常用菌种的分离、选育和保藏

第三章菌种的分离筛选● 1.菌种来源● 2.分离方法● 3.菌种保藏● 4. 菌种复壮典型的微生物新种分离筛选过程第一节菌种来源1.向菌种保藏机构索取有关菌株，从中筛选所需菌株。

国内主要菌种保藏机构：●AS—中国科学院微生物研究所●CMCC—中国医学细菌保藏管理中心●CVCC—兽医微生物菌种保藏管理中心●IA—中国医学科学院抗菌素研究所●IANP—华北制药厂抗菌素研究所●ID—中国医学科学院皮肤病防治研究所、●CAMS—中国医学科学院流行病学微生物研究所●IFFI—轻工业部食品发酵工业科学研究所等。

国外主要的菌种保藏机构●ATCC—美国标准菌种收藏所●NIH—美国国立卫生研究院●NRRL—美国农业部北方开发利用研究所●CMI—英联邦真菌研究所，CSH—美国冷泉港实验室●IAM—日本东京大学应用微生物研究所，IFO—日本大阪发酵研究所，KCC—日本科研化学有限公司，●NCTC—英国国立标准菌种收藏所●WB—美国威斯康星大学细菌学系等。

2.由自然界（土样、水、动植物体等）采集样品，从中进行分离筛选。

不可培养微生物是指目前尚不能实现人工培养的微生物。

原因可能为尚不了解该类微生物的营养需求和生长需要的理化环境。

目前人类认识和培养的微生物还不到其存在种类的1%。

3.从发酵制品中分离目的菌株。

如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶产生菌等。

采样过程（一）从土壤中采样要考虑土壤的有机质含量和通气状况、酸碱度和植被状况、地理条件和季节条件。

用采样铲采集5-25cm（北方干燥的土壤，采集10-30cm）土样10-25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好，并编号，记录采集地点、土壤质地、植被名称、采集时间等。

土样采集后要尽快分离，否则可取3-4g撒到事先准备好的选择性培养基试管斜面，避免菌株因不能及时分离而死亡。

根据微生物生理特点采样1.根据微生物营养类型采样（1）微生物的营养要求和代谢类型与其生长环境有很大的相关性森林土壤富含纤维素，可分离纤维素酶产生菌；肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中，能分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌；面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等，容易分离到产生淀粉酶和糖化酶的菌株；从果园土和腐烂的柑橘、草莓及山芋中，容易分离到果胶酶产生菌。

