表达GLP-1融合蛋白的重组大肠杆菌分批补料培养工艺优化

[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公开说明书[11]公开号CN 1737117A [43]公开日2006年2月22日[21]申请号200510028037.6[22]申请日2005.07.22[21]申请号200510028037.6[71]申请人华东理工大学地址200237上海市梅陇路130号共同申请人上海恰尔生物技术有限公司[72]发明人魏东芝 沈亚领 孙爱友 汤亚南 [74]专利代理机构中原信达知识产权代理有限责任公司代理人罗大忱[51]Int.CI.C12N 1/20 (2006.01)C12N 1/21 (2006.01)C12R 1/19 (2006.01)权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页[54]发明名称一种分批补料培养大肠杆菌的方法[57]摘要本发明公开了一种分批补料培养大肠杆菌的方法，这种补料方法的内容包括：发酵过程分为五个阶段，不同阶段分别流加碳氮比不同的培养基，实现碳源和氮源的实时流加平衡。

应用本发明的补料方法培养带有TRAIL基因表达载体的重组大肠杆菌C600，可以使菌体密度达到高值，有效提高可溶性TRAIL蛋白的表达量，同时减少发酵过程中乙酸的积累。

200510028037.6权 利 要 求 书第1/1页 1、一种分批补料培养大肠杆菌的方法，其特征在于，将发酵过程分为五个阶段，每个阶段培养时间为4-7小时，各阶段培养基的碳氮比，即：葡萄糖/(蛋白胨+酵母粉)的质量比依次为0.75-0.9、1-1.2、2.4-2.6、4.5-5.4、0.9-1.2； 其中起始接种量按体积比为2-7％，从第二阶段开始补料，补料流加速度使得菌体生长的比生长率在0.05-0.18h-1之间；整个发酵过程溶氧维持在20-30％之间，pH值为6.8-7.5。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵过程五个阶段培养基的碳氮比为：0.88、1.13、2.51、5、1。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010069255.9(22)申请日 2020.01.21(71)申请人 邵国地址 014040 内蒙古自治区包头市东河区建设路31号包头医学院(72)发明人 邵国　巴德仁贵　鲍牧兰　姜树原　贾小娥　谢伟　谢雅彬　刘晓蕾　许文强　石蕊　(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)C12N 1/38(2006.01)C12P 21/00(2006.01)C12R 1/19(2006.01)(54)发明名称一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基及其制备方法(57)摘要本发明属于基因工程、分子生物学等生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基及其制备方法，本培养基可提高大肠杆菌在细胞质内表达可溶性重组蛋白的成功率和产量。

所述高效培养基选取M9培养基，添加山梨醇、乙醇、葡萄糖、蔗糖等基本成分，并辅以硫酸镁和氨苄青霉素，以IPTG为诱导剂，旨在调高外源蛋白的可溶性表达。

所述高效培养基用于表达重组蛋白，特别是大肠杆菌表达可溶性重组蛋白。

本培养基可以用大肠杆菌BL -21或DH5α菌株作为反应菌，也可以用K12或origami B等大肠杆菌菌株作为反应菌。

权利要求书3页 说明书10页 附图1页CN 111117933 A 2020.05.08C N 111117933A1.一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基，其特征在于：所述高效培养基选取M9培养基，添加山梨醇、乙醇、葡萄糖、蔗糖等基本成分，并辅以硫酸镁和氨苄青霉素，以IPTG为诱导剂，旨在调高外源蛋白的可溶性表达；所述M9培养基的配比如下：配置1L该M9培养基，取750ml无菌去离子水，该去离子水冷至50度或50度以下，加入：5*M9盐溶液 200ml1mol/L硫酸镁 2ml适当碳源的20% 溶液 20ml1mol/L氯化钙 0.1ml灭菌的去离子水定容到 1000ml。

