www第九章原生质体培养
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第9章植物原生质体培养和体细胞杂交技术第9章植物原生质体培养和体细胞杂交技术第1节原生质体培养技术植物原生质体特点:1)易于获得大量的遗传上同一的游离原生质体;2)保持着植物细胞的全能性;3)无壁的植物原生质体仍能进行植物细胞的各种生命活动。
4)可以被诱导与其他物种的原生质体融合;5)是植物遗传转化的理想受体;……1 原生质体的分离1.1 材料几乎植物体的每一部分都可分离得到原生质体.常用:叶片:大田;温室;人工气候室;试管苗等愈伤组织和悬浮培养的细胞胚性细胞不同来源的材料各有利弊。
保持材料的培养条件相对稳定十分重要。
1.2 材料的预处理方法有:低温处理、黑暗处理、预培养、预质壁分离、预萎蔫等。
1.3 常用酶的种类和酶液的配制不同种类、器官和细胞的壁的组成和结构不尽相同, 应选相应酶进行处理.(1) 酶制剂的种类常用:纤维素酶; 果胶酶; 离析酶; 崩溃酶; 半纤维素酶; 蜗牛酶; 等等。
使用原则:以用最少的酶制剂品种,最少的量(与酶活高低有关),但能分离得到完整、健康的原生质体为准.(2)酶溶液的配制一般由不同的酶制品、渗透稳定剂以及稳定质膜的药品组成. 有还需加入少量缓冲剂或其它药品。
离心取上清液,微孔滤膜过滤除菌。
1.4 原生质体的制备(1) 一步酶处理法: 把一定量的酶(一般是纤维素酶和果胶酶)配制成混合酶溶液,对材料作一次性处理.(2) 两步酶处理法: 先用果胶酶降解中胶层获得单细胞, 再用纤维素酶降解细胞壁获得原生质体.材料处理时所用的酶浓度、温度、处理时间等应根据材料和实验的要求来定,最好作预实验.1.5 原生质体的收集和纯化细胞壁酶解↓尼龙网或不锈钢网过滤(网孔视原生质体的大小而异, 一般在300目左右) ↓用离心等方法收集.↓洗涤纯化原生质体(离心沉淀法;漂浮法;界面法;等等)1.6 原生质体活力测定测定原生质体的活力的常用方法:(1)形态特征观察(2)胞质环流等观察(3)活体染色[番红、荧光素双醋酸盐(FDA)等](4)其他(呼吸、光合等)2. 原生质体的培养2.1 培养基和一般组织培养所用培养基的基本成分相似,主要区别有:(1)大量元素: 钙离子含量要提高; 常减少甚至不用铵态氮,提高硝态氮的浓度或用有机氮等.(2)有机成分: 一般有机物丰富的培养基有利于细胞分裂; 2,4-D促进原生质体的分裂,但不利于其分化.使用条件培养基往往效果较好.(3) 渗透势: 培养基一般适当高渗常用渗透调节剂:甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。