下载文档原格式
蛋白质检测方法蛋白质是生物体内一类重要的有机化合物，它们在细胞的结构和功能中起着至关重要的作用。
因此，对蛋白质进行准确、快速的检测具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白质检测方法，帮助读者更好地了解蛋白质检测的原理和应用。
一、SDS-PAGE电泳法。
SDS-PAGE电泳法是一种常用的蛋白质检测方法，它通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，再通过共染色或Western blotting技术检测目标蛋白。
这种方法操作简单，成本低廉，适用于大多数蛋白质的检测。
二、免疫沉淀法。
免疫沉淀法是利用抗体对特定蛋白质的亲和性，将目标蛋白质与抗体结合，再通过沉淀的方式将蛋白质分离出来。
这种方法对蛋白质的特异性要求较高，但可以用于检测特定蛋白质在复杂混合物中的存在和表达水平。
三、质谱法。
质谱法是一种高灵敏度、高分辨率的蛋白质检测方法，它通过质谱仪将蛋白质分子进行分析和检测。
质谱法可以检测蛋白质的分子量、氨基酸序列、翻译后修饰等信息，对于蛋白质的全面分析具有重要意义。
四、酶联免疫吸附测定法。
酶联免疫吸附测定法是一种常用的蛋白质检测方法，它利用酶标记的抗体对蛋白质进行特异性识别，再通过底物的反应产生颜色信号进行检测。
这种方法操作简便，灵敏度高，广泛应用于临床诊断和科研领域。
五、荧光标记法。
荧光标记法是利用荧光染料对蛋白质进行标记，再通过荧光信号的检测来分析蛋白质的存在和表达水平。
这种方法对于多通道检测和高通量筛选具有优势，适用于高通量蛋白质组学研究。
六、生物传感器法。
生物传感器法是利用生物传感器对蛋白质进行特异性识别和检测，通过信号转导来实现蛋白质的定量分析。
这种方法操作简便，快速灵敏，适用于实时监测和在线检测。
综上所述，蛋白质检测方法多种多样，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际应用中，可以根据需要选择合适的方法进行蛋白质检测，以满足不同研究和应用的需求。
希望本文介绍的蛋白质检测方法对读者有所帮助。
简述几种测定蛋白质方法及原理蛋白质是生物体内最重要的分子之一，其功能多种多样，涉及到生命的方方面面。
了解蛋白质的性质、结构和功能非常重要。
为了实现这一目标，科学家们开发了多种方法来测定蛋白质的存在和浓度，以及研究其结构和功能。
在本文中，我们将简要介绍几种常见的测定蛋白质方法及其原理。
一、低丰度蛋白质检测方法在复杂样品中，许多蛋白质的浓度很低，因此需要采用高灵敏度的方法进行检测。
以下是两种常见的低丰度蛋白质检测方法。
1. Western blotting方法Western blotting方法是一种常用的蛋白质检测方法，通过将蛋白质转移到固体支持体上，然后使用特异性抗体来探测目标蛋白质的存在。
这个方法的原理是在电泳分离后，将蛋白质转移到聚丙烯腈膜或硝酸纤维素膜上。
样品经过特异性抗体结合，最后通过酶标记二抗或荧光二抗来使目标蛋白质可见。
2. 质谱法质谱法是一种利用质谱仪测定蛋白质质量的方法。
这种方法的原理是将蛋白质分解成肽段，然后通过质谱仪测定这些肽段的物质质量。
质谱法可以提供非常准确和高灵敏度的蛋白质测定结果，适用于分析复杂样本中的低丰度蛋白质。
二、蛋白质浓度测定方法蛋白质的浓度是研究蛋白质的基础，因此准确测定蛋白质浓度非常重要。
以下是两种常见的蛋白质浓度测定方法。
1. 比色法比色法是一种通过测量某种化学试剂与蛋白质之间的化学反应来测定蛋白质浓度的方法。
布拉德福德比色法使用染料染色蛋白质产生吸光度，再根据标准曲线定量测定蛋白质浓度。
这种方法简单、快速且灵敏度较高，适用于大多数蛋白质样品。
2. BCA法BCA法是一种利用受体配合反应来测定蛋白质浓度的方法。
在这种方法中，受体配体（biotin-avidin 或biotin-streptavidin）与蛋白质中的特定残基（如组氨酸等）结合生成复合物，然后通过比色反应测定复合物的吸光度。
BCA法具有高灵敏度和较低的非特异性反应。
三、蛋白质结构分析方法蛋白质的结构直接影响其功能和性质，因此了解蛋白质的结构是非常重要的。
蛋白质的测定方法
蛋白质的测定方法有多种，以下是其中几种常见的方法：
