维生素B12注射液含量测定 ppt课件

实验十六维生素B12注射液的定性鉴别及定量分析一、实验目的1．掌握定性鉴别的方法和吸光系数法的定量方法；2．熟悉紫外分光光度计的操作方法；3．了解含量测定、标示量的百分含量及稀释度等计算方法。

二、实验原理维生素B12是一类含钴的卟啉类化合物，具有很强的生理作用，可用于治疗恶性贫血等疾病。

维生素B12不是单一的一种化合物，共有七种。

通常所说的维生素B12是指其中的氰钴素，为深红色吸湿性结晶，制成注射液其标示含量有每毫升含维生素B1250、100或500μg等规格。

维生素B12的水溶液在278n m±1nm、361nm±1nm与550nm±1nm三波长处有最大吸收。

药典规定，在361nm波长处的吸光度与278nm波长处的吸光度的比值应为1.70～1.88。

361nm波长处的吸光度与550nm波长处的吸光度比值在3.15～3.45范围内，这为定性鉴别E值（207）为测定注射液的依据。

药典规定，以361nm±1nm处吸收峰的百分吸光系数%11cm实际含量的依据。

三、实验仪器及试剂1．仪器紫外－可见分光光度计、石英吸收池、容量瓶、吸量管。

2．试样维生素B12注射液。

四、实验内容与步骤1．试样溶液制备精密吸取维生素B12注射液样品（100μg/mL）3.0mL，置于10mL量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，得试样溶液。

2．测定将试样稀释液装入1cm石英吸收池中，以蒸馏水为空白，在278nm、361nm波长处与550nm 波长处分别测定吸光度。

五、数据处理1．定性鉴别根据测得的278nm、361nm与550nm波长处的吸光度数据，计算该两两波长处的吸光度比值，并与药典规定的幅度值比较，进行维生素B 12的鉴别。

2．吸光系数法将361nm 波长处测得的吸光度A 值与48.21相乘，即得试样稀释液中每毫升含维生素B 12的微克数。

按照百分吸光系数的定义，每100mL 含1g 维生素B 12的溶液（1％）在361nm 处的吸光度应为207。

《维生素B12注射液含量测定》项目教学设计方案《维生素B12注射液含量测定》项目教学案例：维生素B12注射液含量测定一项目任务：维生素B12注射液含量测定1 适用专业：中专药剂、检验专业2 适用岗位： QC人员3 学习时间：2课时二教学设计的指导思想在基础化学相关章节的学习中，学生已掌握了溶液的浓度及其计算、紫外-可见分光光度法、注射液含量计算等理论知识，具备了一定的实验操作技能，掌握了配制一定浓度的溶液、使用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸收值等实验方法。

但是他们对化学知识在职业岗位中的意义及应用方法缺乏正确的认识。

我们选择该课题作为载体，通过项目教学法，培养学生将知识和技能与实际工作联系起来的思维习惯，以提高他们综合运用化学知识与技能完成实际工作的能力。

采用以具体工作任务引领的项目教学,以职场实际操作为依据,满足相应职业资格要求，使学生在校期间就能掌握今后检验工作的方法、程序及要领，毕业后到企业工作能尽快进入岗位角色。

三项目教学目标：根据学以致用的现代化学教育理念，职业教育以能力为本位、促进学生综合职业能力和发展能力的形成的改革方向，结合一线技能型人才的培养目标以及本课程的特点和优势，特制订以下目标。

1.知识与技能目标：1）学会查阅所需检验药品的质量标准；2）按照操作规程准确地配制一定浓度的溶液；3）能够熟练地使用紫外-可见分光光度计测定物质溶液的浓度并进行含量测定的结果计算；2.过程与方法目标：1）注重对学生专业实作技能的培养，培养学生严谨、规范的操作；2）能运用理论知识解释操作过程；3）使学生掌握工作思路与方法，培养学生观察、动手、发现和解决问题的能力以及独立与协作工作的能力；3.情感与价值观目标：1)学会自觉地以医药行业标准规范自己的工作行为；2)培养学生认真负责的工作态度，科学、严谨的的工作作风，树立质量第一的原则；四教学重点和难点项目教学中以项目贯穿整个教学过程，因此项目是整个教学过程的主线，是能力形成的载体，是学生实践活动的对象，学生通过项目获得知识，提高技能，因此项目的选取与确定是关键。

《生物产品的分析与检验》维生素的分析与检验-----维生素Ｂ12含量的测定目 录1. 认识维生素2. 维生素B12对人体的意义3. 维生素B12的性质4. 维生素B12测定方法一、认识维生素维生素是维持人体正常生理机能所必需的生物活性物质。

