(优选)菌种选育保藏与复壮

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菌种保藏方法及复壮技术菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。

需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。

目前常用的菌种保藏方法有以下几种。

1菌种保藏方法1.1斜面低温保藏法将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。

由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。

每隔六个月转管一次。

草菇菌种不耐低温，需保藏在10~12℃，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防冻剂（10%的甘油）。

如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。

这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。

1.2液体石蜡保藏法石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。

一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。

液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1~2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。

在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。

液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。

如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。

食用菌菌种关键技术创新与产业化应用
食用菌菌种关键技术创新与产业化应用是当前食用菌产业发展的重要方向。

以下是一些关键技术创新和产业化应用的例子：
1.菌种选育与改良：通过遗传学、分子生物学等现代生物技术手段，对食用菌菌种进
行选育和改良，提高菌种的生长速度、产量和品质。

例如，利用基因编辑技术，对食用菌菌种进行基因改造，使其具有更好的生长性能、抗逆性和营养品质。

2.菌种保藏与复壮：建立科学的菌种保藏和复壮技术体系，保证菌种的遗传稳定性和
生产性能。

例如，采用低温保藏、真空冷冻干燥保藏等方法，对菌种进行长期保存，并在需要时进行复壮，恢复其生产性能。

3.智能化栽培技术：利用物联网、大数据、人工智能等现代信息技术手段，实现食用
菌栽培的智能化管理。

例如，通过智能传感器监测温湿度、光照、CO2浓度等环境参数，自动调节温室环境，提高食用菌的生长速度和产量。

4.病虫害防治技术：研究和发展食用菌病虫害防治技术，减少化学农药的使用，保障
食用菌的安全性和品质。

例如，利用生物防治技术，引入天敌昆虫、微生物等自然控制因子，对食用菌病虫害进行生物防治。

在产业化应用方面，可以通过建立食用菌产业化基地、推广先进的栽培技术和管理模式、加强品牌建设等措施，推动食用菌产业的快速发展。

同时，还可以将食用菌产业与其他农业产业相结合，形成产业链和产业集群，提高整个农业产业的综合效益。

总之，食用菌菌种关键技术创新与产业化应用是推动食用菌产业发展的重要手段，可以提高食用菌的产量和品质，促进农业增效和农民增收，具有重要的现实意义和长远价值。

微生物育种及工业菌种退化复壮和保藏方法一、代谢调控育种Metabolic Control Breeding１.营养缺陷型突变株（auxotroph mutant）•酶缺陷，结果造成中间产物积累；•解除协同反馈，使另一分支末端产物积累；•渗漏型突变（酶未完全丧失活性，下降），末端产物少，中间产物积累。

2.抗反馈调节突变株（regulation defective mutant）突变株筛选•调节基因或操纵基因突变，产生的阻遏蛋白与不能结合或结合；•结合，但不发生作用；•结构基因突变，使结构酶无结合能力但有催化活性；方法：末端产物结构类似物筛选；营养缺陷型回复突变株筛选．3.组成型突变株（constitutive mutant）筛选•突变发生在调节基因或操纵基因,解除对诱导物的依赖,可获组成型突变株。

•筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。

①加诱导酶合成抑制物②交替培养法③显色反应法４.抗（敏感）性突变株（resistant mutant）筛选•包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体①抗生素抗性突变：提高产量②抗噬菌体突变：消除噬菌体污染③条件抗性突变：如温度，可提高产量④物敏突变：如氟乙酸敏感突变型，顺乌头酸酶活性极低，异柠檬酸产量少，柠檬酸积累。

二、基因重组育种（gene recombination breeding）基因重组育种的定义：是指采用接合、转化、转导、原生质体融合、有性杂交及准性生殖等遗传学方法和技术，使微生物细胞内发生基因重组，以增加优良性状的组合或者导致多倍体的出现，从而获得优良菌株的一种育种方法。

（P24第2段）1.原核生物的基因重组育种（1）接合（conjugation）定义；大肠杆菌的4种不同接合型菌株：F+、F-、Hfr菌株和F’菌株（2）转导（transduction）转导、转导子（transductant）、转导噬菌体（3）转化（transformation）转化、转化子（transformant）、感受态（competence）2.真核微生物的基因重组育种主要有有性杂交、准性杂交、原生质体融合和转化等形式。

