蛋白质酪氨酸磷酸化_免疫沉淀及Western印迹两种方法的比较_陈沙力

蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验，WesternBlot）蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）即 Western Blot。

它是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法。

其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或⽣物组织样品进⾏着⾊。

通过分析着⾊的位置和着⾊深度获得特定蛋⽩质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

蛋⽩免疫印迹（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织中蛋⽩质从凝胶转移到固相⽀持物NC膜或PVDF膜上，然后⽤特异性抗体检测某特定抗原的⼀种蛋⽩质检测技术，现已⼴泛应⽤于基因在蛋⽩⽔平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个⽅⾯。

⼀提起Western blot，⼤家会不禁联想到Southern blot和Northern blot。

其实它们的名字也是个有趣的故事。

1975年，Edwin Southern教授发明了DNA杂交检测技术，故命名为Southern blot。

之后，James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授⼜发明了RNA杂交检测技术，因与Southern blot相似，故命名为Northern。

George Stark这位⽜⼈教授在两年后⼜开发出类似的蛋⽩质检测⽅法。

1981年，Neal Burnette将其命名为Western blot。

为什么当时没叫Eastern blot呢？这⽆从考证，不过科学家们还真是挺有创意的。

30年来， Western blot技术已成为蛋⽩质研究中最常⽤的⼯具。

它的标准流程如下：蛋⽩质⾸先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过电泳转移到固相⽀持物上，固相⽀持物包括硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜。

⾸先将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的⾮特异性吸附，这样固定的蛋⽩质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作⽤。

最后通过放射、⽣⾊或化学发光的⽅法进⾏定位。

Western Blot原理与Northern Blot、Southern blot类似。

做磷酸化蛋白的westernblot如何事半功倍？本人的研究生实验被western blot承包了，尤其是做磷酸化蛋白上摸爬滚打了这么多年，所以总结下自己的经验，希望能助同道中人一臂之力，少走点弯路，早日出结果发paper, 迎娶白富美，走向人生巅峰那首先先思考几个问题，什么是蛋白质磷酸化？在哪些位点发生蛋白质的磷酸化呢？发生磷酸化有什么作用呢？下面我们来一一揭晓蛋白质磷酸化的神奇面纱：Q1: 什么是蛋白质磷酸化呢？蛋白质磷酸化是在蛋白质激酶催化下，把ATP的磷酸基转移到其他蛋白质氨基酸残基。

Q2: 什么是蛋白质的去磷酸化呢？上述磷酸化的蛋白在蛋白磷酸酶的作用下去磷酸化，这个过程是可逆的图所示Q3: 蛋白质磷酸化主要发生的氨基酸残基是谁呢？蛋白质磷酸化主要发生在两种氨基酸上，一种是丝氨酸(包括苏氨酸)，另一种是酪氨酸Q4: 蛋白质磷酸化的作用？蛋白质磷酸化是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。

好啦，知道蛋白质磷酸化是怎么一回事，那通过什么手段检测蛋白质是否磷酸化以及磷酸化水平呢？那常用到的方法就是western blot啦，有人会说western blot还不好做吗？那可是研究生的技能标配，但是磷酸化蛋白的western blot就不能小看了，多少人在这里摸爬滚打，绞尽脑汁。

好了下面重点来了，赶紧搬个小板凳认真学起来。

收蛋白样：1、收蛋白样一定冰上操作，动作要快，防止磷酸化蛋白的降解；2、蛋白裂解液配置：蛋白裂解液RAPI：蛋白酶抑制剂PMSF=100:1, 因为蛋白裂解液RAPI中含有NaF（抑制酸性磷酸酶），所以不加磷酸酶抑制剂也是可以跑出很漂亮的条带;3、如果自己配置的蛋白裂解液不含磷酸酶抑制剂，为了防止磷酸化蛋白的降解，可根据需要另行添加磷酸酶抑制剂（氟化钠NaF：抑制酸性磷酸酶，使用浓度10mM; 正钒酸钠Na3VO4：抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶，使用浓度1 mM；焦磷酸钠Na2P2O4：抑制丝氨酸-苏氨酸磷酸酶，使用浓度1 mM）；4、蛋白裂解后4℃离心后，最好立即加入loading buffer进行煮沸变性，也是防止磷酸酶降解磷酸蛋白。

实验四蛋白质印迹分析【实验目的】了解蛋白质印迹法的基本原理及其操作和应用。

【实验原理】蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。

待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化, 另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别。

如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋白首先要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离；通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗体(一抗) 与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白。

值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白，如牛血清白蛋白对膜进行“封阻” 而防止抗体与膜的非特异性结合。

经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上, 我们把这个过程称为电泳印迹。

常用的两种电转移方法分别为:1.半干法: 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10 分钟~30 分钟。

2. 湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45 分钟延长到过夜进行。

由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这里只描述湿法的基本操作过程。

对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体。

该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。

这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应，该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上，容易鉴别。

因此可通过对二抗的识别而识别一抗，进而判断出目标蛋白所在的位置。

其他的识别系统包括碱性磷酸酶系统和125I 标记系统。

【实验材料】1. 实验器材SDS/PAGE实验相关材料；电转移装置；供电设备；PVDF膜 ( Millipore Immobion-P #IPVH 000 10 ); Whatman 3MM纸；其他工具：镊子、海绵垫、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、浅盘。

免疫组化技术与Westernblotting、ELISA的异同
1）是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

2）Western blotting
蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。

与免疫组化技术相比，定量可能更加准确;当然Western blotting也可定性和定位(通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位)，但敏感性远远低于免疫组化技术。

