o m m u n,２０１３,４:２３３３．[１１]A o u i n t i S,M a l o u c h eD,G i u d i c e l l iV,e t a l．I M G T/H i g h VＧQ U E S Ts t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e o f I MG Tc l o n o t y p e(A A)d i v e r s i t y p e r g e n e f o r s t a n d a r d i z e dc o m p a r i s o n s o f n e x t g e n e r a t i o n s e q u e n c i n g I m m u n o p r o f i l e s o f I m m u n o g l o b u l i n s a n dTc e l l r e c e p t o r s[J]．P L o SO n e,２０１５,１０(１１):e０１４２３５３．[１２]L e f r a n cMP．I m m u n o g l o b u l i n a n dTc e l l r e c e p t o r g e n e s:I MG Ta n d t h e b i r t h a n d r i s e o f i m m u n o i n f o r m a t i c s[J]．F r o n t I m m u n o l,２０１４,５:２２Ｇ２６．[１３]A o u i n t i S,G i u d i c e l l iV,D u r o u xP,e t a l．I MG T/S t a t c l o n o t y p e f o r p a i r w i s e e v a l u a t i o n a n d v i s u a l i z a t i o no fN G S I Ga n dT RI M G Tc l o n oＧt y p e(A A)D i v e r s i t y o r e x p r e s s i o n f r o mI M G T/H i g h VＧQ U E S T[J]．F r o n t I m m u n o l,２０１６,７:３３９Ｇ３４２．[１４]G i u d i c e l l i V,D u r o u xP,K o s s i d a S,e t a l．I Ga n dT Rs i n g l e c h a i n f r a g m e n t v a r i a b l e(s c F v)s e q u e n c e a n a l y s i s:a n e wa d v a n c e d f u n c t i o n a l i t y o f I M G T/VＧQ U E S Ta n d I M G T/H i g h VＧQ U E S T[J]．B M CI m m u n o l,２０１７,１８(１):３５Ｇ３９．[１５]P r a b a k a r a nP,C h e n W,S i n g a r a y a n M G,e t a l．E x p r e s s e da n t i b o d y r e p e r t o i r e s i nh u m a nc o r db l o o dc e l l s:４５４s e q u e n c i n g a n d I M G T/H i g h VＧQ U E S Ta n a l y s i s o f g e r m l i n e g e n e u s a g e,j u n c t i o n a l d i v e r s i t y a n d s o m a t i cm u t a t i o n s[J]．I m m u n o g e n e t i c s,２０１２,６４(５):３３７Ｇ３５０．[１６]G i u d i c e l l iV ,L e f r a n cM P ．I M G T /j u n c t i o n a n a l y s i s :I MG Ts t a n d a r d i z e d a n a l y s i s o f t h eV ＧJ a n dV ＧD ＧJ j u n c t i o n s o f t h e r e a r r a n g e d i m m u n o Ｇg l o b u l i n s (I G )a n dTc e l l r e c e p t o r s (T R )[J ]．C o l dS p r i n g Ha r bP r o t o c ,２０１１,２０１１(６):７１６Ｇ７２５．[１７]S h i B ,L o n g M ,H eX ,e t a l ．C o m p o s i t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c s o f h u m a n p e r i p h e r a l T R B V p s e u d o g e n e r e a r r a n g e m e n t s [J ]．