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第二章 菌种选育保藏与复壮PPT课件

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第二章-菌种选育、保藏与复壮

第二章-菌种选育、保藏与复壮


自 然 选 育
05年江南大学微生物(发酵)考研试题
资料显示，某些芽孢杆菌具有分解和利 用葡聚糖的能力，请设计方案从自然界中筛选 一产葡聚糖酶的菌株，并简要分析各主要步骤 的依据。
三、诱变育种
诱变育种：指人为地、有意识地将对象生物置于诱变因子中， 使该生物体发生突变，从这些突变体中筛选具有优良性状的 突变株的过程。 提高了菌种发生突变的频率和变异幅度，提高获优机率。
由葡萄糖制造果糖
医药、食用 酵母菌体蛋白 食品工业 食用、医药
柑橘罐头脱除苦味
分解单宁、酶精制、酒精发酵工业 同枯草杆菌蛋白酶 葡萄糖制造、酒精厂糖化、医药 腐乳生产 蛋白除葡萄糖、脱氧、食品罐头贮存 淀粉和食品加工、饲料 食用、化工 葡萄糖制造、酒精厂糖化、调色剂
枯草芽孢杆菌
戊糖片球菌
植物乳杆菌
菌种种属的鉴定
• 鉴定工作的内容
（1）测定一系列必要的鉴定指标； （2）查找权威鉴定手册，确定菌种类型。
• 鉴定方法
（1）经典的分类鉴定方法：形态学特征；生理生化特征； 血清学试验与噬菌体分型；氨基酸顺序和蛋白质分析
（2）现代分类鉴定方法：微生物遗传型；细胞化学成分； 数值分类法
二、自然选育
自然选育的定义
（4）生长繁殖力强，速度快，较强产孢能力；
（5）原料广，价廉，易被微生物利用、转化；
（6）对添加的前体物质有耐受能力；
（7）菌种纯，遗传特性稳定，抗噬菌体能力强。
2019/6/19
4
二、现代发酵工业常见菌种
类别
细菌 酵母菌
霉菌
微生物名称 短杆菌 短杆菌 枯草杆菌 枯草杆菌 巨大芽孢杆
菌 酒精酵母 假丝酵母 脆壁酵母 黑曲霉
第二节 菌种选育
2菌种选育、保藏与复壮

2菌种选育、保藏与复壮


六、基因工程技术
▪ DNA重组技术 ▪ DNA重组技术的基本程序 ▪ DNA重组的操作
基因的剪刀——限制性内切酶
基因的针线——DNA连接酶
▪ 黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口， 带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对， 这样的切口叫做黏性末端。
▪ DNA连接酶：两种来源不同的DNA用同一种限制 酶来切割，然后让两者的黏性末端通过互补的碱 基黏合起来，DNA连接酶在断口处把两条DNA末 端之间的缝隙“缝合“起来——形成共价键。
孟德尔（G. J. Mendel 1822-1884 ）
（2）摩尔根 果蝇试验
美国的生物学家与遗 传学家，发现染色体的 遗传机制，创立染色体 遗传理论，现代实验生 物学奠基人。 1933年，摩尔根获得 诺贝尔生理医学奖。
J. H. Morgan(1866-1945)
（3）1868年，年轻的瑞 士化学家、医生米歇尔 （Miesher,F.1844～ 1895）从细胞核中分离 出核酸。
第二章 菌种选育、保藏与复壮
▪ 菌种选育 ▪ 菌种保藏与复壮 ▪ 国内外主要的菌种保藏机构
第一节 菌种选育
▪ 一、微生物菌种选育的理论基础 ▪ （一）微生物的遗传性和变异性 ▪ 遗传 ▪ 变异 ▪ 微生物的遗传性和变异性的特点
（二）遗传变异的物质基础
1.研究的历史 （1）孟德尔 豌豆试验
奧地利 遗传学 家、修 道士孟 德尔
（一）突变： 自发突变 诱发突变 定向育种
（二）诱变的基本原理 ▪ 1.诱变剂
物理诱变剂 诱变剂 化学诱变剂
生物诱变剂
2. 诱变剂作用机理
（1）物理诱变因子诱变机理 （2）化学诱变剂诱变机理 （3）生物诱变剂诱变机理
第二章生产中常用菌种的分离、选育和保藏-PPT精品文档