专利名称：一种提高大肠杆菌中可溶性重组蛋白质表达水平的方法
专利类型：发明专利
发明人：闻崇炜,赵烨清,周慧莲,欧阳臻,王晓燕
申请号：CN201510516845.0
申请日：20150821
公开号：CN105087725A
公开日：
20151125
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种有效提高大肠杆菌中可溶性重组蛋白质表达水平的工艺方法，其步骤如下：将表达重组蛋白质的工程菌冻存液按0.1%比例接种到表达用新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜获得种子液，随后将种子液按照1%比例接种到表达用新鲜LB液体培养基中，37℃继续振荡培养至培养液OD达到预设诱导起点的75%～90%，然后将培养温度升高至40℃继续培养0.5～1.5hr，待培养液OD达预设诱导起点后，向培养液中添加诱导物，继续以37℃或者40℃振荡培养6hr，菌体内可以产生显著的可溶性重组蛋白质。

本发明简便有效，成本低廉，易于放大，适用于生物工程及基因工程中用大肠杆菌表达各种可溶性异源重组蛋白质。

申请人：江苏大学
地址：212013 江苏省镇江市京口区学府路301号
国籍：CN
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202111661134.4(22)申请日 2021.12.30(71)申请人 华润昂德生物药业有限公司地址 252201 山东省聊城市东阿县阿胶街78号申请人 华润生物医药有限公司　上海昂德生物科技有限公司(72)发明人 许波　聂洪霞　徐天扬　黄菁　刘海峰　(74)专利代理机构 北京思元知识产权代理事务所(普通合伙) 11598代理人 余光军(51)Int.Cl.C07K 19/00(2006.01)C07K 1/22(2006.01)C07K 1/34(2006.01)C07K 1/36(2006.01)(54)发明名称重组人GLP-1-Fc融合蛋白的纯化方法(57)摘要本发明公开了一种重组人GLP ‑1‑Fc融合蛋白的纯化方法，包括：(1)将重组人GLP ‑1‑Fc融合蛋白的细胞发酵液进行预处理得到重组人GLP ‑1‑Fc融合蛋白粗样；(2)制备亲和层析柱；(3)将重组人GLP ‑1‑Fc融合蛋白粗样上样亲和层析柱，经过淋洗处理后采用洗脱液进行洗脱，收集含有样品峰的洗脱液，得到重组人GLP ‑1‑Fc融合蛋白纯品。

本发明通过优选亲和填料，优化淋洗缓冲液的pH值以及洗脱缓冲液的pH值，筛选洗脱液的最佳收集范围以及最佳上样动态载量，最终所建立的纯化方法能够最大限度除去HCP，洗脱体积小，所制备的重组人GLP ‑1‑Fc融合蛋白纯度和收率高。

权利要求书1页 说明书7页 附图2页CN 114316072 A 2022.04.12C N 114316072A1.一种重组人GLP ‑1‑Fc融合蛋白的纯化方法，其特征在于，包括：(1)将重组人GLP ‑1‑Fc融合蛋白的细胞发酵液进行预处理得到重组人GLP ‑1‑Fc融合蛋白粗样；(2)制备亲和层析柱；(3)将重组人GLP ‑1‑Fc融合蛋白粗样上样亲和层析柱，经过淋洗处理后采用洗脱液进行洗脱，收集含有样品峰的洗脱液得到重组人GLP ‑1‑Fc融合蛋白纯品。

1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验（最新整理）第一天1、配置LB培养基：酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。

