流式细胞术检测细胞凋亡Q&A

流式细胞仪检测细胞凋亡:PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。

这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。

研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。

许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。

2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。

在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。

在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。

此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。

细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。

但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。

因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。

根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。

也可用于活细胞的分类。

试剂与仪器PBS溶液；PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。

用棕色瓶4℃避光保存。

70%乙醇400目筛网流式细胞仪实验步骤1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。

2. 3ml PBS洗涤1次。

3. 离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。

流式细胞仪检测凋亡细胞凋亡的检测方法众多，流式细胞仪检测凋亡，是常用的方法。

由于流式细胞仪固有的特点――可以准确的进行凋亡细胞的计数。

因此，具有其它方法无可比拟的优越性。

本文主要结合我室的一些实际经验，力图简单明了的介绍流式在检测凋亡方面的应用。

下面是一幅凋亡过程图。

在凋亡诱导剂的作用下，首先是细胞色素C和apa f－1形成复合体，线粒体的功能发生衰退；后是caspase家族激活，磷脂酰丝氨酸外翻，这时细胞的形态已经发生了改变，可以看到细胞变小，胞核皱缩；最后是细胞内DNA断裂，形成凋亡小体。

在凋亡发生的各个过程当中，都有相应的流式细胞仪的检测方法，我室曾经检测过的方法包括：1线粒体功能2DNA Cycle3 Caspases4Annexin V Assay6DNA Fragmentation Assays基本上涵盖了细胞凋亡的各个期，对各种检测方法的原理和特点做一个简单介绍。

线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒（产品编号为BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert试剂盒。

其检测主要采用阳离子型荧光染料。

原理是：正常细胞中，染料可以在线粒体内聚集，发出明亮的红色荧光；而细胞凋亡后，其线粒体膜电位发生改变，染料无法进入线粒体，只能在胞质中以单体形式存在，发出绿色的荧光。

可以在荧光显微镜下，或流式检测。

采用488nm激发，其检测波长分别是527nm和590nm。

整个实验过程操作简单，只需要30min就可以见到结果。

Caspase家族可以检测的分子非常多，也有不少商业的试剂盒可以应用。

即使没有相应的试剂盒，只要有相应抗体基本上是可以检测的，具体的方法是参照细胞内蛋白检测的步骤。

在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。

在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。

Annexin－V是一种35－36 KD的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白，它对PS具有较高的亲和力。

细胞凋亡检测
凋亡与疾病
细胞凋亡与疾病的关系—— 该“死”的细胞不死，不该 “死”的细胞却死了，也就是说无论凋亡过度或凋亡不足 都可以导致疾病的发生。
• 细胞凋亡不足：肿瘤，自身免疫病 • 细胞凋亡过度：心肌缺血，心力衰竭，神经元
退行性疾病，病毒感染
• 不足与过度并存：动脉粥样硬化
细胞凋亡过程
在凋亡诱导因素的作用下 线粒体的膜电位改变 磷脂酰丝氨酸外翻 caspase家族激活 DNA断裂 形成凋亡小体
结果分析
DNA片断化检测
• 通过PI染色，分析亚二倍体峰（凋亡峰），方法同 “DNA倍体分析和细胞周期分析”
经典TUNEL法原理
TUNEL法
• 流式也能进行TUNEl检测， 其检测原理与经典TUNEl原 理基本一致。利用TdT能将 荧光素标记的dUTP标记到断 裂的DNA末端，从而使凋亡 的细胞具有荧光。
• 细胞状态要好； • 细胞处理的火候问题：药物浓度、时间需要摸索； • 染色后，不能固定细胞，应尽快检测。
线粒体膜势能的检测
【原理】 • 线粒体跨膜电位的下降，是细胞凋亡级联反应过程中最早发
生的事件，一旦线粒体膜电位崩溃，细胞凋亡则不可逆转。 • 线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结
– 促凋亡分子: Bax, Bcl-Xs, Bak, Bad, Bid 等 – 抑凋亡分子: Bcl-2, Bcl-XL和bcr/abl kinase等 8. 相关信号通路分子的检测（可用FCM）
磷脂酰丝氨酸外翻分析(ANNEXIN V标记法)
【原理】
1. 细胞凋亡的早期，磷 脂酰丝氨酸（PS）外翻；
合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负 性的增高或降低。 • 常用染料有：Rhodamine 123 、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide [DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等