维生素广泛存在于动、植物和微生物体内。

维生素类物质的分类（按其溶解性质分）脂溶性维生素：主要有A、D、E、K等水溶性维生素：主要有B族（B1、B2、B12等）、维生素C、烟酸、叶酸、泛酸等。

维生素测定方法主要有化学分析法、比色法、分光光度法（紫外和荧光）、层析法、色谱法（气相色谱和高效液相色谱）和微生物法等。

二、维生素B12对人体的意义维生素B 12的主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血，防止大脑神经受到破坏。

自然界中的维生素B 12都是微生物合成的，高等动植物不能制造维生素B12 维生素B 12是需要一种肠道分泌物（内源因子）帮助才能被吸收的惟一的一种维生素。

当人体肠胃异常，缺乏这种内源因子，即使膳食中来源充足也会患恶性贫血。

植物性食物中基本上没有维生素B 12。

三、维生素B12的性质维生素B 12(vitamin B12)，又称钴胺素，是含钴的B族维生素之一;在pH小于3或大于8的强酸或碱性溶液中极易分解，遇强光或紫外线易被破坏。

维生素B 12在紫外区波长处有最大吸收。

在361nm波长处的吸收峰干扰因素少，通常以361nm作为测定波长。

三、维生素B12含量测定方法◆测定维生素B12的方法有微生物法、比色法、紫外分光光度法、离子交换层析法、原子吸收分光光度法和高效液相色谱法。

紫外分光光度法是较常见的方法。

◆以维生素B12注射液中B12含量的测定为例介绍紫外分光光度法测定维生素Ｂ12含量的方法。

测定方法一、紫外分光光度法测定维生素Ｂ12含量（一）测定原理在紫外区278nm（纳米）、361nm与550nm波维生素B长处有最大吸收。

在361nm波长处的吸收峰干扰因素少，通常以361nm作为测定波长，测定待测溶液的吸光度，用吸光度计算含量。

紫外吸收光度法鉴别和测定维生素B12 注射液
【实验内容】
1. 对照品溶液和样品溶液的配制
准确称取维生素B12 对照品适量，加水溶解稀释成25μg/mL 的溶液。

精密吸取维生素B12 注射液0.5 ml 于10 ml 容量瓶中，用水稀释至刻度摇匀，得到待测
样品溶液（按标示含量稀释成25μg/ml 的溶液）。

2. 吸收光谱的绘制与注射液的鉴别
取对照品溶液进行光谱扫描（250 ~ 600 nm），得到维生素B12 的吸收曲线，寻找吸收峰，
扫描后可得到在278nm，361 nm 和550 nm 波长处出现的3 个吸收峰，然后在以上3 个吸
收峰处测量维生素B12 注射液的吸光度，并计算A361/A278 和A361/A550 的比值。

3. 维生素B12 的定量测定
根据吸收曲线选择最大吸收波长（在361 nm 或附近）作为测量波长，测量维生素B12
【注意事项】
1. 注意石英比色皿的操作使用；
峰位置波长略有差异。

这是因为不同的仪器由于其性能的差异，导致吸光度和波长等参数不同，因此必须对仪器进行定期的校正。

3．比较用吸光系数和校正曲线定量方法，你认为哪种方法好？为什么？
吸光系数法可根据测量得到的吸光度直接计算浓度，简便易行，但仪器性能差异会导致结果误差较大，因此必须对仪器的吸光度和波长进行校正后方能采用此法，且浓度要在复合Beer定律的线性范围内。