1. 比色法：常用的比色法是利用布拉德福试剂（Bradford reagent）或伯胺蓝法（Coomassie Brilliant Blue G-250），将蛋白质与染色剂结合后，根据染色的吸光度与蛋白质浓度的关系进行测定。
2. 琼脂糖凝胶电泳：根据蛋白质的电荷、分子量、形状等特性，通过琼脂糖凝胶电泳，将蛋白质分离开来，然后根据分离出的蛋白质特定区域的强度或与已知浓度的标准品进行比较，确定蛋白质的浓度。
3. BCA法：BCA（bicinchoninic acid）法利用蛋白质与BCA试剂反应，生成可发生紫外吸收的络合物，通过测量光吸光度，与已知浓度的标准品比较，确定蛋白质的浓度。
4. Lowry法：Lowry法结合了蛋白质的碱性和芳香性氨基酸的特性，通过在碱性条件下与酸性重铜盐和费林试剂反应，生成光吸光度可测的复合物，根据复合物的光吸光度与标准品对比，确定蛋白质的浓度。
5. 生物素标记法：使用生物素标记的抗体或受体结合蛋白质，然后用生物素酶标记的探针或底物测定，通过测量反应产物的发光强度或颜色变化来确定蛋白质浓度。
需要注意的是，不同的测定方法对样品的适用性、灵敏度、特异性等方面有所差异，选择适合的方法需要根据实验目的和样品的特点来决定。
蛋白质的测定方法有哪些蛋白质测定是一个重要的生物化学实验，用于确定样品中蛋白质的含量和纯度。
目前常用的蛋白质测定方法主要有生物化学方法、光谱法、免疫学方法和质谱法等。
下面将详细介绍这些方法。
1. 生物化学方法：生物化学方法是一种常用的蛋白质测定方法，主要包括低里氏法、比色法和滴定法等。
低里氏法基于酵素反应测定蛋白质含量，其中最常用的是双维小麦胚芽过氧化物酶法。
比色法是通过染色剂和蛋白质的反应来测定蛋白质浓度，常用的比色剂有考马斯亮蓝G-250和布拉德福棕色R-250等。
滴定法是通过滴加蛋白质溶液的滴定剂，如硝酸银溶液和碘溶液等，来测定蛋白质的含量。
2. 光谱法：光谱法是利用蛋白质在特定波长下吸收光线的特性来测定蛋白质的含量和纯度。
UV-Vis吸收光谱法是最常用的光谱法之一，根据蛋白质在280 nm处吸收的特性来测定蛋白质浓度。
近红外光谱法也可以用于蛋白质浓度的测定，因为蛋白质的结构可以在近红外区域引起光的散射和吸收。
3. 免疫学方法：免疫学方法是利用抗体与特定蛋白质发生特异性反应来测定蛋白质的含量和纯度。
常用的免疫学方法包括酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫印迹法（Western blotting）和免疫沉淀法等。
ELISA是一种高灵敏度的蛋白质测定方法，通过抗原与特异性抗体在单克隆板上的特异性结合来测定蛋白质的含量。
Western blotting是一种常用于检测特定蛋白质的方法，通过电泳分离蛋白质，然后用特异性抗体检测目标蛋白质。
免疫沉淀法利用特异性抗体与目标蛋白质结合，然后通过共沉淀或差速离心的方式将目标蛋白质从混合物中分离出来。
4. 质谱法：质谱法是一种高分辨率的蛋白质测定方法，主要有质谱光查法（MS）和质谱对比法（MS/MS）两种。
质谱光查法通过蛋白质在质谱仪中的分子离子质量和电荷比来确定蛋白质的分子量和浓度。
质谱对比法则是将待测蛋白质与已知质量的蛋白质进行比较，从而确定样品中蛋白质的含量和纯度。
一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：NH2 CH2 COOH+3H2 场―2CO2+3SO2+4H2O+NH3（1）2NH3+H2 SO4（NH4）2 SO4（2）（NH4）2 SO4+2NaOH2H2 O+Na2 SO4+2NH3（3反应⑴、（2）在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4乍催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。
二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCON是3两个分子脲经180C左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1-10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材1.试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