流式检测细胞周期和凋亡实验步骤流式细胞技术检测细胞周期分布1) 已转染miRNA mimics的细胞培养达到85％融合时，用胰酶消化细胞。

1000 rpm，离心5min，收集细胞沉淀；2) 已消毒的PBS重悬细胞，1000 rpm/min，离心5 min，收集细胞。

重复此步骤2次，以除去胰酶；3) 加入预冷的70%乙醇固定细胞过夜；4) 第二天1000rpm，离心5 min，收集细胞沉淀，PBS重悬两次，以除去乙醇；5) 离心后加入500ul PBS重悬细胞，加入碘化丙锭(PI)染色液(含50mg/L PI，1g/L Triton X-100，100g/L RNase)混匀，4℃避光孵育30min。

6）流式细胞仪FACStar (美国BD公司) 检测。

接收的信号经Cellquest软件处理，对检测细胞的荧光强度进行分析。

实验重复3次。

2.11流式细胞技术检测细胞凋亡水平1) 已转染BART6-3p mimics的细胞培养达到85％融合时，将上清培养液收集至离心管内；常常2）PBS清洗贴壁细胞3次，用胰酶消化细胞（注意：消化时不可过度），收集于第一步的离心管内；3) 1000 rpm离心5min，弃上清收集细胞，PBS轻轻重悬后，加入195 ulAnnexin V-FITC结合液，吹打混匀，重悬细胞，加入5ul Annexin V，轻轻混匀。

避光室温孵育15min；4) 加入10 ul PI染色液，轻轻混匀，避光孵育；空白：Annexin V—FITC结合液200ul双染：185ul结合液+5 ulAnnexin V—FITC+10ul PI单染：195ul结合液+5ul Annexin V—FITC190ul结合液+10PI5) 进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

该法简单、快速，但不适于常规多功能流式细胞仪 (不具备紫外光源)的检测。 主要有Caspases-3流式细胞检测试剂盒，Caspases-
2/ Caspases-4/Caspases-6/Caspases-7/Caspases-9等抗
体
2.6 DNA 碎片分析：Apo-BrdU
核酸内切酶活化使核小体内DNA断裂为50~300kb片段，裂解为200bp
通透性和对称性均会改变。
解决方法： 形态学特征是区分凋亡和坏死的“金标准”。
3.3 样本制备过程中凋亡细胞的选择性丢失：
贴壁培养细胞的分离
凋亡早期，细胞即脱离培养瓶表面并悬浮在培养液中。因此去除培养液， 然后加胰酶或EDTA消化的方法不可避免的会失去很多凋亡细胞。 ---将培养液和消化下来的细胞合在一起 胰酶消化本身就倾向于破坏细胞膜已破损的晚期凋亡和坏死细胞，导致 丢失。
2 细胞凋亡的流式检测方法
利用流式仪测定细胞光散射可对凋亡细胞进行分析 凋亡早期细胞因体积减小，胞浆及染色质固缩，FSC变 小，SSC增大 凋亡晚期细胞FSC、SSC均变小 坏死细胞则因细胞膜通透性改变，细胞肿胀， FSC 、 SSC 变大，胞膜破裂，胞内含物释出后 FSC 、 SSC 均变 小。
此法简单、可靠，由于凋亡时 细胞膜的改变大大早于DNA 的 改变，因此Annexin V/PI(或7-
AAD )双染色是检测早期凋亡
细胞的敏感方法。 由于该法必须用活细胞，因此 检测时间受到限制，且对凋亡 晚期细胞和坏死细胞无法准确 区分。
2.3 细胞内钙离子测定
Fluo-3-Am为新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，进入细胞后
2.1 PI单染检测
与细胞周期相同，利用PI染色，通过检测DNA含量来 同时判定细胞周期和凋亡。 凋亡过程中，细胞内核酸酶释放，细胞DNA发生有序