光合细菌菌种分离与保藏随着健康养殖渔业的发展，光合细菌越来越受到养殖者的青睐。

光合细菌广泛分布于生物圈的各个角落，在净化水质、防治疾病和促生长方面效果明显，可作为鱼、虾、贝的饵料、饵料添加剂及浮游动物饵料。

光合细菌的培养首先要有菌种，菌种是从它生活环境中的微生物群中分离出来的。

笔者现以水产养殖和水质净化中常用的红螺菌种为例，简单介绍其分离和保藏技术，以供生产者参考。

菌种的分离采样红螺菌种的种类在自然界中有有机污染的地方广泛存在。

样品可以从河底、湖底、海底以及水田、池塘、沟渠等有污水进入的地方，以及食品工业污水排放处的橙黄色、粉红色泥土中获得。

可以用杯子采集少量泥土，连水放入广口瓶或用采水器、采泥器取样。

为了获得密度较高的样品，也可以采取淡水池塘、池沼及海边的污泥，置入广口瓶中盖紧，分别加入几片海带或其它一些海藻，装满淡水或海水，置入日光下培养。

大约一个月以后，瓶底就可以见到光合细菌的沉淀物。

经过这样的简单培养后，可以直接对此菌作分离后进行纯培养。

富集富集培养时，将采集的样品装入玻璃圆筒或大型试管或具塞磨口玻璃瓶，再倒入配制好的培养液，充分搅拌。

为造成厌气环境，在玻璃瓶或试管中加入液体石蜡以隔绝空气；磨口瓶只需将培养液加满加塞，以排除其中空气，瓶外再用塑料薄膜裹住扎牢，以减少水分蒸发。

培养温度为5℃～35℃。

光照可以利用阳光，夜晚时则利用人工光源，光照强度的适宜范围为5000Lux～10000Lux。

在这样的培养条件下，大约经过2周～8周的培养，在玻璃瓶壁上会出现光合细菌的菌落，或者整个培养液长成红色。

如果是培养海水的光合细菌，因其生长缓慢，需要更长的富集培养时间。

富集操作可以重复进行，方法是将初步富集的光合细菌的菌液或泥土移入磨口玻璃瓶中继续培养，反复多次，光合细菌占绝对优势时可确认富集成功。

为了避免在培养液中藻类和绿杆菌科的细菌的发展，可采用滤光片，使波长800纳米或更长波长的光透过，这样可以更有效地达到富集紫色非硫细菌的目的。

第三章发酵工业微生物菌种微生物发酵工业是利用微生物的生长和代谢活动生产各种有用物质的现代工业，它是以培养微生物进行发酵为主。

而在这个过程中，优良的菌种是一个现代化的发酵工业必不可少的，最为重要的环节。

其他如先进的生产工艺和先进的设备，则是为了更充分发挥优良菌种的性能而设计的。

第一节工业微生物菌种的分离和选育第二节工业微生物菌种的改良第三节发酵工业中菌种的退化第四节工业微生物菌种的保藏第五节工业微生物菌种的扩大培养第一节工业微生物菌种的分离和选育一般来说，从自然界直接分离到的菌种，不能立即适应实际的生产需要，只有通过选育，才能提高代谢产物的产量、改进产品质量直至简化工艺。

在微生物发酵工业中生产菌种的选育方法有：•微生物菌种的分离和选育•菌种的改良第一节工业微生物菌种的分离和选育一、微生物菌种的选育二、微生物常规育种三、根据代谢的调节机理选择高产突变菌株一、微生物菌种的选育从自然界分离新菌种一般包括以下几个步骤：1、采样2、增殖培养3、纯种分离4、性能测定1、采样采样地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等，进行综合、具体地分析来决定。

如果不了解某种生产菌的具体来源，一般可以从土壤中分离。

①、确定选好地点取离地面5——15cm处的土壤几十克，盛入预先消毒好的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，记录采样时间、地点、环境情况等，以备查考。

②、尽快分离一般土壤中芽孢杆菌、放线菌和霉菌孢子忍耐不良环境能力较强，不太容易死亡。

但一般应尽快分离。

③、酵母菌或霉菌类微生物采样酵母菌或霉菌类微生物，它们对碳水化合物的需要量比较多，一般又喜欢偏酸环境，所以在普通植物花朵、瓜果种子及腐植质等上面比较多。

2、增殖培养收集到的样品，如含有所需的菌种较多，可直接进行分离。

如果样品含有所需要的菌种很少，就要设法增加该菌种的数量，进行增殖（富集）培养。

富集培养：富集培养就是指利用不同微生物之间的生命活动特点的不同，制定出特定的环境条件，使仅仅适应于这种条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加的微生物的分离方法。

常用的几种典型的病原菌分离方法1．斑点病原菌的分离从病斑部分切取每边3～5 mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移入0.1％的升汞水溶液中处理3～5 min，以灭菌水冲洗3次，移置培养皿的培养基中，然后培养。

2．维管束组织内病原菌的分离从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后。

，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。

3．根腐病病原菌的分离根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。

材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。

4．肉质组织中病原菌的分离多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。

如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。

5．种子内病原菌分离将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移置培养基上。

6．孢子分离法能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。

7、土壤带菌分离法为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。

分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。

附录2 真菌单孢子分离技术一、目的要求了解单孢分离技术的基本原理，掌握简便实用的单孢分离方法。

二、基本原理单孢分离的方法很多，如振落法、稀释法和直接挑取法。

振落法和稀释法的共同点都是采用某种方法，使真菌孢子较稀疏地分散在水琼脂平板上，然后在显微镜下检查寻找在水琼脂平板表面的单个孢子，一旦找到理想的单个孢子，就通过无菌操作将其(连同一部分培养基)移植到PDA斜面培养基上，置适温下培养，形成的菌落即为单孢系菌株。

直接挑取法是在实体解剖镜下直接挑取单个孢子进行分离纯化的方法。

三、材料、用具与仪器1．材料(依本地资源情况进行选择，下列材料供参考)(1) 稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyricolaria oryzae)。

实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏一、实验目的和要求1。

了解微生物的分离纯化方法。

2.学习检测水中大肠菌群的方法。

3。

学习微生物的保藏及鉴定方法。

4。

熟悉革兰氏染二、实验原理多管发酵法多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。

发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管.乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气.1.初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养,24小时内小套管中有气体形成,并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群,为阳性结果。

48小时后仍不产气的为阴性结果。

2。

平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。

3.复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落,经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。

原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。

三、实验器材及试剂1。

水样污水样本2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。

3、器材及耗材：双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等四、实验方法及步骤1。

第一天实验前的准备1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL,并加入产气管.配置营养琼脂培养基，灌装进2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温高压灭菌20分钟，后放进恒温干燥箱。