3）ELISA
酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。

与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。

免疫印迹怎么测定磷酸化的蛋白免疫印迹（Western blot，WB）是利用抗原抗体特异性结合的原理，基于SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白质分离、纯化以及相互作用研究的技术，也是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法。

蛋白印迹技术先利用SDS-PAGE分离蛋白质样品，随后将电泳条带转移到固相载体膜上（如PVDF或尼龙膜），再利用磷酸化特异的抗体（一抗）来鉴定目的蛋白，能与磷酸化特异抗体结合的蛋白质即为磷酸化蛋白，最后通过标记的二抗识别一抗可以指示一抗的位置，即是待研究的磷酸化蛋白质的位置。

免疫印迹法不适用放射性32P标记，避免了使用放射性同位素时的危险品和废物处理。

此外，磷酸化抗体的灵敏性较强，可以轻松的检测常规细胞提取物中的磷酸化蛋白，对样品的用量要求不算严格。

WB除了能定性检测磷酸化蛋白外，还能一定程度上评估磷酸化蛋白质的水平，由于受到不同实验处理和凝集上样误差的影响，通常先用一个抗体来检测同源蛋白的总水平(而不考虑磷酸化状态)，以确定磷酸化组分相对于总组分的比例，并充当上样内对照。

百泰派克生物科技拥有纯熟的免疫印迹技术，专业的技术分析团队，为您提供一站式磷酸化蛋白免疫印迹鉴定服务，可以根据您的需求定制实验，并对可能影响结果的潜在因素进行评估。

我们承诺给出的数据可靠，且可重复性高。

欢迎免费咨询：（微信同号）。

相关服务：Far-Western Blot分析。

翻译后修饰蛋白组分析。

磷酸化定量蛋白组学研究。

免疫共沉淀法（CO-IP）结合质谱联用的蛋白互作分析。

蛋白质相互作用分析。

蛋白质相互作用质谱分析。

SILAC与免疫共沉淀质谱联用的蛋白互作分析。

交联法蛋白相互作用分析。

标记转移法蛋白相互作用分析。

Pull-down靶蛋白质谱鉴定。

蛋白磷酸化实验方法蛋白磷酸化实验方法主要包括以下几种：1. Western blot：这是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法，利用SDS-PAGE分离生物样品，随后转移到膜上(通常是PVDF或尼龙膜)，之后利用磷酸化特异的抗体来鉴定目的蛋白。

2. 放射性标记法：先用32P标记ATP，通过细胞代谢标记到磷酸化蛋白质上，再经一维或二维凝胶电泳或色谱法进行分离，最后通过放射自显影进行检测。

3. 免疫印迹法：基于抗体特异性结合抗原的原理，利用抗磷酸化氨基酸抗体与电泳分离得到的磷酸化蛋白质进行免疫印迹反应来检测磷酸化蛋白质。

在实验中，通常将免疫印迹与免疫沉淀结合使用，因为磷酸化蛋白质的含量较低，先利用免疫沉淀法对磷酸化蛋白质进行富集，可以降低非磷酸化蛋白质的干扰。

4. 荧光染色法：利用荧光染料直接对凝胶中结合在酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基上的磷酸进行选择性染色，再通过荧光扫描仪检测就能直接鉴别出磷酸化的蛋白质。

5. 质谱法：首先将含磷酸化修饰的蛋白样品进行酶切，然后对酸化肽段进行富集，再将富集得到的磷酸化肽段进行串联质谱分析，最后利用质谱数据结合生物信息学分析对磷酸化蛋白质进行鉴定。

6. ELISA：ELISA已逐渐成为测定蛋白磷酸化的一种有力方法。

这种微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特异的捕获抗体，与磷酸化状态无关。

随后让目的蛋白结合在抗体包被的分析板中，目的蛋白可以是纯的，也可以是复杂的异质样品(如细胞裂解液)中的一个组分。

加入待分析的磷酸化位点特异的检测抗体。

这些分析通常设计为显色或荧光检测。

产生的信号强度与最初样品中存在的磷酸化蛋白的浓度成正比。

与更为传统的免疫印迹相比，磷酸化特异的ELISA技术具有一些优点。

首先，利用经过校准的标准品，可轻松定量结果。

其次，以三明治形式使用目的蛋白特异的两个抗体，带来了高的特异性。

第三，ELISA的灵敏度更高允许使用更少量样品，检测低丰度的蛋白。

最后，微孔板形式的通量比传统的Western blotting要高得多。

Western实验原理免疫印迹（Western Blotting）的基本原理及应用免疫印迹是一个用于蛋白质分析的常规技术，在电场的作用下将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持物，然后利用抗原-抗体的特异性反应，从蛋白混合物中检测出目标蛋白，从而定量或定性的确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况。

Western blotting还可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续分析，作为一种廉价、便捷、可靠的研究工具，将与质谱和蛋白质芯片等技术一起在蛋白质组时代发挥重要作用。

Western Blotting的protocol种类繁多，但大同小异，基本为上述几个步骤。

要得到一个完美的实验结果，不仅需要优质的抗体，同时应对整个实验流程和体系进行严格的质量控制，才能最终达到你的实验目的。

影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位性质。

因为涉及到抗原样品的变性，只有那些识别耐变性表位的抗体可以与抗原结合。

多数多克隆抗体中或多或少含有这种类型的抗体，所以在免疫印迹中常选用多克隆抗体。

第二个影响因素是蛋白原液中抗原的浓度。

一些表达量低的蛋白在免疫印迹前常需要通过免疫沉淀，亚细胞分离等手段富集。

Western实验步骤基本实验步骤一、样品制备对于Western Blotting实验而言，样品处理是关键步骤之一，获得的蛋白样品必须均质、可溶，并解离成单个多肽亚基，且尽量减少相互间的聚集，使其最终仅依赖本身的分子量大小进行分离。