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三、新种分离与筛选的步骤
• 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生 长培养特性。 • 采样：有针对性地采集样品。 • 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需 菌种增殖培养后，在数量上占优势。 • 分离：利用分离技术得到纯种。 • 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性 包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特 性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温 度、生长和发酵最适温度、最适pH 值、提取工 艺等。
（一）采样
1. 采样对象：以采集土壤为主，也可以是植物， 腐败物品，某些水域等。 2. 采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 3. 采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去 表土，取离地面5-15cm处的土约 10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋 中，扎好，标记，记录采样时间、 地点、环境条件等，以备查考。
单孢子悬液
诱变处理 稀释涂布平皿 单菌落转接斜面
取高产斜面 （菌种保藏） 转接斜面 摇瓶复筛 高产菌株 中试考查
采样和采集方法
• 为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的 细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域 中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。 • 样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样 采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋 和塑料瓶等。
1．土样采集方法
• 森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层 顺序采集； • 水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆 筒采集，可取离地面5～15cm处的土。将采集到的 土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。 • 在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢 慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗 去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根 部残留的土，这部分上却为根际土样。
四、自然界中细菌的分离
2第二章 菌种的选育、保藏和复壮

2第二章 菌种的选育、保藏和复壮


② 色素：对于产生色素的菌落，特别从有色变为白 色者，更要挑选出来，因为色素对于产品质量有关，避 免色素产生可以简化提炼过程。 ③生理生化：变异不容易直接辨认。实践中常采用 特别方法加以测定。例如在含有酪蛋白的培养基上，是 否有透明圈出现，以及透明圈大小可用来判断该菌是否 能产生蛋白酶以及酶活力的强弱。
左：MSA：可抑制葡萄球菌以外之菌的生长，发酵甘露 醇的葡萄球菌会使培养基变黃。
中：淀粉培养基：测定微生物是否具有淀粉酶。 右：血液培养基：用於测定微生物是否具有溶血性。
马康基氏培养基：可抑制革兰氏阳性菌生長，乳糖发酵 菌会生成红色菌落，非乳糖发酵菌則形成无色的菌落。
三酪脂琼脂培养基：测定微生物是否具有解脂酵素
④一次处理和分次处理的效果一样。但时间间隔 不能太久。5s+5s =10s ⑤具体操作：开灯预热20min(使光波稳定)→5mL 菌悬液→φ6cm培养皿→离灯30cm处→照射。 注意: a.培养皿底要平整并要摇动或利用磁力搅拌 设备，以求照射均匀。 b.对于有光复活作用的菌体,照射后须在红光 下操作。 c.处理后的菌悬液增殖培养期间，可用黑纸 包住平皿。
(一）诱变剂的种类
①物理诱变剂 射线如紫外线、X-射线、γ-射线，快中子 ②化学诱变剂 碱基类似物、 5- 氟尿嘧啶、烷化剂、亚硝 基胍和甲基磺酸乙酯等。
化学诱变剂，比物理诱变剂电离辐射有效， 而且很很经济，但大部分诱变剂是致癌剂，危 害性大。
（二）诱变育种的基本步骤
1.基本步骤 •出发菌株的选择
胞系统内进行复制和表达的育种方法（又称
分子克隆）。
四、杂交育种
两个不同基因型的菌株通过结合或原生
质体融合遗传物质重新组合，在从中分离和
筛选初具有新性状菌株的育种方法
菌种选育保藏与复壮