列举几种常用的蛋白质定量测定的方法常用的蛋白质定量测定方法如下：
1. Bradford法
Bradford法是一种基于蛋白质与染料之间的化学反应进行测定的方法。
该方法操作简单，灵敏度高，可用于各种类型的蛋白质含量测定。
2. BCA法
BCA法是一种基于铜离子与蛋白质产生化学反应，从而生成紫色物质
的方法。
该方法适用于各种类型的蛋白质测定，具有灵敏度高、稳定
性好等特点。
3. Lowry法
Lowry法是一种基于蛋白质与染料之间的氧化还原反应进行测定的方法。
该方法操作简单，灵敏度高、稳定性好，适用于不同类型的蛋白
质含量测定。
4. UV吸光度法
UV吸光度法是一种基于蛋白质带有吸收紫外线的物理性质进行测定的
方法。
该方法操作简单、快速，并且适用于大多数类型的蛋白质测定。
5. 酰荧光素改良法
酰荧光素改良法是一种基于蛋白质分解后产生的荧光物质进行测定的
方法。
该方法灵敏度高、稳定性好，且能够测定低浓度的蛋白质。
以上是常用的蛋白质定量测定方法，不同的方法适用于不同类型的蛋
白质及其含量测定。
选择合适的方法能够提高测定的灵敏度和准确性，为后续的研究提供可靠的数据。
蛋白质定量的方法蛋白质是构成生物体的重要组成部分，对于理解生物体的结构和功能具有重要意义。
因此，准确测定蛋白质的含量是许多生物科学领域研究的基础。
目前，人们已经发展出了多种方法来定量蛋白质的含量。
本文将介绍几种常用的蛋白质定量方法及其原理、优缺点和应用范围。
1. 高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography, HPLC）HPLC是一种常用的蛋白质分离和定量方法。
它利用样品中蛋白质与流动相在分离柱中的相互作用来实现分离和定量。
HPLC方法的优点是分离效果好、重复性好、能够同时检测多个样品。
但是，该方法需要相对较高的设备要求和操作技巧，对样品预处理也较为复杂，且比较耗时。
2. 比色法比色法是一种常用的定量蛋白质的方法。
其中，低里氏试剂法和双硫键试剂法是比较常用的比色法。
低里氏试剂法是通过蛋白质与龙氏试剂（碱性铜硫脲）之间的比色反应来定量蛋白质含量。
双硫键试剂法则是通过蛋白质与2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）之间的比色反应来定量蛋白质含量。
比色法具有操作简单、设备要求低等优点，但是对于不同类型的蛋白质，比色反应的敏感度和选择性可能不同。
3. 显微波特光度法（Bradford法）Bradford法是一种常用的蛋白质定量方法，基于酒红素（Coomassie BrilliantBlue G-250）与蛋白质之间的相互作用产生的颜色变化。
蛋白质与酒红素结合后，溶液的吸收光谱发生变化，可测量溶液的吸光度来定量蛋白质含量。
该方法操作简单快捷，而且灵敏度较高，适用于常规蛋白质定量。
4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳法（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE）SDS-PAGE是一种常用的蛋白质定量方法，可以通过电泳分离蛋白质并定量。
该方法通过将样品中的蛋白质在电场中进行分离，然后通过比色或者近红外成像等方法来定量。
测定蛋白质的方法蛋白质是生物体内重要的有机大分子，对维持生命活动起着重要的作用。
因此，测定蛋白质的含量和性质对于生物学、医学和食品科学等领域具有重要意义。
下面将介绍几种常用的测定蛋白质的方法。
一、紫外吸收法。
紫外吸收法是一种常用的测定蛋白质含量的方法。
蛋白质在紫外光下有较强的吸收作用，因此可以通过测定蛋白质在特定波长下的吸光度来确定其含量。
这种方法操作简便，结果准确，广泛应用于蛋白质含量的测定。
二、比色法。
比色法是通过蛋白质与某些化学试剂发生反应后产生色素，再利用分光光度计测定其吸光度来测定蛋白质含量的方法。
常用的比色试剂有布拉德福试剂、洛文斯试剂等。
比色法对于含有多种物质的样品也能准确地测定蛋白质的含量。
三、氨基酸分析法。