当目标蛋白的含量很低时，需要选取目标蛋白含量较高的组织或细胞器（如核抽提物），或者通过免疫沉淀等方式进行富集。

通常样品有重组蛋白、细胞和组织等。

1.样品收集1）培养的细胞贴壁和悬浮细胞收集方式不同，细胞裂解液种类各异，推荐含SDS的凝胶加样缓冲液裂解，煮沸即可。

2）动物组织与细胞不同，组织块由于体积较大，须预先经破碎匀浆处理。

2．样品定量样品电泳前需测定蛋白浓度，以便保证上样量一致，有利于后续定量或半定量分析。

药物分析中的蛋白质磷酸化分析技术研究1. 引言蛋白质磷酸化是一种重要的细胞信号传导方式，参与调控细胞的生理和病理过程。

药物研究中，了解蛋白质是否被磷酸化，以及磷酸化的程度，对于理解药物靶点、药效机制以及发现新的治疗靶点具有重要意义。

本文将介绍药物分析中的蛋白质磷酸化分析技术的研究进展及应用。

2. 蛋白质磷酸化的分析方法2.1 免疫印迹法免疫印迹法是最早用于检测蛋白质磷酸化的方法之一。

该方法利用特异性的抗体与目标蛋白质结合，再通过酶标记的二抗进行信号放大，最终通过底物的发光或显色反应来检测蛋白质磷酸化水平。

免疫印迹法具有灵敏度高、操作简便等优点，且可同时检测多个靶点。

2.2 质谱法质谱法是一种高分辨率的蛋白质分析技术，也被广泛应用于蛋白质磷酸化的研究。

代表性的方法有质谱光谱法和质谱成像法。

质谱光谱法通过质谱仪器分析磷酸化产生的质谱图谱，从而鉴定和定量蛋白质磷酸化水平。

质谱成像法则可以将荧光探针和质谱技术结合，实现对蛋白质磷酸化的直观可视化。

2.3 磷酸化位点特异性酶切法磷酸化位点特异性酶切法利用特定的蛋白酶识别和切割蛋白质的磷酸化位点，从而将磷酸化和非磷酸化的蛋白质区分开来。

通过质谱法或免疫印迹法等技术进一步分析切割后蛋白质的磷酸化水平，用于研究磷酸化的生物学功能和相应靶向药物的发现。

3. 蛋白质磷酸化的应用3.1 药物靶点鉴定蛋白质磷酸化分析可用于帮助药物研究人员鉴定药物的作用靶点。

通过分析药物处理后的蛋白质磷酸化模式，可以确定药物是否与特定的蛋白质发生相互作用，并进一步研究该蛋白质在疾病发生发展中的作用机制。

3.2 药效机制研究药物的疗效与其作用靶点及所调控的信号通路密切相关。

蛋白质磷酸化分析可以帮助研究人员深入了解药物对靶点蛋白质的调控机制，揭示药物与细胞信号传导之间的相互作用关系，从而为药效机制的研究提供重要的信息。

3.3 新药物靶点发现通过对疾病相关信号通路上关键蛋白质的磷酸化分析，可以发现新的治疗靶点。

首都师范大学学报(自然科学版)第27卷　第6期2006年12月Journal of Capital N ormal University(Natural Science Edition )V ol.27,N o.6Dec.　2006蛋白质的磷酸化修饰及其研究方法张　倩　杨　振　安学丽　王爱丽　李巧云　晏月明3(首都师范大学生命科学学院,北京　100037)摘要 蛋白质磷酸化是一种重要的翻译后修饰,它参与和调控生物体内的许多生命活动。

随着蛋白质组技术的不断发展,蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。

本文介绍了蛋白质磷酸化修饰的主要类型与功能、磷酸化蛋白质及磷酸化肽的标记和分离与富集、磷酸化肽及磷酸化位点分析以及蛋白质的磷酸化改性等方法,并综述了近年来国内外的主要研究进展。