2）包扎5套培养皿，包扎6根1mL、1根10mL移液管和3支滴管。

于121℃高压灭菌锅中灭菌20分钟。

3）称取一定量的液体石蜡,约为锥形瓶的三分之一。

于121℃高温高压灭菌20分钟。

生产中常用菌种的分离、选育和保藏在生产中，分离、选育和保藏常用菌种是非常重要的步骤，这些菌种可以用于各种不同的应用，如发酵过程中的生物转化、抗生素的生产以及食品工业中的乳酸发酵等。

以下是常用菌种的分离、选育和保藏的基本步骤：1. 分离：分离菌种是指从自然环境中分离出纯种菌株的过程。

首先，需要选择合适的样品来源，如土壤、水样或食品样品等。

然后，将样品进行稀释、接种到固体培养基上，培养出菌落。

最后，从菌落中挑选单一菌株，并进行纯化培养，得到纯种菌株。

2. 选育：选育是指对已有菌种进行进一步培养和筛选，选出优良品系。

在选育过程中，可以根据所需特性进行筛选，如产量高、抗性强或代谢产物优良等。

通过连续传代培养和筛选，可以逐步培育出符合要求的优良品系。

3. 保藏：保藏是为了长期储存和保存已经分离和选育得到的菌种。

常用的保藏方法包括冷冻保存和冷冻干燥等。

冷冻保存是将菌种保存在低温 (-80℃或液氮温度下)，可以长期保存并保持菌株的生物学性状。

而冷冻干燥则是在低温下将菌种先冷冻，然后通过真空蒸发使其脱水，最后用密封容器保存。

冷冻干燥具有长期保存时间和较小的储存体积的优点。

在菌种的分离、选育和保藏过程中，需要注意的是严格遵守无菌操作规范，以防止杂菌污染。

另外，应该建立相应的菌种信息管理系统，记录并标注每个菌株的来源、特性以及保藏条件等重要信息，以便日后使用和查询。

菌种的分离、选育和保藏在生产中扮演着极其重要的角色。

下面将进一步探讨这些过程，并介绍一些常用的菌种及其应用领域。

在分离菌种的过程中，重要的是选择适当的样品来源。

不同的环境中存在着各种微生物，如土壤、水体、植物、动物及其制品等。

通过采集不同来源的样品，可以获得不同类型和特性的微生物，从而得到多样性的菌株资源。

在接种前，样品经过稀释，使微生物适当分散。

然后将稀释液均匀接种于固体培养基上，并进行孵育。

在培养过程中，微生物通过分裂繁殖形成菌落，而每个菌落代表一个菌株。

菌种选育的常用途径菌种选育是指通过对微生物菌株的筛选、培养、改良等一系列措施，以提高其在特定应用领域中的产量、质量或其他相关性状。

菌种选育在农业、食品工业、医药领域等具有重要应用价值。

本文将介绍菌种选育的常用途径。

1. 野生菌株的筛选和收集野生菌株是从自然环境中采集到的未经人工干预的微生物。

通过对不同环境样品（如土壤、水体、植物组织等）进行采集和分离，可以获得大量潜在有用的菌株。

筛选出具有特定特性或功能的野生菌株，是进行菌种选育的第一步。

2. 菌株的培养和保存为了保持菌株的纯度和活力，需要对筛选得到的菌株进行培养和保存。

常见的培养方式包括液体培养和固体培养。

液体培养适用于大规模生产，而固体培养则适用于分离纯化和鉴定菌株。

还可以利用冷冻保存、低温冷冻保存和干燥保存等方法对菌株进行长期保存，以备后续的选育和应用。

3. 菌株特性的评价和筛选菌株特性的评价是判断菌株是否具有选育潜力的重要依据。

常见的评价指标包括产量、活力、稳定性、抗逆性、产物质量等。

通过对大量菌株进行系统的评价和筛选，可以找到具有优良特性的菌株，并进一步进行深入研究和选育。

4. 菌株改良菌株改良是指通过基因工程、诱变、融合等方法对已有菌株进行遗传改造，以获得更好的性状或功能。

基因工程技术可以通过引入外源基因或调控内源基因的表达来改变菌株的代谢途径或产物合成能力。

诱变则通过物理或化学手段诱导突变，从而获得新的遗传变异体。

融合是将两个不同亲本菌株进行杂交，以获得具有双亲优点的后代。

菌株改良是提高菌株性状和功能的重要手段。

5. 发酵工艺的优化发酵工艺的优化是在选育过程中不可或缺的一环。

通过调节培养基成分、培养条件（温度、pH值、氧气供应等）和发酵参数（搅拌速度、通气量等），可以促进菌株的生长和代谢产物的积累。

还可以利用统计学方法对发酵过程进行建模和优化，以提高发酵效率和产量。

6. 菌株应用评价菌种选育的最终目标是将优良菌株应用于实际生产中。

对菌株应用性能进行评价至关重要。