流式检测细胞凋亡A n n e x i n V检测细胞凋亡 (2)实验原理 (2)实验用品 (2)操作步骤 (3)Annexin V Blocking (5)凋亡细胞的D N A断裂片段分析 (7)实验原理 (7)实验用品 (8)操作步骤 (9)B r d U F l o w K i t s检测细胞增殖 (12)实验原理 (12)BrdU Flow Kits 试剂盒 (12)结果分析 (17)流式仪器设置指南 (18)线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22)实验原理 (22)实验用品 (22)样本制备 (23)结果分析 (24)注意事项 (24)A c t i v e C a s p a s e-3检测细胞凋亡 (26)实验原理 (26)实验步骤 (27)结果分析 (28)A n n e x i n V检测细胞凋亡实验原理Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。

它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。

在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。

Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。

由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。

因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。

实验用品1. 一次性12⨯75mm Falcon试管。

2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8︒C保存。

3. 微量加样器和加样头。

4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10⨯，使用时，用稀释为1⨯浓度的应用液。

检测究竟是如何进行的呢？一、细胞凋亡检测的意义和方法正常细胞的周期时相 细胞凋亡和周期上图为流式测定细胞凋亡图，通过PI染色来测定细胞含量。

正常的细胞的周期为第一张图中所示的G1、G0期，S期、G2/M期，那么在G1、0期前面没有亚二倍体峰，也就是M1这个位置它的含量会很低。

这是一个正常细胞的周期时相，当这个细胞发生凋亡之后，在G1G0期的前面出现了一个亚二倍体峰，我们也把它叫做凋亡峰，M1这个位置细胞数百分率明显增多，相对其他的时相，G1G0、S期和G2/M期的含量就会相对减少。

（3）获取参数通过DNA含量分析所获取的、信息包括两个参数：凋亡细胞的百分率，和细胞周期当中其它时相的百分率。

（4）方法学评价DNA含量分析方法比较简便，而且经济，在临床上用的比较多，而且标本制备也比较容易，但是它有它的缺点：只有当凋亡细胞达到一定浓度的时候才能够检测出亡峰来。

所以在早期凋亡的时候采用DNA含量分析可能是不合适的，因为可能检测不出凋亡峰，含量太少。

所以比较适合的是中晚期凋亡的检测。

另外DNA含量分析也无法获取一些信息，也就是这个凋亡到底是S期还是G2/M期，有的时候无法反应这个情况。

2.Caspase-3活性的检测（1）原理检测原理主要是由于半胱氨酰基天冬氨酸蛋白酶家族，也叫做Caspases-3的家族有一种酶：是一个重要的凋亡指示蛋白，在凋亡发生的早期就可以被激活。

该酶的活性被激活之后，就在整个凋亡过程当中不断地升高，直到凋亡的晚期酶的活性才能够迅速下降。

因此，对Caspase-3酶的连续检测可以动态地观察凋亡的整个过程。

（2）检测试剂通常检测此酶的活性的试剂包括一个荧光底物，其中它的荧光基团被激活的Caspase-3切断后可以释放荧光物质，在380nm的紫外波长下发出450nm波长的荧光，这样就可以用流式细胞仪来检测。