调节PH至7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。

分装成15瓶（每瓶200ml）。

2、接种（超净台要提前杀菌通风）取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。

37℃过夜。

第二天1、扩大培养（超净台）4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。

2、诱导（超净台）加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。

25℃摇床培养4小时。

3、离心获取菌体4℃，8000rpm离心25分钟。

注意配平。

4、超声波破碎菌体离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。

将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。

离心收集上清液。

600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。

超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。

探头浸没于菌液中，不可伸入过长。

注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。

5、抽滤（双层滤纸)洗胶（GST）。

将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。

第三天1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。

2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。

3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。

用洗脱液调零，测OD280。

（OD值达到1.5为佳）4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911373533.3(22)申请日 2019.12.27(71)申请人 万新医药科技（苏州）有限公司地址 215123 江苏省苏州市苏州工业园区星湖街218号生物纳米园A4-213单元申请人 江苏万邦医药科技有限公司(72)发明人 辛中帅　赵珊珊　文良柱　平康康　徐晓峰　李夷平　(51)Int.Cl.C07K 19/00(2006.01)C07K 14/605(2006.01)C12N 15/62(2006.01)C12N 15/70(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称一种采用大肠杆菌表达串联序列制备GLP-1或其类似物多肽的方法(57)摘要本发明公开一种采用大肠杆菌表达串联序列制备GLP -1或其类似物多肽的方法，本发明设计的GLP -1或其类似物的重组串联蛋白通式为：X -(Y -Z)n。

其中：X为前导肽，Y为胰蛋白酶和CPB酶双酶切位点或Kex2酶和CPB酶双酶切位点及辅助序列，Z为GLP -1或其类似物。

n为串联重复数。

通过大肠杆菌原核表达体系进行发酵诱导表达GLP -1或其类似物的重组串联蛋白形成的包涵体无需变性剂即可完全溶解，溶解液经胰蛋白酶和CPB酶双酶切或Kex2酶和CPB酶双酶切获得GLP -1或其类似物。

本方法获得的GLP -1或其类似物表达量高，酶切后GLP -1目的蛋白收率及酶切后纯度高。

权利要求书1页 说明书17页序列表60页 附图6页CN 111072783 A 2020.04.28C N 111072783A1.一种GLP -1或其类似物重组串联蛋白序列，其特征在于，氨基酸序列通式为：X -(Y -Z)n；其中：X为5-10个氨基酸形成的前导肽，氨基酸组成包括但不限于：A丙氨酸、L亮氨酸、N天冬酰胺、R精氨酸、S丝氨酸、F苯丙氨酸、H组氨酸、M甲硫氨酸、V缬氨酸；优选的序列组成为MMRLN或MMRLNSA或MMRLNSAFV；Y为胰蛋白酶和CPB酶双酶切位点或Kex2酶和CPB酶双酶切位点及辅助序列，通式为Y＝y -m -y；其中，y为R或K或RR或KK或RK或KR；m为4-12个氨基酸形成的专属连接序列；优选的序列组成GSGSEEGSGS或GSGSDDGSGS或GSGSEDGSGS或GSGSDEGSGS或EEAE或DDAD或TEEAEKL或TDDADKL或TEDAEKL或TDEADKL或EGTEEAEKLG或EGTDDADKLG或EGTEEADKLG或EGTDDAEKLG或EGTEDADKLG或EGTDEAEKLG；Z为GLP -1或其类似物，氨基酸序列选自SEQ ID No.20～SEQ ID No.27中的任意一种：SEQ ID No.20：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG、SEQ ID No.21：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG、SEQ ID No.22：EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG、SEQ ID No.23：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS、SEQ ID No.24：HAEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS、SEQ ID No.25：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK、SEQ ID No.26：HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR、SEQ ID No.27：HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGG；n为2-7的整数，优选为3、4或5。

专利名称：一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法专利类型：发明专利
发明人：孙杨,聂简琪,白仲虎
申请号：CN202010969328.X
申请日：20200915
公开号：CN112080456A
公开日：
20201215
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法，其能通过对发酵方法的各工艺步骤、参数条件以及培养基配制进行综合优化，以提高外源蛋白的表达水平。

一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、在生长温度条件下培养大肠杆菌，生长温度为30‑37℃；步骤2、待细胞密度在OD条件下达到40±5℃时，转为诱导温度下培养大肠杆菌，诱导温度为20‑35℃，诱导温度低于生长温度；步骤3、在诱导温度下培养0.5‑2 h后加入诱导剂进行诱导。