氨基酸分析法是通过水解蛋白质得到氨基酸，再利用色谱等方法对氨基酸进行分析，从而测定蛋白质含量的方法。
这种方法能够准确地测定不同氨基酸的含量，对于分析蛋白质的组成和结构具有重要意义。
四、免疫学方法。
免疫学方法是利用抗体与特定蛋白质结合的原理来测定蛋白质含量的方法。
常用的免疫学方法有酶联免疫吸附实验（ELISA）和免疫印迹等。
这种方法对于特定蛋白质的测定具有高度的特异性和灵敏度。
五、质谱法。
质谱法是利用质谱仪对蛋白质进行分析，从而测定蛋白质的含量和结构的方法。
这种方法能够准确地确定蛋白质的分子量、氨基酸序列和翻译后修饰等信息，对于蛋白质的深入研究具有重要意义。
总结。
以上介绍了几种常用的测定蛋白质的方法，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际应用中，可以根据需要选择合适的方法来测定蛋白质的含量和性质，从而更好地开展相关研究和应用。
希望本文能对您有所帮助。
蛋白质含量的测定方法及原理一、紫外吸收法。
紫外吸收法是一种常用的蛋白质含量测定方法，其原理是根据蛋白质在280nm波长处的特征吸收峰来进行测定。
在实验中，首先将待测样品溶解于适量的缓冲液中，然后使用紫外可见分光光度计测定样品在280nm处的吸光值，通过标准曲线的对照，可以计算出样品中蛋白质的含量。
二、比色法。
比色法是另一种常用的蛋白质含量测定方法，其原理是利用蛋白质与某些特定试剂发生化学反应后产生显色物质，通过测定显色物质的吸光值来计算样品中蛋白质的含量。
常用的试剂包括布拉德福试剂、伯杰试剂等，不同试剂适用于不同类型的蛋白质测定。
三、BCA法。
BCA法是一种基于铜离子与蛋白质中的蛋白质酰基发生还原反应的测定方法。
其原理是将待测样品与BCA试剂混合后在60℃条件下反应，然后使用分光光度计测定产生的显色物质的吸光值，通过标准曲线计算出样品中蛋白质的含量。
四、Lowry法。
Lowry法是一种以菁蓝G与蛋白质发生化学反应产生显色物质的测定方法。
其原理是将待测样品与碱液、菁蓝G和还原剂混合后在室温下反应，然后使用分光光度计测定产生的显色物质的吸光值，通过标准曲线计算出样品中蛋白质的含量。
五、总蛋白法。
总蛋白法是一种直接测定样品中总蛋白含量的方法，其原理是将待测样品与总蛋白试剂混合后在室温下反应，然后使用分光光度计测定产生的显色物质的吸光值，通过标准曲线计算出样品中蛋白质的含量。
总结，蛋白质含量的测定方法及原理有多种，每种方法都有其适用的样品类型和测定条件，研究人员可以根据自己的实验需要选择合适的方法进行蛋白质含量的测定工作。
希望本文所介绍的内容能为相关领域的研究工作提供一定的参考价值。
1、凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
2、双缩脲法双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。
双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。
当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。
可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。
鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。
鉴定反应蛋白质单位1-10mg。
3、酚试剂法取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm 波长处测定各管中溶液的吸光度值。
4、紫外吸收法大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL 含量的蛋白质溶液。
取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。
5、考马斯亮蓝法考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。
当考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从465nm 变为595nm。