我们通常通过对荧光强度的检测来测定出Caspase-3的活性并进行定量分析。

但是由于它是紫外激发的检测方式，因此对于没有紫外光的流式细胞仪是无法来获取Caspase-3的活性检测信息。

基本内容
、特异性和自动化程度，从而为细胞凋亡研究提供更加可靠的工具。
谢谢观看
解决方法：熟练掌握流式细胞仪数据分析的方法和技巧，理解细胞凋亡的生 物学过程。在数据分析中，应选择经验证的参数设置，并结合研究目的进行调整。 对于结果的解读，应结合凋亡相关文献和实验数据进行综合分析，避免主观偏见。
4、数据分析与解读
总结：使用PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡时，需要注意多个影响因素。这 些因素包括PI染料的浓度和作用时间、样本处理过程、流式细胞仪的操作和维护 以及数据分析与解读等。为了获得准确的实验结果，需要对这些因素进行严格的 控制和优化。
1、PI染料的浓度和作用时间
1、PI染料的浓度和作用时间
PI（Propidium Iodide）是一种常用的细胞凋亡染色剂，可以与DNA结合并 使其发出红色荧光。然而，PI的浓度和作用时间对实验结果有很大影响。如果PI 浓度过低，则不能有效地染色细胞；而如果浓度过高，则可能导致细胞膜通透性 改变，
基本内容
结果可以以图表形式展示，如散点图、柱状图和曲线图等，以便直观地反映 细胞凋亡状态。
基本内容
总之，流式细胞术在细胞凋亡检测中具有广泛的应用价值，可以提供快速、 准确和多参数的结果。随着生物学和医学研究的不断发展，流式细胞术在细胞凋 亡检测中的应用将不断完善和拓展。未来，随着技术的进步，流式细胞术有望实 现更高的灵敏度
第二部分：双脱氧核苷酸法
与DAPI、PMA-RPN和IBF-IP等其他几种方法相比，双脱氧核苷酸法在检测细 胞凋亡方面具有较高的灵敏度和特异性。然而，双脱氧核苷酸法操作较为繁琐， 且需要使用较多的双脱氧核苷酸，可能会增加实验成本。
第三部分：聚合酶链反应法
第三部分：聚合酶链反应法

细胞凋亡流式检测实验方案掌握细胞凋亡的检测方法，了解细胞凋亡的发生机制。

二、实验原理细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡过程，是正常细胞生长、发育和组织维持的重要机制。

细胞凋亡的发生涉及许多生物化学过程，包括蛋白酶的激活、蛋白磷酸化、核酸降解等。

目前，常用的细胞凋亡检测方法有DNA损伤、凋亡相关蛋白（如Caspase）的活性检测、Annexin V染色体外膜表面的磷脂酰胆碱变化等。

三、实验材料1. 细胞培养基、PBS缓冲液；2. Annexin V-PE/7-AAD染色试剂盒；3. 离心管、试管、离心机等。

四、实验步骤1. 将细胞接种于96孔或24孔板中，待细胞生长到适当密度后，按照不同处理方式分为不同组。

2. 处理细胞，如加入药物、病毒等，切换培养基等。

3. 用PBS缓冲液洗涤一次细胞，加入含Annexin V-PE/7-AAD染色试剂的PBS缓冲液，室温下酒暗处理15分钟。

4. 加入PBS缓冲液洗涤一次细胞，加入PBS缓冲液悬浮细胞，用流式细胞仪检测细胞的荧光强度。

五、实验结果分析1. Annexin V染色阳性、7-AAD染色阴性：表明细胞凋亡早期，细胞膜磷脂酰胆碱翻转，但细胞核仍完整无损。

2. Annexin V染色阳性、7-AAD染色阳性：表明细胞凋亡晚期，细胞膜磷脂酰胆碱翻转，细胞核已经破裂，DNA释放。

3. Annexin V染色阴性、7-AAD染色阴性：表明细胞无凋亡现象。

4. Annexin V染色阴性、7-AAD染色阳性：表明细胞处于坏死状态，细胞膜破裂，7-AAD染料可以进入细胞核结合DNA。

六、注意事项1. 实验过程中要注意无菌操作；2. 实验前要将所有实验材料消毒；3. 实验过程中要加强个人防护，穿戴实验室专用实验服、手套、口罩等；4. 实验结果分析时要注意对比组间差异明显性，结果分析应结合其他指标进行综合分析。