食用菌菌种的提纯与复壮
一、提纯。

用各种方法分离得到的菌种，在培养基上萌发的新菌丝，有的活力强，有的弱，有的往往带有杂菌，为避免在生产中失败，应提纯后再使用。

其方法是：1、多孢杂交的，于无菌区内将健壮、生长快的菌丝体挑起移接到经灭菌过的母种培养基上。

2、各种方法分离的，于无菌区内将生长快而健壮的菌丝的尖端部位挑取黄豆大小的菌丝体移接到经灭菌过和母种培养基上。

经过提纯的菌丝长满以后，即可供作生产使用。

二、复壮。

食用菌种长期在同一培养基上培养和保藏时间过长，均会导致菌丝生活力降低，为夺取食用菌高产，必须经过复壮才能用于生产，其方法是：1、菌种在低温保藏期间应每隔2到3个月移接一次。

2、菌丝在各种营养成分有限的同一培养基上长期培养，因欠缺某种成分而丧失活力，以导致菌种老化，应适时变换培养基成分和比例，既可增强菌种活力，促进良种复壮，又可提高菌种成活率。

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第二章菌种选育、保藏与复壮（一）复习思考题1、什么是菌种选育？优良菌种选育的方法主要有哪些？3、微生物菌种保藏的目的（3个）、原理（2点）及常用的保藏方法（7种）。

4、造成菌种退化的原因是什么？生产中如何防止菌种的退化？（二）生产工艺流程第三章微生物的代谢调控理论及其在食品发酵中的应用（一）复习思考题1、什么是微生物代谢？微生物代谢过程的自我调节主要表现在哪些环节上？3、微生物代谢的反馈调节作用主要有哪些类型？在发酵生产中如何克服微生物代谢的反馈调节作用？（1）类型：反馈抑制和反馈阻遏（2）措施：1.改变微生物的遗传特性；2. 控制发酵的工艺条件；3.改变细胞膜的渗透性4、什么是代谢控制发酵？在发酵生产中改变微生物遗传特性来调控代谢的方法有哪些？5、通过控制细胞膜渗透性来提高发酵产物产量的原理是什么？（二）生产工艺流程第四章发酵工程学基础（一）复习思考题6、根据你所学的发酵工艺学知识，简述补料分批发酵的主要应用领域有哪些？7、发酵过程中引起发酵液温度变化的因素有哪些？对发酵过程有何影响？生产上发酵温度选择的依据是什么？（1）因素：生物热、搅拌热、辐射热、蒸发热（2）影响：温度影响细胞酶的活性、发酵液的性质、代谢产物的合成方向。

（3）依据：综合考虑微生物最适生长温度、发酵产物生成、通气条件等因素。

8、发酵液中溶解氧浓度对发酵过程有何影响？生产上如何控制发酵液溶解氧浓度？（1）影响：溶氧过高会引起能量过度消耗并对细胞产生危害、抑制代谢产物的合成、影响培养基的电位；溶氧过低影响微生物的呼吸，造成代谢异常。

（2）措施：配置搅拌叶和挡板，分散气体；改变通气量和搅拌速度，控制溶氧速率；控制发酵液黏度，改变传质阻力。

9、发酵过程中引起发酵液pH变化的因素有哪些？对发酵过程有何影响？生产上如何控制发酵液pH？（1）因素：①引起发酵液pH下降的因素—碳源过多、消泡油加多、生理酸性物质过多；②引起发酵液pH上升的因素—氮源过多、生理碱性物质过多、中间补料时，碱性物质添加过多。

第五节菌种的衰退、复壮和保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。

影响微生物菌种稳定性的因素有变异、污染、死亡。

由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。

因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。

对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。

一、斜面冰箱保藏法一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满于4℃冰箱保存。

保存期3月到6月。

二、沙土管保藏法适合于产孢子或芽孢的微生物。

首先，将沙与土洗净、烘干、过筛，按沙与土的比例为1—2：1混合均匀，分装于小试管中，料高1厘米左右，121C间歇灭菌三次，烘干备用。

一般沙80目，土80一100目。

其次，将孢子制成悬浮液，接入沙土管。

或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保存。

保存期1年左右。

三、菌丝速冻法不产孢子或芽孢的M可用甘油菌丝速冻法。

该法保藏温度为-20℃，为避免M受损伤致死，需甘油作保护剂。

甘油最终浓度为25％。

操作：①、配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②、制备菌悬液，一般浓度为108～1010个/mL；③、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置-20℃保藏。

四、石蜡油封存法向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，量高出斜面1cm，然后保存在冰箱中。