在考马斯亮蓝G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝G-250 从吸收峰为465nm 的形式转变成吸收峰为595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。
I. 紫外分光光度法测定蛋白质的含量一、实验目的掌握紫外分光光度法测定蛋白质的含量的方法。
二、实验原理蛋白质分子中存在含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，使蛋白质对280nm的光波具有最大吸收值，在一定的范围内，蛋白质溶液的吸光值与其浓度成正比，可作定量测定。
该法操作简单、快捷，并且测定的样品可以回收，低浓度盐类不干扰测定，故在蛋白质和酶的生化制备中广泛被采用。
但此方法存在以下缺点：1．当待测的蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基含量差别较大是会产生一定的误差，故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的样品。
2．若样品中含有其他在280nm吸收的物质如核酸等化合物，就会出现较大的干扰。
但核酸的吸收高峰在260nm，因此分别测定280nm和260nm两处的光吸收值，通过计算可以适当的消除核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。
但因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，虽经校正，测定结果还存在着一定的误差。
三、实验器材1．紫外分光光度计2．移液管3．试管及试管架4．石英比色皿四、材料与试剂1．标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮校正的牛血清清蛋白，配制成浓度为1mg/mL的溶液。
2．待测蛋白溶液：酪蛋白稀释溶液，使其浓度在标准曲线范围内。
五、操作方法1．标准曲线的制作按表1加入试剂。
表1 标准曲线的制作度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出血清蛋白的标准曲线。
2．未知样品的测定取待测蛋白质溶液1mL，加入3mL蒸馏水，在280nm下测定其吸光度值。
并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。
II. Bradford法测定蛋白质的含量一、实验目的学习考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质的原理和方法。
二、实验原理1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的原理，迅速而准确的定量蛋白质的方法。
染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收光的改变，从465nm变为595nm。
蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1μg）。
染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。
一些阳离子（如K+，Na+，Mg2+），（NH4）2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX-100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。
由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛用于蛋白质含量的测定。
三、实验器材1．天平2．分光光度计3．试管及试管架4．比色皿5．移液管四、材料与试剂1．考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%（W/V）磷酸，将溶液用水稀释到1000mL。
[试剂的终含量为：0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%（W/V）乙醇，和8.5%（W/V）磷酸]。