关键词:磷酸化,磷酸化蛋白质,磷酸化肽,磷酸化改性,质谱.中图分类号:Q 753收稿日期:20052092273通讯作者 蛋白质磷酸化(Protein phosphorylation )是生物界最普遍,也是最重要的一种蛋白质翻译后修饰(P ost 2translational m odifications ,PT Ms ),20世纪50年代以来一直被生物学家看作是一种动态的生物调节过程.在细胞中,大约有1/3的蛋白质被认为是经过磷酸化修饰的[1].在人类基因组中,大约有2%的基因编码了500种激酶和100种磷酸酶[2].蛋白质磷酸化和去磷酸化是原核和真核生物细胞表达调控的关键环节,对许多生物的细胞功能起开关调控作用,是一种普遍的重要调节机制.因此,蛋白质磷酸化的分析和磷酸化位点的鉴定已成为目前蛋白质组学研究的焦点之一.1　蛋白质磷酸化的主要类型与功能磷酸化蛋白质根据其磷酸氨基酸残基的不同大致可分为四类,即:O 2磷酸盐、N 2磷酸盐、酰基磷酸盐和S 2磷酸盐.O 2磷酸盐是通过羟氨基酸的磷酸化形成的,如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸,羟脯氨酸或羟赖氨酸磷酸化仍不清楚;N 2磷酸盐是通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成的;酰基磷酸盐是通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成;而S 2磷酸盐通过半胱氨酸磷酸化形成.蛋白质磷酸化具有以下功能:(1)磷酸化参与酶作用机制,在此过程磷酸化为反应性中间产物(多为S 2或N 2磷酸盐),如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依赖的磷酸转移酶系统(PTR )的组氨酸蛋白激酶(HPr );(2)磷酸化介导蛋白活性,蛋白分子通过蛋白激酶发生磷酸化,如蛋白激酶A (丝氨酸和苏氨酸残基)或不同的受体酪氨酸激酶(酪氨酸残基);(3)天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细菌趋化反应的感觉性传导中发生解离.2　磷酸化蛋白质及磷酸化肽的标记传统磷酸化蛋白质分析大多利用32P 放射性标记.Lees 2Miller 和Anders on [3]利用放射性32P 对人体内的两种热休克蛋白进行了标记,最终鉴定出保守的丝氨酸磷酸化位点.de Carvalho 等[4]在昆虫细胞表达了人的单核细胞中的细胞质磷脂酶A2,并采用放射性32P 标记法鉴定出磷酸化蛋白及其磷酸化位点.尽管人们至今仍广泛地运用放射性同位素标记法分析蛋白质磷酸化,但是这种方法的固有缺点是显而易见的.首先,这种方法存在放射性污染问题;其次,在某一专一蛋白激酶或者蛋白质体外磷酸化条件还不清楚的情况下,需要分析内源性蛋白质磷酸化时,这种方法就无能为力了.从20世纪80年代起,人们开始研究蛋白质磷酸化分析的非放射性方法.Meyer等[5]报道了用ABI 470气相蛋白质顺序仪固相法非放射分析磷酸化酪氨酸,并采用毛细管电泳鉴定从顺序仪上收集得到的流出液中的磷酸化酪氨酸PTH衍生物.车发云等[6]进一步建立了运用毛细管电泳同时非放射性分析蛋白质或多肽中的各种O2磷酸化氨基酸的方法,可以在低pm ol范围同时分析所有3种PTH2磷酸化氨基酸,进而可分析蛋白质或多肽中磷酸化氨基酸残基,运用此方法他们对3个模型磷酸化肽及天然的磷酸化蛋白β2酪蛋白和卵黄高磷蛋白的磷酸化位点进行了分析.车发云和夏其昌[7]还对磷酸化底物肽的硫代磷酸化及荧光标记进行了报道,他们以七肽LRRAS LG(肯普肽K em ptide)为蛋白激酶A的底物模型,研究硫代磷酸化和荧光标记反应条件,以及标记产物的性质,为荧光标记分析蛋白质磷酸化和蛋白激酶的专一性研究提供了一种新的方法.杨琴等[8]利用免疫荧光标记技术对磷酸化组蛋白H3在乳腺癌细胞中的分布进行了研究.同位素编码亲和标签(IC AT)[9]作为蛋白水平定量的质量标签,已被进一步扩展用于蛋白质磷酸化研究.磷酸同位素标记亲和标签[10](PhI AT)是一种含两个不同质量的生物素亲和标签,实际上就是用不同的化学方法处理磷酸肽,从而标记出修饰位点.现已建立了两种从复杂混合物中专一分离磷酸化蛋白Π肽的方法.G oshe等[10]将肽或蛋白混合物置于碱性硫代二乙醇溶液中,通过β消除从磷酸化丝氨酸或苏氨酸中去掉H3PO4,形成的双键受到硫代二乙醇的作用,巯基取代磷酸根.生物素与巯基相连,标记过的蛋白肽用色谱分离.Zhou等[11]用另外一种方法修饰磷酸化肽,用碳二亚胺浓缩反应将半胱氨酸加在磷酸盐部分,修饰过的肽段以共价键与碘乙酰胺树脂结合,酸洗涤释放.此方法既可用于标记富集磷酸化酪氨酸也可用于标记富集磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸.3　磷酸化蛋白质及磷酸化肽的分离与富集 目前,在磷酸化蛋白质及磷酸化肽的分离与富集的研究中经常使用的方法有以下几种:311　固相金属亲和色谱固相金属离子亲和色谱最初用于磷蛋白的亲和纯化[12],磷酸基团与固相化的金属离子有高亲和力,可被选择性地吸附在上面,现在微升级的I M AC 柱被用来富集微量磷酸肽样品[13,14].在此方法中,键合在鳌合底物上的金属离子(通常是Fe3+或G a3+)选择性地与磷酸化肽中的磷酸部分相结合,并且在高pH或磷酸缓冲液中磷酸化肽可以释放出来.此方法的优点在于每一个可溶磷酸化肽,不管其长度如何都能被富集,而且I M AC柱洗脱下的样品可直接用于RP2HP LC分析.这种方法的局限性在于不能与I M AC相结合的磷酸化肽和难于洗脱的磷酸化肽可能会丢失.312　免疫沉淀高亲和性抗体可以从复杂混合物中免疫沉淀特定的蛋白.选择性分离磷酸化蛋白通用的方法是找到能免疫沉淀任何含有磷酸化残基蛋白的抗体.酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体是已知的较好的检测磷酸化蛋白质的抗体,它具有较强的亲和力,可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质[15].T illey和Schofieldt[16]利用磷酸化酪氨酸抗体对小麦的高分子量谷蛋白进行了Western2blotting分析,发现了酪氨酸磷酸化的高分子量谷蛋白亚基. Pandey等[17]用两种检测酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体混合物,免疫沉淀表皮生长因子(EG F)刺激后的HeLa细胞总蛋白质和未处理的HeLa细胞总蛋白质,通过MS分析共鉴定出7个已知的EG F激酶底物和一个新的EG F激酶底物.为了深入探索在细胞信息传递中蛋白质酪氨酸磷酸化研究的较佳方法,陈沙力等[18]采用免疫沉淀法及Western印迹法对电离辐射诱导的小鼠胸腺细胞蛋白质磷酸化进行了比较分析.结果表明在蛋白质酪氨酸磷酸化的研究中,免疫沉淀法优于Western印迹法.王天然等[19]还初步探讨了酶联免疫试验检测磷酸化酪氨酸蛋白的可行性.抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体特异性不高,但G ronborg等[20]用6种不同的检测丝氨酸和苏氨酸磷酸化蛋白质的抗体对细胞总蛋白质进行免疫沉淀.其中3种抗体可对丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化的蛋白质进行免疫沉淀.共鉴定出7个丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化的蛋白质,其中5个是已知的丝氨酸和苏氨酸磷酸化的蛋白质,1个是已知蛋白质,但以前并不知道其发生磷酸化。