菌种选育保藏与复壮


噬 菌 体 感 染 试 验
植物病毒重建实验
HRV：车前草病毒；TMV：烟草花叶病毒
实验证明，遗传信息的流向与DNA的传递是一致的。
2.遗传物质的分子结构和化学组成 （1）遗传物质的化学 组成 （2）遗传物质的结构 （3）DNA的复制：半 保留、半不连续复制。
3.遗传物质在细胞中的存在形式
紫外线对DNA的损伤及其修复
UV
嘧啶
嘧啶二聚体
光复活作用
光解酶 嘧啶
嘧啶二聚体
四、微生物的杂交育种
（一）杂交育种的目的 （二）杂交育种的程序 1菌种准备 2.杂交育种使用的培养基 3.杂交育种的方法
五、原生质体融合
原生质体 原生质体融合 原生质体融合技术的特点 微生物原生质体融合育种方法 （标记菌株筛选、原生质体制备、原生质体再生试验、 原生质体融合、融合子的选择） 出现问题及解决方法
六、基因工程技术
DNA重组技术 DNA重组技术的基本程序 DNA重组的操作
第二节 菌种保藏与复壮
菌种保藏的目的和原则：
目的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、 生产、交换之用。 基本原则：1、挑选典型菌种的优良纯种。 2、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体 3、创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低 温）。 4、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重 要的微生物菌株。
第二章 菌种选育、保藏与复壮
菌种选育 菌种保藏与复壮 国内外主要的菌种保藏机构
2013年12月
第一节 菌种选育
一、微生物菌种选育的理论基础 （一）微生物的遗传性和变异性 遗传 变异 微生物的遗传性和变异性的特点
（二）遗传变异的物质基础
1.研究的历史 （1）孟德尔 豌豆试 验
第二章 菌种选育保藏与复壮PPT课件

第二章 菌种选育保藏与复壮PPT课件

单细胞真菌 脂肪酶 淀粉酶 蛋白酶
14 04.12.2020
黑曲霉
15 04.12.2020
黑曲霉
16 04.12.2020
青霉
17 04.12.2020
米曲霉
蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等
18 04.12.2020
根霉
19 04.12.2020
绿色木霉
产生微晶纤维素酶，羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶，可完全水解纤维素。
纯度
操作方法
适用情 况
菌落纯
稀释平板法、划 线法、表面 皿法
退化不 严重
44
04.菌12.株20纯20 单细胞分离法
退化不
（二）淘汰已衰退的个体
可通过物理、化学方法处理菌体或孢子，使其大部分死亡(80%以上)， 存活的菌多为生长健壮者，从中选出优良菌株。 ❖ 用10%酒精处理，能耐之的一般为原菌株（啤酒酵母）。 ❖ 在培养基内加青霉素，抗药性较强的细菌一般为原菌株(产抗生素)。 ❖ 适当提高培养温度 ❖ 加乳酸，淘汰酸奶菌种中的衰退个体。 一般可将单菌落分离与培养条件综合进行复壮，效果更好
4 04.120
类别
细菌 酵母菌
霉菌
04.12.2020
微生物名称 短杆菌 短杆菌 枯草杆菌 枯草杆菌 巨大芽孢杆菌 酒精酵母 假丝酵母 脆壁酵母 黑曲霉 黑曲霉 黑曲霉 栖土曲霉 根霉 毛霉 青霉菌 木霉菌 黄曲霉菌 红曲霉 米曲霉
产物 谷氨酸 肌苷酸 淀粉酶 蛋白酶 葡萄糖异构酶 酒精 单细胞蛋白 乳糖酶 柠檬酸 柚苷酶、酸性蛋白酶 单宁酶、糖化酶 蛋白酶 糖化酶、甾体激素 蛋白酶 葡萄糖氧化酶 纤维素酶 淀粉酶 糖化酶、红曲色素 蛋白酶
26 04.12.2020
第二章菌种选育3