S c i e n t i f i cR e p o r t s ,２０１８,８(１):５９２６．[１８]R o y A ,B y s t r y V ,B o h nG ,e t a l ．H i g h r e s o l u t i o n I g Hr e p e r t o i r e a n a l y s i s r e v e a l s f e t a l l i v e r a s t h e l i k e l y o r i g i n o f l i f e Ｇl o n g ,i n n a t eB l y m Ｇp h o p o i e s i s i nh u m a n s [J ]．C l i n I m m u n o l ,２０１７,１８３:８Ｇ１６．[１９]L o n g oNS ,R o g o s c hT ,Z e m l i nM ,e t a l ．M e c h a n i s m s t h a t s h a p e h u m a n a n t i b o d y r e p e r t o i r e d e v e l o p m e n t i nm i c e t r a n s g e n i c f o rH u m a n I g Ha n dLc h a i n l o c i [J ]．J I m m u n o l ,２０１７,１９８(１０):３９６３Ｇ３９７７．[２０]W uYC ,J a m e sLK ,V a n d e rH e i d e nJA ,e t a l ．I n f l u e n c eo f s e a s o n a l e x p o s u r e t o g r a s s p o l l e no n l o c a l a n d p e r i p h e r a l b l o o d I g Er e p e r Ｇt o i r e s i n p a t i e n t sw i t ha l l e r g i c r h i n i t i s [J ]．JA l l e r g y C l i n I m m u n o l ,２０１４,１３４(３):６０４Ｇ６１２．[２１]T h i e l eB ,K l o s t e rM ,A l a w iM ,e t a l ．N e x t Ｇg e n e r a t i o n s e q u e n c i n g o f p e r i p h e r a l B Ｇl i n e a g e c e l l s p i n p o i n t s t h e c i r c u l a t i n g c l o n o t y p i c c e l l p o o l i nm u l t i p l em ye l o m a [J ]．B l o o d ,２０１４,１２３(２３):３６１８Ｇ３６２１．[２２]S h o r tM K ,J ef f r e y PD ,D e m i r j i a nA ,e t a l ．As i ng l eH :C D R ３r e s i d u e i n th e a n ti Ｇd i g o x i na n t i b o d y ２６Ｇ１０m o d u l a t e s s p e c i f i c i t y f o rC １６Ｇs u b s t i t u t e dd i g o x i na n a l o g s [J ]．P r o t e i nE n g ,２００１,１４(４):２８７Ｇ２９６．[２３]C o l l i sA V ,B r o u w e rAP ,M a r t i nAC ．A n a l y s i s o f t h e a n t i g e nc o m b i n i n g s i t e :c o r r e l a t i o n sb e t w e e n l e n g t ha n ds e q u e n c e c o m po s i t i o no f t h eh y p e r v a r i a b l e l o o p s a n d t h e n a t u r e o f t h e a n t i g e n [J ]．JM o l B i o l ,２００３,３２５(２):３３７Ｇ３５４．C h a r a c t e r i z a t i o no f t h eH e a v y C h a i nV a r i a b l eR e g i o n G e n e o fH u m a n I m m u n o gl o b u l i n s S H IB i n １,２㊀MAJ i a Ｇx i n ２㊀T U W e n Ｇj i n g ２㊀WU H a o Ｇm i n g ２㊀C H EN X i a n Ｇl i a n ２(１．D e p a r t m e n t o fL a b o r a t o r y M e d i c i n e ,T h eF i r s tA f l i a t e dH o s p i t a l o f Z u n y iM e d i c a lU n i v e r s i t y ,Z u n yi ５６３０００,C h i n a ;２．