基因的原核表达

原核表达系统的工作原理原核表达系统是指利用原核生物（如大肠杆菌等）来表达外源蛋白质的工具，在生物技术和基因工程领域应用十分广泛。

原核表达系统通过重组DNA技术将目标基因插入原核细胞的表达载体中，并利用细胞自身的代谢机制，将目标蛋白质大量表达出来。

本文将详细介绍原核表达系统的工作原理。

1. 原核表达系统的基本构成原核表达系统的基本构成包括表达载体和宿主细胞两部分。

表达载体是一种重组DNA分子，通常包括以下基本组成成分：（1）起始位点（起始密码子）：在大肠杆菌中通常为AUG。

（2）表达基因：包括编码目标蛋白质的DNA序列和转录启动子、转录终止子等序列。

（3）选择标记：旨在筛选出带有目标基因的细胞，并提高表达效率。

常用的选择标记有抗生素抵抗基因和荧光标记基因等。

（4）复制起点：能够使表达载体在宿主细胞内进行自我复制，提高表达效率。

宿主细胞则是一种能够实现表达载体遗传信号转录、翻译和合成目标蛋白质的生命体。

2. 原核表达系统的工作流程原核表达系统通过以下几个步骤来实现目标蛋白质的表达：（1）制备表达载体将目标基因插入表达载体中，构建成重组DNA分子。

（2）转化宿主细胞将制备好的表达载体转化（transform）到宿主细胞内。

转化过程中，表达载体通过电击、热激或溶菌酶处理等方法，被宿主细胞吞噬并与其细胞质融合。

（3）表达基因转录和翻译转录因子识别插入表达载体的启动子序列，调节基因在宿主细胞内能够合成被表达的mRNA。

转录后的mRNA与核糖体结合，开始翻译，合成蛋白质。

（4）目标蛋白质的后处理和纯化将宿主细胞内表达的蛋白质从培养基或细胞酶中提取出来。

通常采用离心、过滤或柱层析等方法，对蛋白质进行分离和纯化。

3. 原核表达系统的优缺点原核表达系统在生物技术和基因工程领域应用广泛，主要因为其有以下的优缺点。

（1）优点①高效：能够表达大量的目标蛋白质，通常能够达到10%以上的蛋白质总产量。

②简便：操作简便，不需要昂贵的设备，很容易进行规模化操作。

原核表达步骤总结原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋⽩，然后进⾏蛋⽩纯化。

本实验⽅案的前提是，⽬的基因已克隆到载体，并已转进⼊JM109菌株中。

1．鉴定⽬的蛋⽩是否在⼤肠杆菌JM109或BL21中⼤量表达（1）制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加⼊0.7ul Amp（100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。

2. 以1：50⽐例（200ul），将活化的过夜培养物加⼊10mL LB液体培养基中，加⼊10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min 摇床扩⼤培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使⼤肠杆菌处于最适合表达外源蛋⽩的⽣长状态。

(⼀般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第⼀次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩⼤培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空⽩对照（CK），其余7ml菌液加⼊7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。

以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。

4. 以5000r/min离⼼2min收集菌体，倾倒上清，每个离⼼管收集3ml培养物。

5. 加⼊1ml dH2O，将管底沉淀⽤振荡器打散以充分洗涤，8000r/min 离⼼2min，倾倒上清。

6. 重复步骤5。

将离⼼管中的⽔倒⼲净。

（⼆）菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加⼊200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，⼀般200ul⽐较合适)。

⽤漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。

2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。

样品凉后，12000r/min离⼼3min，取每管的上清点样。

真核基因和原核基因表达调控的异同？真核基因表达调控的基本原理与原核基因相同，主要表现在：1、与原核基因的调控一样，真核基因表达调控也以转录水平调控为最重要；2、在结构基因均有调控序列，并依靠特异蛋白因子与这些调控序列的结合与否调控基因的表达。

3、都要经历转录、翻译的过程。

4、表达过程都有复杂性，多环节不同1、真核基因表达调控过程更复杂。

2、在染色质结构上。

原核细胞的DNA是裸露的，而真核细胞DNA包装在染色体中。

DNA与组蛋白组成核小体形成为染色体基本单位。

在原核细胞中染色质结构对基因的表达没有明显的调控作用，而在真核细胞中染色质的变化调控基因表达，并且基因分布在不同的染色体上，存在染色体间基因的调控问题；3、真核生物中编码蛋白质的基因通常是断裂基因，含有有非编码序列即内含子，因而转录产生的mRNA前体必须剪切加工才能成为有功能的成熟的mRNA，而不同拼接方式的可产生不同的mRNA。