免疫沉淀和免疫印迹免疫沉淀和免疫印迹（Western Blotting）在细胞生物学研究中，有时要对细胞膜分子、胞内分子或表达产物进行定性或／和定量。

但由于靶蛋白表达水乎不太高，用细胞裂解液或表达上清进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹（Western blot）检测很难达到实验目的。

为此可用特异性识别靶蛋白的抗体进行免疫沉淀，纯化和富集靶抗原。

免疫沉淀所获得的蛋白可进行SDS－PAGE电泳，经考马氏亮蓝染色或银染后观察目的蛋白条带。

如果免疫沉淀得到的目的蛋白量低于考马氏亮蓝染色或银染的检测下限，可采用Western blot检测方法，提高检测的灵敏度，达到实验目的。

免疫沉淀（一）原理免疫沉淀是利用抗原抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。

抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A ／G（Protein A／G）或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子－蛋白A／G或二抗－抗体－目的蛋白复合物，沉淀经洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5－10 min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

（二）试剂1．PBS：8g NaCl、0.2 g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800 ml双蒸水中，用HCl调PH至7.4，在补加水至1L，高压灭菌后保存于室温。

2．NaCl：5.8 g NaCl溶于 80 ml双蒸水中，再补加水至100 ml，高压灭菌。

3.1 1M Tris（pH 7.5）: 12.1g Tris碱，溶于80 ml双蒸水，用HCl调 pH至7.5，再补加水至100 ml。

4．蛋白酶抑制剂：Aprotinin和Leupeptin溶于双蒸水，PMSF 溶于异丙醇，浓度均为10 mg/ml。

5．N-40：10％（w／V）。

6．脱氧胆酸钠：10％（w／v），溶于10 mM HEPES（pH 8.0）。

免疫沉淀法和Western印迹实验如题，发一个关于免疫沉淀法和Western印迹实验的资料:免疫沉淀法和Western印迹实验1）抗原制备1．取5×107细胞，用TBS（50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 138mmol/L NaCl,2.7mmol/L KCl）洗涤，用1ml含1mmol/L PMSF的TNB（1％ Nonider P40, 1mg/ml BSA, TBS配制）悬浮沉淀细胞，置冰上30～60分钟，溶解细胞。

2．强烈混悬10秒钟（涡旋器），250×g离心10分钟，去除沉淀的细胞核。

微量离心机最大速度（每分钟14 000转）离心上清液30分钟或100 000×g离心30分钟，去除沉淀物。

上清液用于免疫沉淀。

2）免疫沉淀1．每200μl抗原制剂中加入10μl兔血清-Agarose和10μl山羊血清-Agarose，在0～5℃中，缓慢旋转混合1小时，200×g离心5秒钟，去除沉淀的Agarose 小珠。

2．将含抗原的上清液分成两等份，分别置1.5ml离心管中，各加TNB到1ml。

一管中加1～5μl兔抗细胞因子抗血清（或1～5μl小鼠单克隆抗体腹水或50～100μl含特异性抗体的杂交瘤细胞培养上清液），另一管加入同样量的对照液（无特异性抗体的同种属血清、腹水和细胞培养上清液），4℃结合1～2小时。

3．每管加50μl第二抗体-Agarose（例如山羊抗兔IgG的抗体与Agarose的结合物）或者葡萄球菌蛋白A（或G）-Agarose，在0～5℃中，缓慢旋转混合1小时，200×g离心5秒钟，去上清液。

4．用TNB洗涤沉淀物2次、TBS洗涤沉淀物2次，每次用1ml液体，混合后200×g 离心5秒钟，去上清液。

加入1ml 50mmol/L pH6.8的Tris-HCl缓冲液悬浮沉淀物，将悬液转移到新的离心管中，200×g离心5秒钟，最后小心吸去全部液体。

western印迹实验报告
Western印迹实验报告
Western印迹是一种用于检测蛋白质的实验方法，通过这种方法可以确定蛋白
质在混合物中的存在和浓度。

在这篇报告中，我们将介绍一项关于Western印
迹实验的研究。

首先，我们收集了一些细胞样本，并提取了其中的蛋白质。

接着，我们使用聚
丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将这些蛋白质分离开来。

然后，我们将这些蛋白质转移到一块聚丙烯酰胺膜上，并用特定的抗体将目标蛋白质标记出来。

在Western印迹实验中，我们使用了一种叫做免疫印迹的技术，通过这种技术
可以检测特定的蛋白质。

我们将膜与特定的抗体结合，然后使用一种叫做辣根
过氧化物酶的酶来标记这些抗体。

最后，我们使用化学发光或荧光等方法来检
测这些标记物，从而确定目标蛋白质的存在和浓度。

通过这项实验，我们成功地检测到了我们感兴趣的蛋白质，并确定了它们在样
本中的浓度。

这项研究为我们提供了关于细胞样本中蛋白质的重要信息，有助
于我们更好地理解细胞的功能和生物学过程。

总之，Western印迹实验是一种非常有用的方法，可以帮助科研人员确定蛋白
质的存在和浓度。

通过这项实验，我们可以更深入地了解细胞样本中的蛋白质，为生物学研究提供重要的数据支持。

Western印迹实验的结果对于理解细胞的
功能和疾病机制具有重要意义。

蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。

5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。

蛋白质印迹分析(Western Blot Analysis)【实验目的】了解蛋白质印迹法的基本原理及其操作和应用。

【实验原理】蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。

待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化,另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别。