此法适于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等M的保存。

保存期约1年五、真空冷冻干燥保藏法是目前国内外较理想的常用方法。

其基本原理是在较低温度下(-18℃)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。

在这样的环境中，M的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。

菌种可保存5年左右。

菌种复壮的方法菌种复壮是一种通过增强细菌的代谢活性和生长速度来增加其工业价值的方法。

这种方法可以为生物工艺学和生物技术工业提供更高效的微生物工具。

在工业中，微生物的发酵生产是一种重要的生物技术，因为微生物可以用来生产食品、药品、化学品等。

菌种复壮是一种有效的方法来提高微生物的生产效率和质量。

以下是一些菌种复壮的方法：1. 培养基优化培养基是微生物生长的基础。

优化培养基可以提高微生物的生长速度和代谢活性。

例如，调整pH值、添加营养物质、控制培养温度等都可以改善培养基的质量。

2. 培养条件调节微生物对环境的适应性很强，因此，调整培养条件也可以提高微生物的生长速度和代谢活性。

例如，调节氧气、碳源、氮源等可以改善微生物的生长条件。

3. 基因改造基因改造是一种改变微生物遗传信息的方法。

通过改变微生物的基因组，可以增加其代谢活性和生长速度。

例如，引入外源基因、删除负面基因等都可以改善微生物的性能。

4. 低温保藏低温保藏是一种延长微生物寿命的方法。

通过将微生物保存在低温环境中，可以延长其存活时间，同时保持其生物活性。

5. 免疫反应调节免疫反应调节是一种通过影响微生物免疫反应来提高其生产效率的方法。

例如，使用抗生素可以抑制微生物的免疫反应，从而提高其生产效率。

6. 适应性培养适应性培养是一种通过让微生物逐渐适应新环境来提高其适应性的方法。

例如，将微生物逐渐暴露在新的培养条件下，可以让其逐渐适应新环境，从而提高其生产效率。

以上就是一些常见的菌种复壮方法。

这些方法可以单独或联合使用，以提高微生物的生产效率和质量。

在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的方法，以达到最佳效果。

菌种保存方法和菌种的衰退复壮菌种保存方法微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。

低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。

保藏方法大致可分为以下几种：1．传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。

2．液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

3．载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

4．寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。

病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法5．冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

6．冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。

有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。

保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。

保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。

三、器材细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2c m），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。

菌种复壮的原理及方法从衰退的群体中寻找尚未衰退的个体，进行分离培养，达到恢复菌种优良性状的过程，称为菌种复壮。

在实际生产中，一般在菌种尚未退化之前进行菌种复壮。

1.菌种复壮的原理：自然界生物以遗传变异为基础通过自然选择得以进化。

变异提供了选择的基础，选择保存适应环境的个体，这些个体使优良特性得以遗传。

如此再变异、再选择、再遗传，循环往复，使生物得以不断进化。

2.菌种复壮方法：（1）菌丝尖端分离：挑取健壮菌丝体的顶端部分，进行纯化培养，使菌种恢复原有的生活力和优良种性，达到复壮的目的。

（2）适当更换培养基：长期使用同一培养基继代培养菌种，可能会使菌种生活力逐渐下降。

在菌种继代培养中，要经常改变培养基成分，在培养基中适当添加酵母膏、维生素等物质，以刺激菌丝生长，提高菌种活力。

（3）进行分离复壮：从栽培的群体中，找出尚未衰退表现的个体，通过组织分离获得菌种，进行提纯复壮。

采用菌丝体进行菌种复壮时，用无菌水将斜面上的菌丝稀释，再将菌丝体放入装有无菌蒸馏水的三角瓶中摇匀，然后转接到平板培养基上，使菌丝分布均匀，适宜条件培养至萌发成菌落。

从中挑选生长健壮的菌丝转接后作为母种。

需要进行栽培试验，如果复壮菌种与原来菌种性状一致，表明菌种得到复壮。

（4）定期进行菌种分离：对生产中应用的菌种，每1~2年分离1次，才能起到复壮的作用。

通常选择具本品种典型性状、生长健壮、无病虫害的子实体进行组织分离，重新获得生长旺盛、活力强的菌丝。

反复进行无性繁殖，也会造成菌种衰退。

可定期采集有性孢子通过单孢杂交或多孢杂交进行菌种复壮。

不管采用何种方法，得到的菌种只有经过出菇检验证明其性状优良后，才能在生产上应用。