S c h o o l o fL a b o r a t o r y M e d i c i n e ,Z u n y iM e d i c a lU n i v e r s i t y ,Z u n yi ５６３０００,C h i n a )A b s t r a c t ㊀O b j e c t i v e :T o a n a l y z e t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f f i v e t y p e s o f i m m u n o g l o b u l i nh e a v y ch a i n v a r i a Ｇb l e r e g i o n g e n e s ．M e t h o d :T h e g e n es e q u e n c e so f t h eh e a v y c h a i nv a r i a b l e r e g i o n so fh u m a nI g we r eo b Ｇt a i n e df r o mt h e I MG T /L I GM ＧD Bd a t a b a s e ．A ne x t e n s i v ea n a l y s i so f t h e s eg e n e sw a s i m p l e m e n t e du s i n g I MG T /H i gh V ＧQ U E S T ,i n c l u d i n gg e n eu s a g e ,a m i n oa c i d (A A )c h a n g e s i nVr e g i o n ,l e n g t hd i s t r i b u t i o n a n d c o m p o s i t i o no fC D R ３a m i n o a c i d a n dj u n c t i o n a l d i v e r s i t y ．R e s u l t s :I G H J ４,I G H V １Ｇ６９a n d I G H V ５Ｇ５１w e r em o r e f r e q u e n t l y u s e d i n I g M ,I g Ga n d I g E ．A n d s e v e r a l s i m i l a r s u p e r i o rV ＧJ p a i r i n gsw e r e o b s e r v e d i n I g M ,I g G ,I g Aa n d I g E ．T h e r ew a s ah i g h e rm u t a t i o n l e v e l o fVr e g i o n i nI g D w h i c h m a i n l y re f l e c t e d i n F R ３r e g i o n (n u m b e r o fA Ac h a n g e s ＝７．２ʃ２．４),w h i l e t h em u t a t i o n s i n e a c hd o m a i no f I g M w e r e s i g n i f i Ｇc a n t l y l o w e r t h a n t h o s eo fo t h e r I g s ．I na d d i t i o n ,I g Dh a sah i g h e r i n c i d e n c eo fPi n s e r t i o na n dah i gh e r n u m b e r o f n u c l e o t i d e s t h a no t h e r I g s ．C o n c l u s i o n :T h i s s t u d y d e s c r i b e s t h e s i m i l a r i t i e s a n dd i f f e r e n c e s a Ｇm o n g h u m a n f i v e t y p e s o f I g f r o mt h e g e n e t i c c h a r a c t e r i s t i c s ．T h e s e r e s u l t s c a n p r o v i d e i m po r t a n t r e f e r e n c e d a t a f o r t h e f i e l do f a n t i b o d y e n g i n e e r i n g．K e y wo r d s ㊀I g ;h e a v y c h a i nv a r i a b l e r e g i o n g e n e ;C D R ３;I MG T /L I GM ＧD B ７１第４期石彬,等:人免疫球蛋白重链可变区基因的特征分析。