如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋白首先要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离；通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗体（一抗）与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白。

值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白，如牛血清白蛋白对膜进行“封阻”而防止抗体与膜的非特异性结合。

经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。

常用的两种电转移方法分别为: 1.半干法: 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10分钟~30分钟。

2.湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45分钟延长到过夜进行。

由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这里只描述湿法的基本操作过程。

对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体。

该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。

这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应，该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上，容易鉴别。

因此可通过对二抗的识别而识别一抗，进而判断出目标蛋白所在的位置。

其他的识别系统包括碱性磷酸酶系统和125I标记系统。

【实验操作】⒈.蛋白质的分离根据目的蛋白的性质，利用电泳方法将其进行分离。

为提高电转移的效率，通常采用SDS/PAGE技术。

分离实验结束后，首先将样品墙的上边缘用小刀去除，然后在胶板的右上角切一个小口以便定位，小心放入转移缓冲溶液中待用。

免疫组化是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和组织学技术（组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等），通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。

样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。

elisa（酶联免疫吸附试验）用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作上开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。

免疫组化和elisa所用到的原理大致相同，只是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上有所不同。

Elisa多用于定量分析，其灵敏度非常高。

western bolt 先要进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。

免疫学三大工具，免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。

以下western和Elisa 的区别不是原创，是找的资料。

western blotting 可以看到特异性的条带，但是定量比较烦elisa可以直接读出浓度，但是如果抗体有非特异性结合，那得到的数值就不可信。

WB只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白,这点ELISA做不到ELISA可用定量方法检测蛋白,也就是说可以观察不同浓度刺激物对目的蛋白的影响WB所检测的一般是抗原，而Elisa抗原抗体都可以检测。

WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体、降解产物等，一句话，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的；而Elisa无能为力，一锅端了。

WB所适用的一抗一般是线性位点的，ELISA线性或构象型抗体都可以使用。

从另一个意义上讲，WB可以做抗体是线性位点还是构象型位点的补充判定，而Elisa不行。

1 蛋白质含量测定法2 WESTERN PROTOCOL3 Western免疫印迹（Western Blot）4 蛋白质沉淀法5 蛋白质提取的方法总汇1 蛋白质含量测定法本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。

了解各种测定方法的基本原理和优缺点。

蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。

目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。

另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。

其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。

定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。

值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。

每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。

在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。

考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。

一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。

含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。

经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH| + 3H2SO4 ® 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)NH22NH3 + H2SO4 ® (NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4 + 2NaOH ® 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。