2．标准蛋白质溶液：可用牛血清白蛋白预先经凯氏定氮法测定蛋白含氮量，根据其纯度配制成0.1mg/mL的溶液。
3．未知样品液。
五、操作方法1．牛血清蛋白标准曲线的制作取6支试管，编号为1、2、3、4、5、6，按表2加入试剂。
表2 牛血清蛋白标准曲线的制作坐标，蛋白浓度为横坐标作图，得到标准曲线。
2．未知样品中蛋白质的测定取未知浓度的蛋白液（通过适当稀释，使其浓度控制在0.015-0.1mg/mL 范围内）加到1mL 试管内，再加入G-250染色液5mL 混匀，测其595nm 下的吸光度，对照标准曲线求出未知蛋白液的浓度。
六、思考题1．比较两种方法的测定结果, 分析紫外法和Bradford 法测定蛋白质含量的各自有哪些优点和缺点？2．为什么标准蛋白质必须用凯氏定氮法测定纯度？ 3．若样品中含有核酸杂质，紫外法测定时应如何排除干扰？III.总氮量的测定—微量凯氏定氮法一、 实验目的①学习和掌握凯氏定氮法的原理②掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括未知样品的消化、蒸馏、滴定几含氮量滴定。
二、 实验原理当被测定的天然含氮有机物与浓硫酸共热消化时，分解出氮、二氧化碳和水、其中氮，与硫酸化合成硫酸铵。
由于分解反应进行得很慢，故可加入硫酸铜和硫酸钾或硫酸钠，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点，氧化剂（过氧化氢）也能加速反应。
消化终止后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱话消化液，使硫酸氨分解放出氨；用水蒸气蒸馏发，将氨蒸入过量的标准无机酸溶液中，全部蒸完之后，用标准的盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，准确测定氨量，从而折算出蛋白质含量。
其化学反应原理如下。
1. 浓硫酸的作用①脱水使有机物碳化。
2H 2SO 4→2SO 2↑+2H 2O+O 2↑ C+O 2→CO 2↑ ②氧化。
2H 2+O 2→2H 2O ↑③浓硫酸在338℃以上分解产生氧气，能使有机物破坏，生成二氧化碳和水。
蛋白质−−→−浓硫酸R-CH （NH 2）COOH −−→−浓硫酸NH 3↑+CO 2↑+SO 2↑+H 2O ④2NH3+H 2SO 4（过量）→（NH 4）2SO4 2. 硫酸铜的作用2CuSO 4→Cu 2SO 4+SO 2↑+O 2↑ C+ O 2→CO 2↑ 2H 2+O 2→2H 2O ↑Cu 2SO 4+2H 2SO 4→2CuSO 4+SO ↑2+2H 2O3. 硫酸钾的作用K 2SO 4+2H 2SO 4→2KHSO 4，使沸点提高到400℃4.30%氢氧化钠的作用2（NH 4）2SO4+NaOH2NH 4OH+Na 2SO 4NH 4OH −−→−加热NH 3+H 2O 蒸馏出的NH 3用3%硼酸溶液吸收，用标准盐酸滴定，其指示剂为甲基红-溴甲酚绿混合指示剂，终点变色敏锐，其反应式为： 2NH 3+4H 3BO 3→（NH 4）2B 4O 7+5H 2O 2（NH 4）2B 4O 7+2HCl+5H 2O →2NH 4Cl+4H 3BO 3三、 实验器材①50ml 凯市烧瓶3个，小漏斗3个，铁丝筐1个。
②50ml 锥形瓶6个。
③算式滴定管。
④移液管：1ml 、5ml 、10ml 。
⑤100ml 容量瓶（3个）。
⑥10ml 量筒。
⑦表面皿。
⑧凯氏定氮蒸馏装置。
四、材料与试剂 ①浓硫酸（化学纯） ②30%氢氧化钠溶液。
③3%硼酸溶液。
④0.01mol/L 标准盐酸溶液。
⑤混合指示：取0.2%甲基红的乙醇（95%）溶液1份和0.2%溴甲酚绿的乙醇（95%）溶液5份混合。
⑥硼酸指示剂混合液：5ml 的3%硼酸溶液加入1-2滴混合指示剂。
⑦硫酸钾-硫酸铜粉末混合物（K 2SO 4:CuSO 4•5H 2O=6:1）200mg 。
五、操作方法 1.消化准备3个50ml 的凯氏烧瓶并标号，向1，2号瓶中准确加入1ml10%奶粉溶液，注意将溶液（固体样品同样）加到烧瓶的底部，勿使其粘在瓶口及瓶颈。
于3号烧瓶中加入1ml 蒸馏水作为空白对照，用以测定试剂可能含有的微量含氮物质。