校正曲线法是配制一系列标准溶液作为基础进行测量，即使有偏离Beer定律线性关系，也可以应用于测定。

因为是在相同条件下测量，有标准溶液的校正，可抵消仪器性能、操作等所带来的系统误差，与前一种方法相比，虽然操作步骤要繁琐些，但准确、可靠，是测定最常用的方法。

实验四维生素B12含量的测定目的要求1、掌握紫外分光光度计的原理和使用方法。

2、熟悉吸光系数法定量分析方法的应用。

重点1、比吸光系数的概念和定量测定方法。

2、比吸光系数与摩尔吸光系数的关系。

难点比吸光系数的定义与定量测定方法及应用。

仪器设备紫外分光光度计、石英比色皿、容量瓶、移液管、纸镜头等。

内容提要1、维生素B12标准溶液的配制（或用标准品）。

3、购置维生素B12注射液或片剂等样品。

4、1%浓度标准品维生素吸光度的测定（1cm比色皿）。

5、1%浓度样品维生素吸光度的测定。

6、分别求得样品和标准品的比吸光系数。

7、将样品的比吸光系数与标准品的比吸光系数值比较，计算出样品的质量百分数。

操作要点1、仪器的准备（校准、预热）2、仪器的操作步骤（讲解示范）。

3、设置波长(361nm)、调零、调满度。

4、测定。

5、数据记录与结果处理。

6、将比色皿洗净装盒，关机。

7、填写仪器使用记录和实验周志。

注意事项1、开启电源，使仪器预热20分钟。

2、开机前，先确认仪器样品室内是否有东西档在光路上（以免影响仪器自检）。

3、若无标准品可采用文献的吸收系数，但不一定可靠，因测定条件不同。

思考题1、本实验是否可用玻璃比色皿？在紫外分光光度计上，还有其它方法能测其含量吗？2、维生素B12在361nm和550nm波长处与最大吸收，其在361nm的吸光度与550nm处的吸光度的比值为3.15-3.45（中国药典），如果要对维生素B12进行定性鉴别，如何操作？3、《中国药典》规定，维生素B12注射液的正常含量应为表示量的90.0%-110%，根据本实验结果判断是否符合要求？并分析误差产生的原因？。

实验四 紫外分光光度法测定维生素B12注射液的含量一、实验目的1、理解紫外—可见分光光度法定性分析、定星分析的原理。

2、掌握紫外—可见分光光度法测定维生素B12含量的原理。

3、掌握UV—7502PC紫外—可见分光光度计的结构、原理与操作。

二、原理分子中的电子发生跃迁需要的能量约在1~20eV之间，其对应的吸收光的波长范围大部分处于紫外和可见光区域，通常将分子在这一区域的吸收光谱称为电子光谱或紫外—可见吸收光谱。

物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。

由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。

分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。

紫外可见分光光度法的定量分析基础是朗伯－比尔（Lambert-Beer）定律，即物质在一定浓度的吸光度与它的吸收介质的厚度呈正比。

在紫外可见光的范围内，对于一个特定的波长，吸收的程度正比于试样中该成分的浓度，因此测量光谱可以进行定性分析，而且根据吸收与已知浓度的标样的比较，还能进行定量分析。

1. 紫外-可见分光光度计的基本结构紫外-可见分光光度计由光源、单色器、吸收池、检测器以及数据处理及记录系统组成。

图1 紫外—可见分光光度计基本结构图2.透光率和吸光度如图2所示：入射光强度I0，吸收光强度I a，透过光强度I t， 反射光强度为I r I0═ I a + I t + I r被测溶液和参比的吸收池同样材料和厚度，反射光强度影响相互抵消，上式简化为I0═ I a + I t透光率愈大，溶液对光的吸收愈少；反之，透光率愈小，溶液对光的吸收愈多透光率的负对数称为吸光度，用符号A 表示。

新乡医学院分析化学实验课教案首页欧阳引擎（2021.01.01）授课教师姓名及职称：八、授课方法教师示范讲述，学生操作九、使用教材《分析化学实验》自编教材十、教研室主任签字审查意见新乡医学院化学教研室年月日实验维生素B12的吸收曲线绘制及注射液的含量测定一、实验目的1.掌握分光光度计的使用方法；2.掌握注射剂含量的测定和计算方法；3.熟悉测绘吸收曲线的一般方法。

二、实验原理维生素B12是含Co的有机化合物，其注射液为粉红色至红色的澄明液体。

要测定B12注射液的含量，可以用紫外－可见分光光度法测定，用此法进行含量测定，必须知道B12的λmax，λmax可以通过绘制吸收曲线来得到。

吸收曲线：将不同波长的单色光依次通过被分析的物质，分别测得不同波长下的吸光度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标所描绘的曲线。

吸光度最大时对应的波长为λmax，在λmax处测吸光度。

B12在278，361，550nm处有最大吸收，在λmax处测得A，根据吸光系数法可以求出注射液中B12的含量。

吸光系数法：A=Ecl实验中要求测361nm处的A，相应的吸光系数为207。

三、仪器与试剂752型紫外－可见分光光度计，10mL容量瓶，5mL吸量管；0.1g·L-1维生素B12水溶液，维生素B12注射液(市售品)。

四、实验步骤1．752型分光光度计的使用（1）开启电源开关，使仪器预热20分钟。

（2）用波长选择旋钮设置所需的分析波长。

（3）将装参比溶液的比色皿置于光路，打开样品室盖，调节T旋钮，使显示器指针指在“0.00％”。

（4）将装参比溶液的比色皿置于光路，关闭样品室盖，调节A旋钮，使显示器指针指在“100.00％”。

（5) 重复操作(3)和(4)，直至仪器显示稳定。

（6）将装参比溶液的比色皿置于光路，关闭样品室盖，进行测定，在显示器上读出A。

（7）仪器使用完毕，关闭电源，拔下电源插头。

取出比色皿，洗净、晾干。

复原仪器，盖上防尘罩。