实验室常用菌种的保存和管理摘要：保藏菌种的目的不仅要保存菌株的生命本身，而且还必须要尽可能地使菌株的遗传性状保持不变，同时保证其在整个保存过程中不被杂菌污染。

因此，选择有效且稳定的保藏微生物菌种的方法至关重要。

关键词：菌种；保存；管理医学病原生物学实验室主要承担微生物实验教学任务，日常工作中经常要分离、鉴定细菌、试教演示、保存菌种等。

菌种是微生物实验的基本材料，因涉及到师生的安全，所以要正确保存，妥善管理，逐步实现菌种的保存制度化与科学化。

一、材料与方法1.教学实验常用的菌种保存营养要求不高的菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、志贺氏菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌。

营养要求高的菌种：链球菌、肺炎链球菌、白喉棒状杆菌、脑膜炎奈瑟菌。

厌氧芽孢杆菌：产气荚膜杆菌。

需氧芽胞杆菌：枯草芽孢杆菌。

真菌：白色念珠菌、新生隐球菌。

2.菌种的鉴定实验室中保存的菌种都要经过鉴定合格后方可使用，常用的鉴定方法有形态学观察、菌落特征、生化反应及血清学鉴定。

3.菌种的保存（1）定期传代保存法传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法。

传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低，培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。

①液体培养基低温保存法。

将保持营养要求不高的细菌接种于装有营养肉汤的试管中，营养要求高的细菌接种于含15%血清的营养肉汤中，经37℃培养18~14小时后，取出封口，置4℃冰箱保存。

②半固体穿刺保存法。

将细菌穿刺接种于普通半固体培养基内，37℃培养18~24小时后，在无菌条件下加入灭菌液体石蜡，厚度约1厘米，封口后置4℃冰箱保存。

③琼脂斜面保存法。

营养要求不高的菌种用普通琼脂斜面保存法，营养要求高的菌种用血液琼脂斜面保存，将细菌蜿蜒接种于血液琼脂斜面上，置37℃培养18~24h后，石腊封口，放于4℃冰箱保存。

④沙保氏培养基保存法。

中国微生物菌种保藏管理条例第一章总则第一条微生物学的研究在现代生物学中占有重要地位，随着我国社会主义建设的发展，在农业、林业、畜牧业、渔业、轻工、化工、采矿、环保、医药卫生和国防等方面起着越来越重要的作用。

菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是发展生物工程的重要基础条件之一，是国家的重要生物资源。

为了进一步做好菌种的分离筛选、收集保藏、鉴定编目、供应交流，以便使其更好地为四个现代化服务，特制订本管理条例。

第二条本条例所指的菌种，包括可以培养的有一定科学意义或实用价值的细菌、真菌、病毒、细胞等代表株。

第三条中国微生物菌种保藏管理委员会现设普通、农业、林业、工业、抗生素、医学、兽医微生物等菌种保藏管理中心。

第二章收集与保藏第四条收集（一）各保藏管理中心有权向国内有关单位收集和索取有一定价值的菌种。

（二）凡单位或个人分离，选育或引进具有一定价值的菌种，应及时将该菌种的复制培养物及详细资料，送交有关保藏管理中心。

确认有保存价值者，方可入藏。

（三）下述菌种均为国家重要的生物资源，均需向有关中心办理入藏手续。

１．申请专利的菌种；２．报部和省、自治区、直辖市级科研成果所涉及的菌种；３．新种、新型菌种。

第五条保藏（一）各保藏管理中心所保藏的菌种，必须具有该菌种的详细历史及有关实验资料。

（二）各保藏管理中心对其所负责保藏的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌种的污染或死亡。

（三）各保藏管理中心应制定安全、严密的保管制度，并指定专人负责。

（四）各保藏管理中心应尊重申请保藏单位或个人的劳动成果，并为共作证，维护其合法权益，不得擅自扩散。

第三章命名与编目第六条命名有关分类命名及统一译名等事宜，由委员会的学术组协同有关方面负责。

第七条编目（一）菌种目录是国家掌握生物资源的主要依据，为此在委员会的领导下，组织有关人员，编制或修订以下几种目录：１．中国菌种目录；２．各保藏管理中心的菌种目录；３．国家专利或保密的菌种目录；４．必要的其它菌种目录。