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含氮大环内酯类抗生素及其生物合成研究进展雷帕霉素、他克莫司等一类含氮大环内酯类微生物代谢产物是目前临床重要的药物，它们具有特殊的结构基团，即内酯环上含有1分子非蛋白质组成氨基酸——哌可酸，通过哌可酰基与细胞内一类具有脯氨酰顺反异构酶活性的免疫亲合蛋白（immunophilin）FKBPs（FK506 bingding proteins）相互作用形成复合物，作用于细胞不同靶位，发挥多种不同的生物学功能[1]。
这类化合物具有广泛的生物学活性，除抗真菌活性外，临床已用作器官移植抗排斥药物、血管扩张支架涂层药物[2]、靶向抗肿瘤药物[3-4]、炎症治疗药物[5]，同时，这类化合物还具有潜在的治疗中风[6]、神经退行性疾病[7]、帕金森综合症[8]、老年痴呆[9]等作用，Harrison等人2009年7月在《Nature》杂志上报道雷帕霉素可以延长哺乳类动物老龄小鼠寿命的研究成果[10]，立即引起各国科学家的广泛关注和高度兴趣[11]，美国《Science》杂志把此项研究成果评选为当年十大科学进展之一，预计10年左右可望应用于人体。
含有哌可酰基的含氮大环内酯类微生物代谢产物具有相似的生物合成途径，它们都属大环内酯类化合物，由典型的具有模块结构的I型聚酮合酶（Polyketide synthase, PKS）催化合成内酯环碳链骨架，由单模块的非核糖体肽合成酶（Non-ribosomal peptide synthetase, NRPS）催化把哌可酸整合到内酯环骨架，并通过环化酶活性域使含哌可酰基的聚酮链内酯化从PKS/NRPS杂合酶上脱离，最后通过一些列氧化酶、甲基转移酶等进行侧链基团的修饰形成最后的活性产物，由于这类化合物具有相似的结构和合成机制，特别是它们的作用机制独特带来广泛的生物学活性和临床应用前景，已经成为目前国内外关注和研究的热点。
一、微生物产生的含氮大环内酯类化合物1、Rapamycin（雷帕霉素, 西罗莫司/sirolimus）1975年，加拿大Ayerst试验室V ezina等在筛选抗真菌抗生素中，从太平洋复活岛土壤样品中分离到一株具有抗白色念珠菌（Candida albicans）等酵母样真菌和石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)等丝状真菌活性的吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicusNRRL5491）[12]，并从其发酵液中分离得到一个新的含氮三烯36元环大环内酯类抗真菌化合物（图1），即雷帕霉素。
大环内酯类作用原理
大环内酯类药物是一类广泛应用于临床的抗菌药物。
这类药物的作用原理主要是通过抑制细菌的蛋白质合成来发挥抗菌作用。
大环内酯类药物通过与细菌的核糖体结合，阻止其进行蛋白质的合成。
在细菌的细胞内，核糖体是负责将mRNA上的遗传
信息转化为蛋白质的主要机构。
大环内酯类药物通过与核糖体上的23S rRNA结合，阻断其与mRNA的结合，从而阻止细
菌进行蛋白质的合成。
由于细菌的生长和繁殖过程中需要合成大量的蛋白质，而且蛋白质在细菌的代谢和功能中扮演着重要的角色，因此抑制蛋白质的合成会导致细菌无法正常生长和繁殖，从而达到抗菌的效果。
不同的大环内酯类药物对细菌的作用机制略有不同，但总的来说，它们都可以通过与核糖体结合来抑制蛋白质的合成，从而达到抗菌的效果。
这类药物对革兰阳性菌和某些革兰阴性菌均有较好的抗菌活性，广泛用于治疗呼吸道、皮肤软组织和泌尿系统感染等细菌感染疾病。
总而言之，大环内酯类药物通过抑制细菌的蛋白质合成来发挥抗菌作用，从而阻止细菌的生长和繁殖，达到治疗感染疾病的目的。
大环内酯类抗生素糖基合成及生物学功能中华首席医学网 2007年09月20日15:38:48 Thursday226作者：曹孟婵张部昌作者单位：安徽大学生命科学学院，合肥230039《中国抗生素杂志》2007年3月32卷3期文章加入收藏夹【摘要】大环内酯类抗生素结构中的糖基基团在抑菌、生产菌自我保护和调控大环内酯类抗生素内酯环合成方面有着重要的生物学功能。