而原核生物的基因由于不含有外显子和内含子，因此，转录产生的信使RNA不需要剪切、拼接等加工过程。

4、在原核基因转录的调控中，既有正调控，也有负调控，二者同等重要，而真核细胞中虽然也有正调控成分和负调控成分，但目前已知的主要是正调控，且一个真核基因通常都有多个调控序列，必须有多个激活物同时特异地结合上去才能调节基因的转录；5、原核基因的转录和翻译通常是相互偶联的，而真核基因的转录与翻译在时空上是分开的，从而使真核基因的表达有多种调控机制。

6、真核生物细胞中存在mRNA的稳定性调控7、真核生物大都为多细胞生物，基因的表达随细胞内外环境条件的改变和时间程序在不同的表达水平上进行着精确调控，而原核生物主要受环境因素和营养状况影响基因调控。

8、真核生物由三种RNA聚合酶分别负责三种RNA的转录，而原核生物只有一种。

原核生物基因表达调控概述基因表达调控是生物体内基因表达调节控制机制，使细胞中基因表达的过程在时间，空间上处于有序状态，并对环境条件的变化做出适当的反应复杂过程。

1.基因表达调控意义在生命活动中并不是所有的基因都同时表达，代谢过程中所需各种酶和蛋白质基因以及构成细胞化学成分的各种编码基因，正常情况下是经常表达的，而与生物发育过程有关的基因则需在特定的时空才表达，还有许多基因被暂时的或永久的关闭而不来表达。

2.原核基因表达调控特点原核生物基因表达调控存在于转录和翻译的起始、延伸和终止的每一步骤中。

这种调控多以操纵子为单位进行，将功能相关的基因组织在一起，同时开启或关闭基因表达即经济又有效，保证其生命活动的需要。

调控主要发生在转录水平，有正、负调控两种机制在转录水平上对基因表达的调控决定于DNA的结构，RNA 聚合酶的功能、蛋白质因子及其他小分子配基的相互作用。

细菌的转录和翻译过程几乎在同一时间内相互偶联。

细胞要控制各种蛋白质在不同时期的表达水平，有两条途径：（1）细胞控制从其DNA模板上转录其特异的mRNA的速度，这是一条经济的途径，可减少从mRNA合成蛋白质的小分子物质消耗，这是生物长期进化过程中自然选择的结果，这种控制称为转录水平调控。

（2）在mRNA合成后，控制从mRNA翻译肽链速度，包括一些与翻译有关的酶及其复合体分子缔合的装配速度等过程。

这种蛋白质合成及其基因表达的控制称为翻译水平的调控。

二.原核生物表达调控的概念（1）细菌细胞对营养的适应细菌必须能够广泛适应变化的环境条件。

这些条件包括营养、水分、溶液浓度、温度，pH等。

而这些条件须通过细胞内的各种生化反应途径，为细胞生长的繁荣提供能量和构建细胞组分所需的小分子化合物。

（2）顺式作用元件和反式作用元件基因活性的调节主要通过反式作用因子与顺式作用元件的相互作用而实现。

反式作用因子的编码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列在同一个DNA分子上。

RNA聚合酶是典型的反式作用因子。

-原核表达系统一．表达系统：基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。

据受体细胞的不同可分为：1．原核表达载体系统：将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达合成基因产物的体系。

2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达。

二．原核生物基因结构和表达特点1．原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。

2．原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。

（图）多顺反子mRNA（polycistronic mRNA）：即可作为两个或多个肽链翻译模板的mRNA。

3．一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统。

4．原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。

操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。

1）原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。

共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。

2）包括调控区：调节基因，启动基因，操作基因。

结构基因：5．原核生物中参与转录的基因结构：1）启动子：是DNA上的一段序列，是RNA聚合酶识别并结合部位。

各种不同的原核细胞其启动子各有不同，但均含有下列两个高度保守区（富含AT：易变性解离为单链，为RNA合成提供模板）（1）TATA box（-10区，pribnow box）：转录启始点上游10bp处一段富含AT的碱基TATATTA（2）-35区：长度和顺序个体间差别很大，富含AT是RNA聚合酶识别位点。

转录的启始：RNA聚合酶首先识别启动子的-35区并结合至启动子上，然后开始滑向转录起始点，到-10区时，RNA聚合酶与启动子结合更牢固，并继续向前滑行，大约6-7bp后开始转录（转录起始位点）。

即RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不转录（图）。

各种启动子启动转录能力不同。

启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列。