第二章菌种选育3

第二章 菌种的选育、保藏与复壮
第一节、微生物工业用菌种 第二节、菌种的来源 第三节、菌种的选育 第四节、菌种保藏 第五节、菌种的提纯与复壮
第一节、微生物工业用菌种
一、微生物工业对菌种的要求 微生物资源丰富，广布于土壤、水和空
气等自然界中，其中土壤中最多。
发展趋势： 从野生型 自然选育 诱变育种
解决办法：把富集培养物接种到新鲜的同一 种培养基中可以重新建立选择压力，重复移 植几次后，将富集培养物再接到固体培养基 上。
２、固体培养基培养：
常用于分离某些酶产生菌，其选择培养基中常含 有所需酶的基质，以便促进酶产生菌的生长。
e.g. 碱性蛋白酶的分离
用不同pH的土壤作为原始种子。土壤必须经过巴 氏灭菌消毒，以减少不产孢子的微生物，然后铺在pH 为9~10的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表 面。
工业上常用菌种举例：
1、常用的细菌

大肠杆菌
应用：生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。
乳酸杆菌
应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶 等的制作
枯草芽孢杆菌 应用：生产淀粉酶
2、酵母菌
种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵 母、面包酵母。 应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取 蛋白质、生产脂肪。
二、重要工业微生物的分离方法
施加选择压力的分离方法：
1 、富集液体培养 ：指能增加混合菌群中所 需菌株的数量的一种技术。
要领： 给混合菌群提供一些有利于所需菌株 生长或不利于其他菌群生长的条件。
e.g. 供给特殊的基质或加入某些抑制剂。
注意：所需类型的菌株生长的结果，有时会 改变培养基的性质，从而改变选择压力，使 其他微生物生长。
啤酒酵母
红酵母 面包酵母
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04.12.2020
分离 纯化
性能 鉴定
纯种分离的 常用方法有 平板划线分 离法、稀释 分离法和涂 布分离法。
一般生产性 能的测定通 过初筛和复 筛的方法来 确定。
23
1.样品采集
① 原则
样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。
② 土壤采样方法
土壤的有机质含量和通风状况（5～25cm深度） 土壤的细pH菌和、植放被线状菌况：耕地、菜园和近郊土壤；
第二章
菌种选育、保藏与复壮
主讲： 6889484@
Contents 第一节 食品发酵与酿造工业菌种 第二节 菌种选育 第三节 菌种保藏与复壮 第四节 国内外主要菌种保藏机构
2 04.12.2020
第一节 食品发酵与酿造工业菌种
3 04.12.2020
一、现代发酵工业对菌种的要求
（1）非病源菌，不产生有害活性物或毒素； （2）发酵周期短，发酵产物的产生能力强； （3）高转化，易分离纯化，低成本，高质量； （4）生长繁殖力强，速度快，较强产孢能力； （5）原料广，价廉，易被微生物利用、转化； （6）对添加的前体物质有耐受能力； （7）菌种纯，遗传特性稳定，抗噬菌体能力强。
32 04.12.2020
自 然 选 育
33 04.12.2020
05年江南大学微生物(发酵)考研试题
资料显示，某些芽孢杆菌具有分解和利用葡聚糖的能 力，请设计方案从自然界中筛选一产葡聚糖酶的菌株， 并简要分析各主要步骤的依据。
34 04.12.2020
三、诱变育种
诱变育种：指人为地、有意识地将对象生物置于诱变因子
③ 富集培养的方式 分批培养（Batch culture ） 连续培养（Continuous culture ） 分批补料培养（Fed-batch culture ）
25 04.12.2020
3.纯种分离
（1）平板划线分离法 （2）稀释分离法 （3）涂布分离法 （4）毛细管分离法 （5）小滴分离法
04.12.2020
28
溶磷细菌的平板筛选(5d)
29 04.12.2020
高效溶磷的真菌菌株
青霉菌溶磷实验
30 04.12.2020
4.性能鉴定
生产性能测定