用小纸条向每个烧瓶中加入约200mg 硫酸钾硫酸铜混合物粉末，再加入化学纯浓硫酸5ml 。
将瓶口上放一小漏斗，再把凯氏烧瓶斜置铁筐内，在通风橱中用电炉加热消化。
消化开始以微火加热，首先看到烧瓶内物质碳化变黑，并产生大量泡沫。
此时要特别注意，不能让黑色物质上升到烧瓶颈部，否则将影响样品的测定结果。
当混合物不再发生泡沫时，升高温度，使瓶内液体微微沸腾。
假如在瓶颈上发现有黑色颗粒，应小心将烧瓶倾斜震荡，用消化液将颗粒冲下来；在消化中要时常转动烧瓶，使全部样品浸泡在硫酸内，以便在微沸的硫酸内不断消化。
消化至溶液呈蓝绿色透明时（大约2h），停止加热，使烧瓶自然冷却至室温。
用蒸馏水将消化液无损地转入50ml容量瓶中，稀释至刻度，混匀备用。
2.蒸馏（1）仪器的洗涤仪器使用前应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。
一般洗涤是用水洗净仪器，每次实验后要洗去氢氧化钠溶液，以防止样品加入时立即放氨。
使用前全部蒸馏装置必须用水蒸气充分洗涤，用水蒸气洗涤蒸馏器的目的在于洗去冷凝管中可能残留的氨。
对于处于使用状态的仪器（尤其是正在测定中的仪器）。
加样前使蒸气通过1-2min即可。
对于较长时间未使用的仪器，必须用水蒸气洗涤道吸收蒸气的硼酸指示剂混合液中指示剂颜色合格为止。
洗涤方法如下：取2-3个50ml3%硼酸指示剂混合液，用表面皿覆盖备用。
如图3-1所示，先煮沸蒸汽发生器1（蒸汽发生器中盛有硫酸酸化的蒸馏水，需放几块沸石或耐火砖以防爆沸），关闭夹子12，使蒸汽通过反应室5中的插管11进入反应室，再由冷凝器5min左右后，在冷凝器下口放一个盛有硼酸指示剂混合液的锥形瓶9，倾斜使冷凝器下口端完全浸没在液体内，继续蒸汽洗涤1-2min，观察锥形瓶内液体颜色是否改变，如无变化，证明蒸馏器内部已洗涤干净。
实际所用的指示剂极为灵敏的，因此很难保证不变色。
含有指示剂的硼酸溶液，正常呈棕红色，即使不接受氨蒸气，放在室内桌面上几分钟后，也可能会因为吸收了空气中的二氧化碳而变灰色或暗绿色。
在洗涤较长实际未使用的仪器，用硼酸指示剂混合液鉴定时，若1-2min后溶液未变成鲜绿色，而只变成灰色或暗绿色，即可认为是基本上未变色，仪器已经洗净。
向下移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约1cm，继续通蒸汽1min，最后用水冲洗冷凝管外口，移开火焰，打开夹子12，即可准备样品测定。
加样前反应室5内液体应尽量少，以免降低碱浓度而延长反应时间，使氨蒸馏得不完全。
（2）样品及空白蒸馏①加样：加样前先撤火（熟练后此步可省去，不撤火），并打开夹子12（这是本实验的关键，否则样品会被倒抽到反应室外）。
用移液管吸取5或10ml稀释消化液，放入小漏斗，打开夹子6，使之缓慢流入反应室5，然后将夹子夹紧。
取1只盛有硼酸指示剂混合液的锥形瓶，放在冷凝器下口，冷凝器下口必须浸没在硼酸液面之下。
目的是保证反应室的样品放出的氨全部被硼酸吸收。
用量筒向小漏斗中加入10ml30%氢氧化钠溶液，打开夹子6使之缓慢地流入反应室5，在碱液尚未完全流入时，将夹子6夹紧，向小漏斗中加入约5ml蒸馏水，再稍稍松开夹子，使一半蒸馏水流入反应室5，另一半留在漏斗中做水封。
②蒸馏：用电炉（或煤气灯）加热水蒸气发生器，沸腾后，加紧夹子12，开始蒸馏。
锥形瓶中硼酸指示剂混合液吸收了氨，由紫红色变为绿色，自变色时起，蒸馏3-5min，移动锥形瓶使硼酸液面离开冷凝管下口约1cm，并用少量蒸馏水洗涤冷凝管下口外面，继续蒸馏1min，拿开锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口，重复2次以上操作，做3个平行样，分别用标准盐酸滴定。
③排废液及洗涤：一次蒸馏结束后，为了排出反应后的废液，在小漏斗中放入蒸馏水，并加热水蒸气发生器，待蒸汽很足、气液分离温度很高时，反应室中液体沸腾，连续不断冒泡，这时，打开架子6，使冷水流入反应室5，同时，立即左手用劲捏橡皮管位置3，这时气液分离器4中的蒸汽比反应室5中的多，遇冷收缩较大，压力降低较快，结果反应室5中的废液通过反应室中的插管自动地被抽到气液分离器中，如此反复几次即可排尽反应废液及洗涤废液。