采用本发明方法的表达调控，可有效地延长大肠杆菌培养周期，提高大肠杆菌的细胞密度，同时实现较高的蛋白表达量。

申请人：江南大学
地址：214000 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号
国籍：CN
代理机构：无锡盛阳专利商标事务所(普通合伙)
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[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公开说明书[11]公开号CN 1765931A [43]公开日2006年5月3日[21]申请号200510017175.4[22]申请日2005.09.30[21]申请号200510017175.4[71]申请人李玉新地址130024吉林省长春市人民大街5268号东北师范大学遗传与细胞研究所共同申请人魏洋 单保红[72]发明人魏洋 李玉新 刘霞 鲍永利 单保红 乌垠 [74]专利代理机构吉林长春新纪元专利代理有限责任公司代理人陈宏伟[51]Int.CI.C07K 19/00 (2006.01)A61K 38/26 (2006.01)A61K 38/17 (2006.01)A61K 39/395 (2006.01)A61P 3/04 (2006.01)A61P 3/10 (2006.01)A61P 3/00 (2006.01)A61P 19/02 (2006.01)A61P 19/10 (2006.01)A61P 25/00 (2006.01)A61P 13/12 (2006.01)A61P 9/04 (2006.01)A61P 9/12 (2006.01)A61P 1/16 (2006.01)A61P 11/00 (2006.01)A61P 43/00 (2006.01)权利要求书 12 页 说明书 151 页 附图 5 页[54]发明名称GLP－1融合蛋白及其制备方法和医药用途[57]摘要本发明提供一种GLP－1融合蛋白及其制备方法，这些融合蛋白可用于胰岛素非依赖型糖尿病及肥胖等的治疗。

200510017175.4权 利 要 求 书第1/12页 1.一种胰高血糖素类似肽-1(GLP-1)的融合蛋白，其特征是由多肽A-多肽B 组成；其中，多肽A为GLP-1(7-37)[序列ID：NO：1]，其序列为：His-Xaa2-Xaa3-Gly-Xaa5-Xaa6-Thr-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13 -Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Xaa2 5-Xaa26-Leu-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31式中Xaa2为：Ala，Gly，Ser，Thr；Xaa3为：Glu，Asp，Gln，Asn；Xaa5为：Thr，Arg，Ile；Xaa6为：Phe，Tyr，Leu；Xaa8为：Ser，Asn；Xaa9为：Asp，Asn；Xaa10为：Val，Ile，Met，Ala；Xaa11为：Ser，Thr，Ala，Asp；Xaa12为：Ser，Gln，Glu，Asn，Thr；Xaa13为：Tyr，Phe，Gln，His，Leu；Xaa14为：Leu，Thr，Ser；Xaa15为：Glu，Gln，Asn，Asp，Arg，Lys；Xaa16为：Gly，Glu，Asp，Gln，Asn，Arg，Lys；Xaa17为：Gln，Lys，Leu，Phe；Xaa18为：Ala，Lys；Xaa19为：Ala，Thr，Ile，Ser；Xaa20为：Lys，Arg，Gln；Xaa21为：Glu，Asp，Asn，Ala，Ser，Lys，Arg；Xaa23为：Ile，Val；Xaa24为：Ala，Ser，Asp，Glu，Gly，Thr；Xaa25为：Trp，Arg，Lys，Ser；Xaa27为：Val，Lys，Ile，Ser，Ala；Xaa28为：Lys，Arg，Asn，Gln，Ser，Ala，Thr；Xaa29为：Gly，Tyr，Ser；Xaa30为：Arg，Lys，Gln，Asp，Asn，Gly，Ala，Pro；Xaa31为：Gly，Pro，Val，Arg，Lys，Ala或被去除；多肽B为人胰高血糖素受体或胰高血糖素家族中任何多肽的受体。