流式细胞仪检测细胞凋亡实验步骤流式细胞仪是一种用于检测和分析细胞的仪器，可以通过测量细胞的荧光和散射特性来了解细胞的生理状态和功能。

在细胞生物学研究中，流式细胞仪广泛应用于细胞凋亡实验。

细胞凋亡是一种重要的细胞程序性死亡方式，正常情况下是一种维持生态平衡的重要机制，而在疾病发生时，细胞凋亡的失控会导致一系列疾病的发生。

因此，对细胞凋亡的检测和研究具有重要意义。

本文将介绍流式细胞仪检测细胞凋亡的实验步骤。

实验材料和仪器流式细胞仪细胞培养物凋亡诱导剂PBS缓冲液1×绑定缓冲液1×洗涤缓冲液荧光标记的抗体PI（胰岛素脱羧酶）Annexin V-FITC套装实验步骤1.细胞处理首先，将培养好的细胞分到不同的培养皿中，添加凋亡诱导剂，以诱导细胞凋亡。

凋亡诱导剂的种类和浓度应根据实验的需要来确定。

通常可选择小分子化合物、放射线等方式来诱导细胞凋亡。

2.收集细胞处理好的细胞经过一定时间的培养后，使用离心机将细胞沉淀下来，并用PBS缓冲液洗涤细胞，以去除培养基和凋亡诱导剂等杂质。

然后使用1×绑定缓冲液将细胞重悬。

3.细胞计数将细胞悬液加入细胞计数板中，用显微镜或自动细胞计数器计算细胞密度，并将细胞密度调整到合适的浓度。

4.细胞染色将调整好浓度的细胞悬液分到不同的离心管中，添加荧光标记的抗体和PI荧光染料。

荧光标记的抗体通常选择Annexin V-FITC，它可以与凋亡细胞膜表面磷脂酰丝氨酸结合，从而可以用于检测凋亡细胞；PI荧光染料用于检测坏死细胞。

5.混匀和孵育将离心管中的细胞悬液混匀均匀，然后在室温下孵育一定时间，通常为15-30分钟。

期间可以轻轻摇晃管子以保证充分的染色反应。

6.流式细胞仪检测染色反应结束后，将细胞悬液加入流式细胞仪的样品管中，通过流式细胞仪的激光和光电探测器，可以分辨出细胞的荧光和散射信号，从而获得细胞凋亡的信息。

使用流式细胞仪之前需要对仪器进行标定和调试，以确保获得准确和可靠的数据。

流式检测凋亡的讨论2010-07-15 14:28 来源：丁香园点击次数：15397 关键词：流式检测凋亡关于凋亡的流式检测wanhood一、PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。

这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1.细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。

研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。

许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。

2.光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。

在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。

在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。

此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。

细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。

但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。

因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。

根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。

也可用于活细胞的分类。

试剂与仪器PBS溶液（配制方法见附录）；PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。

用棕色瓶4℃避光保存。

70%乙醇400目筛网流式细胞仪实验步骤1.收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。

流式细胞仪检测细胞凋亡的原理一、原理在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。

Annexin V是一种分子量为35~36kD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

将Annexin V进行荧光素(EGFP、FITC)标记,以标记了的Annexin V作为荧光探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。

因此将Annexin V与PI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

二、注意事项1、必须活细胞检测,不能用能破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜。

2、特殊细胞的染色方法:在消化或吹打时,有些细胞(如神经元细胞)很容易受到损伤,导致晚期凋亡或坏死比例非常高,不能反映真实结果。

实验的解决方法:先低速离心,吸取细胞培养板中的液体,留少许液体,加入适量PI和Annexin-V染色10min后,将漂浮细胞吸至离心管中,离心洗涤两次,用PBS漂洗贴壁细胞两次,加胰酶消化后将细胞悬液移至另一离心管中,离心洗涤,再与漂浮细胞合并后上流式细胞仪检测。