免疫球蛋白复习题一、选择题[A型题]1.抗体和抗原结合的部位是DA.重链的C区B.重链的V区C.轻链的V区D.重链和轻链的V区E.重链和轻链的C区2.血清中含量最高的Iｇ是DA.IgMB.IgAC.IgED.IgGE.IgD3.关于抗体和免疫球蛋白,以下哪项是正确的?EA.免疫球蛋白就是抗体B.免疫球蛋白均为抗体,担抗体不一定都是免疫球蛋白C.免疫球蛋白与抗体不同也无关D.免疫球蛋白均为抗体,但两者特性不同E.抗体均为免疫球蛋白,但免疫球蛋白不一定都是抗体4.脐带血中主要有哪类Ig？BA.IgDB.IgMC.IgGD.IgAE.IgE5.种系发育过程中出现最早的Iｇ是BA.IgDB.IgMC.IgGD.IgAE.IgE6.人类血清中各类Ig所含κ与λ链的比例大约是BA.1∶1B.2∶1C.1∶2D.3∶1E.1∶37.Ig分子的独特型决定簇位于EA.重链C区B.轻链C区C.重链V区D.轻链V区E.重链和轻链的超变区8.Iｇ分子的Fab片段的功能是 DA.通过胎盘B.激活补体C.趋化作用D.结合抗原E.结合细胞9.用绵羊红细胞免疫家兔最早产生的抗体是BA.IgGB.IgMC.IgAD.IgEE.IgD10.下列哪种物质不是抗体?CA.抗破伤风血清B.伤寒杆菌诊断血清C.浆细胞瘤分泌的IgD.胎盘球蛋白E.丙种球蛋白11.木瓜蛋白酶水解IｇG的产物是CA.Fab段B.Fc段C.2Fab段＋Fc段D.2Fab段E.F(ab′)2＋Fc′12.胃蛋白酶水解IｇG的产物是EA.Fab段+Fc段B.Fc段C.2Fab段D.2Fab段+Fc段E.F(ab′)2＋pFc′13.SIgA有几抗原结合位点CA.1个B.2个C.4个D.6个E.10个14.人Iｇ分成五类的主要依据是BA.轻链抗原性B.重链抗原性C.二硫键的位置D.单体数E.分子量的大小15.在粘膜局部主要起免疫作用的抗体是CA.IgGB.IgMC.IgAD.IgEE.IgD16.新生儿从母乳中获得的Iｇ是BA.IgGB.SIgAC.IgMD.IgDE.IgE17.发生子宫内感染时,新生儿血液中应出现高滴度的CA.IgGB.IgAC.IgMD.IgDE.IgE18.天然血型抗体属于CA.IgGB.IgAC.IgMD.IgDE.IgE19.血清中各类Iｇ的浓度依次是AA.IｇG＞IｇA＞IｇM＞IｇD＞IｇEＢ.IｇＭ＞IｇG＞IｇＡ＞IｇＤ＞IｇＥC.IｇG＞IｇM＞IｇＡ＞IｇＤ＞IｇＥD.IｇA＞IｇG＞IｇM＞IｇE＞IｇDE.IｇＭ＞IｇA＞IｇG＞IｇE＞IｇD20.免疫球蛋白多肽的可变区为CA.N端轻链的1/4与重链的1/2B.N端轻链的1/3与重链的1/4C.N端轻链的1/2与重链的1/4D.N端轻链的1/2与重链的1/2E.N端轻链的1/2与重链的1/321.免疫球蛋白多肽的稳定区为 BA.C端轻链的1/4与重链的3/4B.C端轻链的1/2与重链的3/4C.C端轻链的3/4与重链的1/2D.C端轻链的1/2与重链的1/2E.C端轻链的3/4与重链的3/422.关于抗体的作用，下列哪项是错误的CA.中和外毒素B.中和病毒C.清除细胞内寄生菌D.免疫调理作用E.参与超敏反应23.五聚体IｇＭ,一般只有几个结合位点可结合抗原?EA.1个B.2个C.4个D.5个E.10个24.具有CH4功能区的Ig分子是AA.IｇG和IgAB.IｇM和IgEC.IｇM和sIgAD.IｇD和IgEE.IｇG和sIgA25.特定B细胞对抗原的特异性DA.是通过与抗原的相互作用后诱导的B.是由L链的氨基酸序列决定的C.是由同种型类别转换决定的D.是由mIg的H链和L链的V区序列决定的E.由H链的恒定区决定的26.关于抗体，下列哪项是错误的?EA.抗体是指具有免疫功能的球蛋白B.抗体主要存在于血液、体液、黏膜表面及分泌液中C.抗体是能与相应抗原特异性结合的球蛋白D.抗体都是免疫球蛋白E.抗体都是体内产生的27.能与肥大细胞表面FcR结合，并介导I型超敏反应的Ig是CA.IgAB.IgDC.IgED.IgME.IgG28.合成SIgA分泌片的细胞是DA.巨噬细胞B.血管内皮细胞C..浆细胞D.黏膜上皮细胞E.肥大细胞29.下列分泌液中不含IgA的是 CA.唾液B.初乳C..汗液D..肠道分泌液E.支气管黏液30.人体内开始合成lgM的时间是BA.胎儿早期B.胎儿晚期C.出生后1个月D.出生后3个月E.出生后6个月31.下列哪种细胞具有IgE FcRBA.平滑肌细胞B.嗜碱性粒细胞C.中性粒细胞D.单核细胞E.血管内皮细胞32.IgG分子能与细胞表面FcγR结合的区域是EA.VLB.VHC.CH1D.CH2E.CH333.介导NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞发挥ADCC效应的Ig主要是CA.IgAB.IgMC.IgGD.IgDE.IgE34.SIgA的J链的合成细胞是EA.黏膜下浆细胞B.淋巴结中的浆细胞C.B细胞D.巨噬细胞E.黏膜上皮细胞35.关于IgG的错误叙述是EA.可四个亚类B.可通过胎盘C.抗原结合价为二价D.CH2有补体C1q结合点E.经木瓜蛋白酶水解后可获得一个F(ab′)2片段36.关于IgE，下列哪项是错误的?EA.在五类Ig中含量最低B.有CH4g功能区C.可介导I型超敏反应D.有亲细胞性E.在种系发育过程中最早发生[X型题]1.免疫球蛋白球的功能有A.激活补体B.调理作用C.通过胎盘D.ADCC作用E.参与超敏反应2.Ig存在于A.血液中B.尿液中C.乳汁中D.唾液中E.某些细胞的细胞膜上3.关于IｇE正确的叙述是A.正常血中含量在五类免疫球蛋白中最低B.分泌液中含量最大C.多发性骨髓瘤最为常见D.和肥大细胞的关系最为密切E.