通常使用初筛和复筛的方法确定。直接从自然界分离得到的菌株为野 生型菌株。我们常将这些自然界中直接获得的新菌株称为进一步育种 工作的原始菌株或出发菌株。
226
27 04.12.2020
初筛和复筛
（1）初筛（定性——粗放！） ① 平板筛选 （变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈 ） ② 摇瓶发酵筛选
（2）复筛（定量——精确！） 1个菌株重复3～5瓶，精确分析 如酶活力单位、耐酒精程度等。
28 04.12.2020
地•理pH＜条7酵件.0母：菌霉：菌果、园酵树母根的菌土居壤多中；
季节条霉件 菌：动植物残体及霉腐土层中；
•pH7.0黑～曲7.霉5：：细稻菌场、、谷放物线堆菌积丰处富。
24 04.12.2020
2.富集培养
① 富集培养的目的 利用人工环境，使样品中目标微生物成为优势菌。
② 富集培养的方法 控制培养基的营养成分 控制培养条件
毒性试验
若毒性大而且无法排除者应予以淘汰。
种属鉴定
04.12.2020
菌种种属的鉴定
• 鉴定工作的内容 （1）测定一系列必要的鉴定指标； （2）查找权威鉴定手册，确定菌种类型。 • 鉴定方法 （1）经典的分类鉴定方法：形态学特征；生理生化特征；
血清学试验与噬菌体分型；氨基酸顺序和蛋白质分析 （2）现代分类鉴定方法：微生物遗传型；细胞化学成分；
20 04.12.2020
拟康氏木霉
产生纤维素酶，羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶，可完全水解纤维素。
21 04.12.2020
第二节 菌种选育
22 04.12.2020
一、新菌种的分离与筛选
样品 采集
富集 培养
样品来源越 广泛，获得 新菌种的可 能性越大。
利用人工环 境，使样品 中目标微生 物成为优势 菌。
用途
食用、医药
食用、医药
葡萄糖、糊精、酒精发酵、啤酒酿造
酱油速酿、饲料
由葡萄糖制造果糖
医药、食用
酵母菌体蛋白
食品工业
食用、医药
柑橘罐头脱除苦味
分解单宁、酶精制、酒精发酵工业
同枯草杆菌蛋白酶
葡萄糖制造、酒精厂糖化、医药
腐乳生产
蛋白除葡萄糖、脱氧、食品罐头贮存
淀粉和食品加工、饲料
食用、化工
葡萄糖制造、酒精厂糖化、调色剂
酱油酿造
6
枯草芽孢杆菌
7 04.12.2020
戊糖片球菌
8 04.12.2020
植物乳杆菌
9 04.12.2020
多粘类芽孢杆菌
10 04.12.2020
酿酒酵母
11 04.12.2020
粉状毕赤酵母
12 04.12.2020
红葡萄浓缩汁中的酵母菌形态
13 04.12.2020
产朊假丝酵母
单细胞真菌 脂肪酶 淀粉酶 蛋白酶
14 04.12.2020
黑曲霉
15 04.12.2020
黑曲霉
16 04.12.2020
青霉
17 04.12.2020
米曲霉
蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等
18 04.12.2020
根霉
19 04.12.2020
绿色木霉
产生微晶纤维素酶，羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶，可完全水解纤维素。
数值分类法
31
二、自然选育
自然选育的定义
利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性状的菌 株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株，达到纯化与 复壮菌种、保持稳定生产性能的目的。其主要原理是微生物群体分离。
自然选育的方法
（1）通过表现形态淘汰不良菌株； （2）考察目的代谢产物产量； （3）进行遗传基因型纯度试验，考察菌种纯度； （4）传代稳定性试验：斜面传3-5代。
4 04.12.2020
04.12.2020
4
5 04.12.2020
类别
细菌 酵母菌
霉菌
04.12.2020
微生物名称 短杆菌 短杆菌 枯草杆菌 枯草杆菌 巨大芽孢杆菌 酒精酵母 假丝酵母 脆壁酵母 黑曲霉 黑曲霉 黑曲霉 栖土曲霉 根霉 毛霉 青霉菌 木霉菌 黄曲霉菌 红曲霉 米曲霉
产物 谷氨酸 肌苷酸 淀粉酶 蛋白酶 葡萄糖异构酶 酒精 单细胞蛋白 乳糖酶 柠檬酸 柚苷酶、酸性蛋白酶 单宁酶、糖化酶 蛋白酶 糖化酶、甾体激素 蛋白酶 葡萄糖氧化酶 纤维素酶 淀粉酶 糖化酶、红曲色素 蛋白酶