应用该法可降低晚期凋亡和坏死比例,增加早期凋亡细胞比例。

3、由于Annexin-V为钙离子依赖的磷脂结合蛋白,只有在钙离子存在的情况下与PS的亲和力才大,因而在消化细胞时,建议一般不采用含EDTA的消化液。

4、必须设置阴性对照和补偿对照(分别单染)。

1、Q： Annexin V R-PE 20 tests是BD公司用于凋亡流式检测的试剂盒，产品显示种属为人，请问能否用于大鼠细胞的检测？A：可以。

因为Annexin V是与PS亲和，而PS在不同种属间应该没差异。

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。

Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

将Annexin V进行荧光素（FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

2、Q：用流式作细胞凋亡为什么跟tunel差别那么大啊？？tunel测出来的细胞凋亡率大概有30%而作流式测出来的凋亡率只有2%（阴性对照0.5%）差别好大啊，用的是beckman公司的Annexin V /PI双染试剂盒，实验步骤如下：（1）胰酶消化贴壁细胞，加培养基中止，离心1000转5min（2）吸去上清，PBS0.5ml 重悬细胞（因为要送到别处作流式，期间路程约1h，户外温度约37度）（3）然后加入Annexin V /PI各5微升，避光20min，上机。

请问这是什么原因导致的？A：我也用这两种方法做过凋亡，是存在两种方法测的凋亡率差别有点大，但还没有大到你这样的程度。

双染测的是凋亡的早期事件PS外翻。

TUNEL测的是凋亡最晚期的事件DNA 片段化。

而且TUNEL在检测过程中，把操作损伤细胞和坏死细胞当作了凋亡细胞，而且如果TUNEL是肉眼计数的话，也会有判断上的误差，所以，往往TUNEL作出来的凋亡率高一点。

但如果凋亡率达到30%，ladder估计也应该跑的出来。

双染虽然是机器操作，但在调试补偿时，人为的影响还是挺明显的，也不是特别的客观。

Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48
图 FCM测试细胞周
R1
期分布和凋亡
根据凋亡细胞的特点来检测
在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核 膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器 密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲， 但早期细胞膜的完整性未受到破坏
凋亡细胞的FSC ？SSC ？ 细胞坏死时，细胞肿胀，FSC ？，SSC ？
FCM分析白血病免疫表型, 快速、特异、 准确，重复性好，能区分细胞起源、划 分其分化发育阶段等，对白血病的诊断 与分型、治疗方案选择与预后判断、发 病机理研究等有重要价值。
五） 细胞内蛋白的分析：
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分 进行荧光标记，用流式细胞仪进行测量 分析，同表型分析一样，可以测量出这 种阳性细胞的数量和这种蛋白的相对含 量。荧光探针多为FITC。
单参数直方图
图中2N代表G0/G1期细胞，4N代表G2/M期细胞，两者中间代表 S期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图
DNA细胞周期分析
G2 M
G0
G1
细
s
胞 数
量
细胞周期
DNA分析
G0G1
s G2 M
2N
200
400
4N DNA含量
600
800
1000
肿瘤组织中的各种DNA倍体
二）肿瘤诊断与抗肿瘤药物研究
1. 肿瘤诊断
DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志 细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生
物学特征 利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA
倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前 病变、肿瘤的早期诊断和肿瘤细胞学诊断。
肿瘤组织中的各种DNA倍体

流式检测细胞凋亡Annexin V检测细胞凋亡Annexin V (2)实验原理 (2)实验用品 (2)操作步骤 (3)Annexin V Blocking (5)凋亡细胞的断裂片段分析 (7)DNA实验原理 (7)实验用品 (8)操作步骤 (9)BrdU Flow Kits检测细胞增殖BrdU Flow (12)实验原理 (12)BrdU Flow Kits试剂盒 (12)结果分析 (17)流式仪器设置指南 (18)线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22)实验原理 (22)实验用品 (22)样本制备 (23)结果分析 (24)注意事项 (24)Active Caspase-3检测细胞凋亡Active (26)实验原理 (26)实验步骤 (27)结果分析 (28)A n n e x i n V检测细胞凋亡实验原理Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。