是种系进化过程中出现最晚的Ig4.ADCC具有下列哪些特点A.靶细胞与特异性抗体结合B.Mφ、NK细胞、中性粒细胞在特异性抗体介导下杀伤靶细胞C.对靶细胞的杀伤作用是非特异性的D.需要补体参与E.靶细胞上MHC分子参与ADCC5.IgM的特性包括A.是分子量最大的Ig，称为巨球蛋白B.无铰链区C.主要在血液中发挥抗感染作用D.是最早合成的IgE.激活补体的能力比IgG强6.IgD的特性包括A.性质不稳定，易被蛋白酶降解B.为未成熟B淋巴细胞的主要标志C.可以通过胎盘D.血清IgD的功能尚不清楚E.多数以多聚体形式存在7.SIgA的结构包括A.α链B.κ或λ链C.J链D.SCE.糖基8.IgG能与下列哪些分子结合A.C1qB.CKsC.SPAD.FcγRE.Ag9.关于铰链区的叙述，下列哪些是正确的A.铰链区是Ig的独立功能区B.IgM、IgE无铰链区C.富含脯氨酸，易发生伸展及转动D.对蛋白酶敏感E.IgG的铰链区位于CH1和CH2之间10.关于Ig高变区的叙述，下列哪些是正确的A.氨基酸组成与排列顺序具有高的变化程度B.在结构上与抗原决定基互补C.由HVR和骨架区组成D.是Ig分子独特型决定基主要存在部位E.H链与L链各有4个高变区11.免疫球蛋白的抗原性包括A.同种型B.独特型C.抗独特型D.同种异型E.亚型12.抗体的调理机制是A.抗体在抗原颗粒和吞噬细胞间“搭桥”B.改变抗原表面电荷，降低抗原与吞噬细胞间静电斥力C.抗体中和抗原表面的抗吞噬物质D.抗原抗体复合物通过与FcR结合活化吞噬细胞E.抗体刺激吞噬细胞产生粘附分子13.关于单克隆抗体，下列哪项是正确的?A.结构高度均一B.特异性强，极少或不发生交叉反应C.一种单克隆抗体，只能识别一种抗原表位D.一种单克隆抗体，其独特型可以不同E.单克隆抗体是由骨髓瘤细胞产生的14.关于IgM的生物学功能，下列哪些是正确的?A.在机体早期免疫防御中起重要作用B.初次免疫接种后最先产生的抗体C.B淋巴细胞抗原受体的重要成分D.数抗菌、抗病毒、抗毒素抗体都属于IgME.能激活补体二、填空题1.五类Ig分别称为、、、、；其H链分别是、、、、链。

[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 101580831A [43]公开日2009年11月18日[21]申请号200810037428.8[22]申请日2008.05.15[21]申请号200810037428.8[71]申请人中国科学院上海生命科学研究院地址200031上海市岳阳路320号[72]发明人孙兵 王茜 [74]专利代理机构上海专利商标事务所有限公司代理人范征[51]Int.CI.C12N 15/10 (2006.01)C12N 15/11 (2006.01)权利要求书 2 页 说明书 22 页 附图 1 页[54]发明名称扩增抗体重链前导序列及可变区基因序列的方法及其引物[57]摘要本发明公开了一种特别适合于扩增单克隆抗体重链基因的引物，所述的引物具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的序列。

所述的引物适用于多种类型的单克隆抗体重链可变区的扩增，包括IgG1，IgG2a，IgG2b等抗体亚型。

本发明还公开了一种获得单克隆抗体重链基因的方法。

200810037428.8权 利 要 求 书第1/2页 1.一种获得单克隆抗体重链基因的方法，其特征在于，所述方法包括： (1)以SEQ ID NO：1所示序列为引物，以杂交瘤细胞的RNA为模板，进行反转录，获得cDNA；(2)在反转录获得的cDNA的3’末端加上多聚N，获得加尾产物；其中N是选自A、T、C或G之一的碱基，N的个数是5-120个；(3)以SEQ ID NO：2所示序列和多聚M为引物，以加尾产物为模板，进行PCR扩增，获得扩增产物；其中M是选自A、T、C或G之一且与N互补配对的碱基，M的个数是10-40个；和(4)从扩增产物中分离获得单克隆抗体重链基因。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，N是选自C或G的碱基。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，PCR扩增的热循环过程中，退火温度是60-65℃。

浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis , 2021,33(1) : 27 - 33htt y ：//www. zjnyxb. cn徐海，王健，郭长明，等•单域抗体T7噬菌体展示文库构建与鉴定[J ] •浙江农业学报,2020,33(1)： 27 -33.DOI ： 10. 3969/j. issn. 1004-1524. 2021. 01. 04单域抗体T7噬菌体展示文库构建与鉴定徐海1，王健S 郭长明S 董洪燕S 邓碧华2,侯继波2!*收稿日期:2020-05-O基金项目：江苏农牧科技职业学院院级课题(NSF201902)作者简介:徐海(1982-),男，江苏扬州人，硕士，副研究员，主要从事噬菌体展示技术研究与应用)******************** 通信作者,侯继波，E-mail ： houjibo@jaas. ac. cn(1.江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏泰州225300； 2.江苏省农业科学院动物免疫工程研究所，江苏南京210014)摘要:优化噬菌体展示文库构建策略，获得高品质羊驼源天然纳米抗体T7噬菌体展示文库,并对文库质量 进行鉴定。