之杨若古兰创作检测两种蛋白质之间彼此感化的实验方法比较1. 生化方法●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专注性感化为基础的用于研讨蛋白质彼此感化的经典方法.改法的长处是蛋白处于天然形态，蛋白的彼此感化可以在天然形态下进行，可以防止认为影响；可以分离得到天然形态下彼此感化的蛋白复合体. 缺点：免疫共沉淀同样不克不及包管沉淀的蛋白复合物时候为直接彼此感化的两种蛋白.另外灵敏度不如亲和色谱高.●Far-Western又叫做亲和印记.将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标识表记标帜了同位素的钓饵蛋鹤发生感化，最初显影. 缺点是转膜前须要将蛋白复性. 2. 等离子概况共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将钓饵蛋白结合于葡聚糖概况，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜概况.当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“钓饵”蛋鹤发生彼此感化，那么两者的结合将使金属膜概况的折射率上升，从而导致共振角度的改变.而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的彼此感化.该技术不须要标识表记标帜物和染料，平安灵敏快速，还可定量分析.缺点：须要专门的等离子概况共振检测仪器.3. 双杂交技术道理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常须要两个或以上彼此独立的结构域构成.分别使结合域和激活域同钓饵蛋白和猎物蛋白构成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生彼此感化，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活陈述基因. 缺点：本身有转录功能的蛋白会形成假阳性.融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能.晦气于核外蛋白研讨，会导致假隐性.5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（<100埃）时，它们之间可发生能量转移的景象.荧光共振能量转移技术可以研讨分子内部对某些刺激发生的构象变更，也能研讨分子间的彼此感化.它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变更，能够定性定量的检测彼此感化的强度. 缺点此项技术请求发色基团的距离小于100埃.另外设备昂贵，还须要融合GFP给蛋白标识表记标帜.此外还有交联技术（cross－linKing），蛋白质探针技术，噬菌体展现技术（Phage display）和生物信息学的方法来检测蛋白质之间彼此感化.1，酵母双杂交1-5酵母双杂交零碎是将待研讨的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子（如GAL4等）的DNA结合结构域基因和转录激活因子（如GAL4等）激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产品分析两种蛋白质彼此感化的零碎酵母双杂交的道理是，把陈述基因HIS3 和l a c Z 整合到酵母细胞基因组中，并受转录因子GAL4 的调控表达.一旦GAL4 蛋白结合到HIS3 和l a c Z 调控序列响应的位点，则启动陈述基因的表达.通过检测陈述基因的表达判断阳性或阴性.实际利用中，把GAL4 基因分成两个部分：DNA 结合区（gal4 DNA binding domain, GBD）和激活区(gal4 activating domain, GAD）.分别把GBD 和GAD 构建到两个分歧的载体上，并能表达响应的两个融合蛋白（GBD-X 和GAD-Y）.然后把GBD-X 和GAD-Y 两种载体共转染到带有陈述基因的酵母细胞中.当GBD-X融合蛋白中X 蛋白与GAD-Y 融合蛋白中Y 蛋鹤发生彼此感化时（或结合在一路时），就使得原天职开的GBD 和GAD 蛋白靠近并具有完好的GAL4 蛋白的功能，从而能够激活陈述基因的表达.（1）筛选彼此感化的蛋白酵母双杂交技术能用于对cDNA 文库的筛选.把你要研讨的蛋白亚克隆到GBD 载体上，作为“钓饵”蛋白.把文库蛋白基因亚克隆到GAD 载体上.然后就可以在文库中寻觅那些能够与“钓饵”蛋白可以彼此感化的蛋白.或许你能够筛选到多株阳性克隆.虽然酵母双杂交技术具有广泛的利用价值，但正如任何其它技术一样，酵母双杂交技术也有必定的局限性.酵母双杂交技术最大的弱点就是假阳性出现率.所以筛选到的阳性克隆须要进一步的鉴定和功能数据撑持.（2）确定介入结合感化的结构域或motif当你确定了两个蛋白质分子之间有彼此感化后，利用酵母双杂交技术可以精细研讨蛋白质分子中那些结构起结合调节感化.你可以先把一个蛋白进行随机缺失，制备一系列缺失体，然后来检测这些缺失体与另一个蛋白质结合力的大小，直到发此刻蛋白质两两分子间起决定感化的氨基酸序列（称为结构域或motif）.如果一个蛋白分子中具有已知的结构域或motif，也一样进行缺失，看是否这些已知的结构域或motif 介入结合调节感化.有的情况下蛋白质彼此感化可能与蛋白质的磷酸化形态有关.这时候就须要对可能的磷酸化位点进行点突变，检测这些磷酸化位点是否介入调节蛋白质的结合感化. 2，GST沉淀实验（GST-pull down实验）（细胞外蛋白质彼此感化）5-11上面提到，用酵母双杂交方法筛选到的蛋白须要作进一步的鉴定.鉴定方法之一就是GST沉淀实验. GST 沉淀实验主如果用来证实蛋白质胞外的彼此感化.蛋白质在胞外的彼此感化排除了酵母细胞内复杂体系的干扰，，比较直接地检验蛋白质分子之间存在的物理的彼此感化.同酵母双杂交实验一样，应用此法也能够证实彼此感化的蛋白分子中是否有介入调节感化的结构域或motif. GST 沉淀实验道理就是，把你要研讨的蛋白基因亚克隆到带有GST（谷胱甘肽转移酶）基因的原核表达载体中，并在细菌中表达GST 融合蛋白（GST-X）.把GST 融合蛋白挂到带有GST 地物的Sepharose beads 上，然后把另一种蛋（Y）白加入其中.因为蛋白质之间的结合感化，构成了如许的复合物：GST-X----Y.这一复合物与固体撑持物（Sepharose beads）又结合在一路，可以被沉淀上去.此法又有在分歧情况下的具体利用，以下逐个作介绍. （1）GST 融合蛋白与重组蛋白的彼此感化GST 融合蛋白是在原核表达的，所以没有经过过多的象真核细胞内具有的蛋白润色感化.