它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。

在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。

Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。

由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。

因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。

实验用品1. 一次性12×75mm Falcon试管。

2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8°C保存。

3. 微量加样器和加样头。

4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。

流式细胞仪细胞凋亡检测技术一、固定细胞的染色方法1）PI单染色法方法一1．收集细胞（1～5）×106个，500～1000r/min离心5min，弃去培养液。

2．3ml PBS洗一次。

3．离心去PBS，加入冰预冷的70％的乙醇固定，4℃，1h。

4．离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。

5．400目的筛网过滤1次，500～1000r/min离心5min，弃去PBS。

6．用1ml PI染液，4℃避光30min。

7．流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光，可分析前散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。

方法二1．收集细胞（1×106个），500～1000r/min离心5min，弃去培养液。

2．1ml PBS/FCS洗一次。

3．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，加入500μl PBS/FCS和500μl的多聚甲醛固定液，轻轻混匀，在4℃下固定4min。

4．500～1000r/min离心5min弃去固定液，室温加入含0.2％Tween 的PBS 1ml，37℃孵育15min。

5．1ml PBS/FCS洗3次，每次5min。

6．400目的筛网过滤1次。

7．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，用1.0ml PI染液，4℃避光至少30min。

染色在24h之内皆可行，流式细胞仪分析。

2）调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析1．离心收集细胞，PBS洗1～2次。

2．1％多聚甲醛低温下固定15min。

3．3ml PBS洗1次，70％乙醇固定，冰箱内放置1～3天。

4．PBS轻洗1次5．细胞与TdT标记液37℃孵育，时间1～2h。

6．PBS轻洗1次。

7．细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min。

8．含0.1％Triton-X 100的PBS轻洗1次。

4．500～1000r/min离心5min弃去固定液，室温加入含0.2％Tween 的PBS 1ml，37℃孵育15min。

第1篇一、实验目的1. 掌握流式细胞术的基本原理和操作流程。

2. 学习流式细胞术检测细胞凋亡的方法和技巧。

3. 了解细胞凋亡在生物学研究中的重要性。

二、实验原理细胞凋亡（Apoptosis）是一种由基因调控的细胞程序性死亡过程，对于维持生物体内环境的稳定具有重要意义。

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种基于激光的细胞分析技术，可以快速、准确地检测细胞的各种生物学特性。

通过流式细胞术检测细胞凋亡，可以了解细胞凋亡的发生过程、细胞凋亡相关基因的表达情况以及细胞凋亡在疾病发生发展中的作用。

三、实验材料1. 细胞：人肺上皮细胞（A549细胞）。

2. 试剂：Annexin V-FITC/PI染色试剂盒、RPMI-1640培养基、胰蛋白酶、EDTA、PBS缓冲液、胎牛血清等。

3. 仪器：流式细胞仪、细胞培养箱、细胞计数仪、显微镜等。

四、实验方法1. 细胞培养：将A549细胞接种于培养皿中，置于细胞培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期。

2. 细胞凋亡诱导：将细胞分为实验组和对照组，实验组加入一定浓度的凋亡诱导剂（例如：顺铂），对照组加入等量的PBS缓冲液。

3. 细胞处理：将实验组和对照组细胞分别收集，用胰蛋白酶和EDTA消化细胞，用PBS缓冲液清洗细胞，调整细胞浓度至1×10^6个/mL。

4. 细胞染色：取100μL细胞悬液，加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，混匀，室温避光孵育15分钟。

5. 流式细胞术检测：将染色后的细胞悬液注入流式细胞仪，设置合适的参数进行检测。

6. 数据分析：利用流式细胞术分析软件对检测数据进行处理和分析，得到细胞凋亡率。

五、实验结果1. 细胞凋亡率：通过流式细胞术检测，实验组细胞凋亡率为30%，对照组细胞凋亡率为5%。

2. Annexin V-FITC/PI染色结果：实验组细胞在Annexin V-FITC/PI染色后，大部分细胞位于Annexin V-FITC/PI双阳性区域，表明细胞发生了凋亡；对照组细胞主要位于Annexin V-FITC/PI单阴性区域，表明细胞未发生凋亡。