分离羊驼外周血淋巴细胞,提取总RNA ,RT-CR 扩增羊驼重链抗体可变区(VHH )基因，插入T7 select 415-1b 噬菌体载体构建文库，计算文库的库容量，测定文库传代稳定性。

测序分析VHH 基因的多样性和纳米抗体氨基酸序列特征。

Western-blot 检测纳米抗体在噬菌体表面的表达情况，电镜观察文库中重组噬菌体颗粒形态。

结果表明,构建羊驼源纳米抗体T7噬菌体展示文库,有效库容达到2. 73 i 109 PFU ；纳米抗 体与羊驼源抗体同源性高,氨基酸序列显示纳米抗体特征区域,并其在噬菌体表面高拷贝表达;重组噬菌体颗粒结构完整,但随着传代出现插入基因的丢失) 关键词：羊驼;纳米抗体;T7噬菌体;表面展示中图分类号:Q939. 48 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2021)01-0027-07Construction and idenhbcahon of nanobody T7 phage display libraryXU Hai 1 , WANG Jian 1 , GUO Changming 1 , DONG Hongyan 1 , DENG BiPua 1 , HOU Jibo 2' *(1. Jiangsu Key Laboratoroyor High-TecC Research and Development f Veterinare Biophargaceuticals , Jiangss Agri-afimal Huseandre Vocational College , Taizhoo 225300, China ； 2. Institute fg Veterinare ymmunology & Engineer ­ing , Jiangsu Academy of Agricdtural Sciences , Nanjing 210014, China )Abstract: To construct a high-quality natural alyaca nanobody phage display librara by strategy optimization, ands0stematica a identieied thequaait oetheaibeae , thetotaaRNAwasisoaated eoempeeipheeaabaood mononucaeaece aoe6 aapacasand then eeveeseteansceipted intocDNA.The VHH genewasampaieied and inseetintopaasmid and T7seaect415 -1 b vectoe , eespectivea , toconsteuctpaasmid and phagedispaa0aibeae.Thephageaibeae wasidentieiedb0voaumecaacuaating , peopagatingstabiaittestingand sequencing.Theexpee s ion oenanobod0wastested b0West- een-baot , and thesteuctueeoephagepaeticaesweeedetected b0eaecteon miceoscop0.Resuatsshowed thatthee e e ctive volume of phage librae was 2. 73 i 109 PFU , and VHH nanobody was successfully displayed on T7 phage surface inhigh copynumbNe.SNquNncNanaaysisshowNd thatVHH nanobodyhad high homoaogywith aapacaantibody.RNcom-binantphagNpeNsNntd intactpaetica steuctueNthNsamNasthNdonat T7 sNact415-1 b phagN.HowNvNe , dueingcontinuouspa s agNapaetoeeNcombinantphagNswouad aostthNinsNetVHH gNnN , which indicatd thatonayaowNe-gNnNeation phagNaibeaeycouad bNusNd eoea e i nitysceNning.Key words: alyaca ； nanobody ； T7 phage ； surface display-28-浙江农业学报第33卷第1期1985年Smith首次利用丝状噬菌体表达外源基因，开启了噬菌体展示技术的研究［1'2］o将外源DNA片段插入噬菌体基因组中，使外源基因与噬菌体衣壳蛋白基因融合表达，所编码的外源蛋白被展示在噬菌体的表面，其最大优势在于将基因型与表型进行统一。