所以另一种用来检验彼此感化的蛋白也能够用原核表达出来，也就是所谓的重组蛋白.当GST 融合蛋白把重组蛋白沉淀上去，然后用重组蛋白的抗体作Western blotting 检测.（2）GST 融合蛋白与体外TNT 零碎合成的多肽或蛋白的彼此感化用来检验与GST融合蛋白彼此感化的蛋白或多肽也能够用TNT体外蛋白合成体系进行合成，而且还可以在要合成的蛋白或多肽N端或C端加上便于检测的标签. GST融合蛋白沉淀上去的蛋白或多肽可以用该蛋白或多肽的抗体或标签抗体进行Western blotting检测.如果蛋白之间结合力非常弱，用Western blotting检测方法难以检测到，你可以在TNT体外合成时给蛋白进行同位素（S32）标识表记标帜.如许沉淀上去的蛋白进行放射自显影，检测灵敏度将极大提高.（3）GST 融合蛋白与细胞内源性蛋白质的彼此感化GST融合蛋白还可以把细胞提取物中有彼此感化的内源性蛋白质沉淀上去.如果内源性蛋92白含量低或结合力弱，可以采取脉冲法使细胞在某一段时间内合成的所有蛋白都标识表记标帜上放射性同位素（S32），然后提取细胞总蛋白与GST 融合蛋白温育. GST融合蛋白沉淀下的带有放射性标识表记标帜的蛋白跑电泳，进行放射自显影.（4）GST 融合蛋白与细胞内瞬时表达的蛋白质的彼此感化当内源性蛋白质含量低，而且有可能影响蛋白质的彼此感化，也能够把该蛋白的基因转染到靶细胞内进行过表达，然后检验蛋白质彼此感化.（5）GST 融合蛋白与待测蛋白的彼此感化有可能与待测蛋白的磷酸化形态有关在进行GST 沉淀实验时，有时也会碰到比较复杂的情况，具体情况具体分析，分别对待.比方，两个蛋白质之间发生彼此感化时有可能与蛋白磷酸化形态有关.或者蛋白首先被磷酸化后方能发生彼此感化，或者磷酸化的蛋白必须脱磷酸化后才干发生彼此感化.如果你确实在你的实验中发现了其中一种情况，这将是一个非常成心义的结果.3，免疫共沉淀（co-immunoprecipitation ）（细胞内蛋白质彼此感化）9-16免疫共沉淀技术用来证实蛋白质在胞内是否有彼此感化.普通来说，两种蛋白在细胞内发生彼此感化时会构成两种蛋白的复合物，如许就可以先用一种蛋白的抗体把免疫复合物沉淀上去，然后用另一种蛋白的抗体进行Western blotting 检测，看两种蛋白之间是否确实构成免疫复合物，并能与protein A/G agarose 一路沉淀上去.免疫共沉淀道理简单，但技术极为复杂.因为细胞内蛋白品种繁多，制约身分多.如果两种蛋白之间可以发生彼此感化，其实不是这两种蛋白所有分子都介入结合感化，也可能只要极少部分蛋白分子结合在一路（足以满足细胞功能须要）.在提取细胞蛋白时，如果条件不当就会破坏两种彼此感化蛋白构成的复合物的波动性使得免疫共沉淀实验失败.如果两种蛋白在细胞内的结合力确实非常弱，那么免疫共沉淀也难以成功.如果晓得发生彼此感化的两个蛋白都是胞核蛋白，那么可以通过提取核蛋白，再进行免疫共沉淀实验，如许会大大减低布景的干扰.关于两种蛋白质之间胞内的彼此感化，有时确实没法用免疫共沉淀实验证实. （1）细胞内过表达蛋白的免疫共沉淀证实蛋白质胞内彼此感化时，可以选择一个高效瞬时过表达零碎（至于这一零碎是否有内源性靶蛋白有关紧要）.普通采纳COS 细胞作为真核表达株.把两种蛋白基因共转染到COS 细胞内进行表达.因为人为进行大量表达，所以在胞内两种蛋白构成彼此感化的复合物的量也响应增多.如果你手头没有这两种蛋白的抗体，可以把这两种蛋白的一端分别加上标签以融合蛋白方式表达，然后用商业化的抗标签抗体进行免疫共沉淀和Western blotting 检测.（2）细胞内源性蛋白的免疫共沉淀把两种蛋白共转染到COS 细胞内进行过表达，进行免疫共沉淀实验，绝对容易成功，但是这一结果究竟具有人工性，不克不及代表生理条件下真实的蛋白质彼此感化.要想克服这一弱点，可以做内源性的免疫共沉淀实验.这一技术请求极高，难度极大，但也最有说服力.因为细胞内内源性蛋白含量低，结合在一路构成复合物的量更低，难以检测.首先要证实所选择的细胞93系是否具有这两种内源性的蛋白.另外，用于免疫沉淀和Western blotting 检测的体要好.细胞裂解、收集和免疫沉淀时时条件要暖和，以坚持蛋白复合物的天然结构.（3）组织内蛋白的免疫共沉淀在体外可以大量培养细胞，然后制备细胞提取物，做内源性免疫共沉淀.由此可以推广到做组织内免疫共沉淀.取动物组织（脑、肝、脾等），切碎，匀浆，提取组织蛋白，进行免疫共沉淀实验.这一结果代表活体中蛋白质彼此感化.4，蛋白质细胞内定位实验17-22另一种经经常使用来检验蛋白质彼此感化的方法是蛋白质细胞内定位技术.此法较为直观，可以看到两种有彼此感化的蛋白质在细胞内的分布（膜上、胞浆、胞核或其它细胞器等等）和共定位的部位（在膜上共定位、在胞浆中某一部位或核内共定位等等）.有时彼此感化的蛋白因为细胞内某种功能的须要结合在一路时，使得两种蛋白的分布发生变更.比方，某种蛋白或许在核内，当它与另一种具有穿梭功能的蛋白结合时，有可能被转运到胞浆中.这类情况的共定位则较为典型.在进行蛋白质共定位（1）利用有色荧光蛋白标识表记标帜技术进行蛋白定位研讨此法也可称为活细胞定位.把两种具有彼此感化的蛋白分别克隆到带有两种分歧色彩荧光荧光显微镜直接观测. 在进行精确细胞定位或共定位时，必须用共聚焦荧光显微镜观测.因为共聚焦荧光显微镜（相当于病院给病人诊断的CT）观测的是细胞内一个切面上的色彩. 如果在一个切面上在同一区域看到两种色彩，就提示这两种蛋白在该区域内有彼此感化.普通荧光显微镜看到的是一个立体图象，没法确定蛋白质共定位景象.在进行定位或共定位同时，也能够对细胞核进行染色.如许，在细胞中就有三种色彩.细胞核的显色帮忙你确定共定位发生的位置.上面介绍的活细胞定位，其长处是表达的荧光蛋白荧光强，没有布景，观测方便.但缺点是彼此感化的蛋白因为标上荧光蛋白，实际上是两个融合蛋白.融合蛋白的定位结果或共定位结果是否与天然蛋白分布分歧，有待于进一步确定.而利用免疫荧光标识表记标帜技术可以防止这一缺点.（2）利用双色或多色染色的免疫荧光技术进行蛋白定位研讨免疫荧光的道理是，首先把细胞进行固定，然后用待检测靶蛋白的抗体（一抗）与细胞内靶蛋白进行免疫反应，再用荧光素（如FITC 和TRITC 等）标识表记标帜的二抗与一抗进行反应.如许就在细胞内构成免疫复合物（靶蛋白----一抗---二抗），结果靶蛋白被标上色彩，然后可用共聚焦荧光显微镜观测定位与共定位结果.免疫荧光技术最大长处就是可用来检测细胞内源性蛋白的定位及彼此感化.当然也能够对靶细胞进行转染表达目的蛋白，然后标识表记标帜目的蛋白进行观测.免疫荧光技术的缺点是荧光绝对94较弱而且布景较高，结果受到干扰，所以这项技术欠好把握.为了结果的可靠性，请求严酷设。