了解糖基的合成途径、糖基转移酶的结构特点和糖基生物学功能对研制新结构抗生素，解决当前日益严重的致病菌耐药性问题起着重要的指导作用。
通过基因工程的方法改造糖基，已经合成了一系列具有抗菌活性的新结构化合物。
本文就目前所了解的糖基合成途径、糖基转移酶的结构特点和糖基重要生物学功能做一综述，并简单介绍基因工程改造糖基合成新结构抗生素的研究进展。
【关键词】大环内酯类抗生素糖基生物学功能结构改造Glycosyl synthesis and biofunction of macrolide antibioticsCao Meng chan and Zhang Bu chang(School of Life Sciences, Anhui University, Hefei 230039)ABSTRACT The review summarized synthesis pathway of glycosyl linked to macrolide antibiotics, the structure feature of their glycosytransferase and glycosyl biofunction ofmacrolide antibiotics, and briefly introduced progress in modifying glycosyl to synthsize novel structure antibiotics by genetic engineering.KEY WORDS Macrolide antibiotics; Glycosyl; Biofunction; Structure modification大环内酯类抗生素是一类根据其结构特点命名的广谱抗生素，由多元内酯环和后修饰基团相连而成。
大环内酯类抗生素生物合成途径基因工程的研究摘要】大环内酯类抗生素作为临床治疗感染疾病的首选药物，加强其基因工程中基因结构和生物合成的深入研究和应用基因工程技术对大环内酯类抗生素的结构进行合理改造，对增强其药物价值具有重要的意义。
本文主要从大环内酯类抗生素的生物合成、酮内酯类抗生素的结构基因工程修饰、必特螺旋霉素的生物合成、麦迪霉素的基因重组等热点问题进行了综述。
【关键词】大环内酯 PKS 组合生物合成聚酮【中图分类号】R915 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）06-0010-02大环内酯类抗生素是一种具有大内酯环基本化学结构的抗生素，多为碱性亲脂性化合物。
该类化合物通过与核糖核蛋白体的50S亚单位结合，可对肽酰基转移酶起到抑制作用，从而阻止肽链增长，妨碍核糖核蛋白移位，对细菌蛋白质的合成起到抑制的作用，在临床治疗感染疾病中发挥着重要的药用价值。
近年来，随着医学技术和生物工程技术的不断发展，大环内酯类抗生素的基因工程研究进展不断加快，一方面，人们已从基因结构和生物合成全方位、更深入的进行了大环内酯类抗生素的基因工程的研究，另一方面，在上述研究的基础上，人们还有目的、有计划的应用基因工程技术对大环内酯类抗生素的结构进行改造，创造出了一些体内外抗菌活性高、临床治疗效果显著的新型大环内酯类抗生素。
1.大环内酯类抗生素的生物合成大环内酯类抗生素多为碱性亲脂性化合物，而这类碱性亲脂性化合物的属性又为聚酮类化合物。
在聚酮类化合物生成过程中有一必不可少的机制，即多酶体系——聚酮合酶(PKS)催化作用。
组成PKS的多肽上均携带有酶，而这些酶正是参与聚酮生物合成所必须的。
每个结构域的酶只参与整个聚酮碳链中的一步反应。
那么聚酮类化合物合成途径中关键酶的整个基因簇功能是如何实现的呢？PKS多酶体系由一个起始组件和多个延伸组件共同构成，其功能和结构都比较复杂。
主要是因为每一个延伸组件都能将一个特异的乙酰辅酶A前体添加到聚酮链上，且还能特异改变β-酮基。
大环内酯类抗生素糖基合成及生物学功能中华首席医学网 2007年09月20日15:38:48 Thursday226作者：曹孟婵张部昌作者单位：安徽大学生命科学学院，合肥230039《中国抗生素杂志》2007年3月32卷3期文章加入收藏夹【摘要】大环内酯类抗生素结构中的糖基基团在抑菌、生产菌自我保护和调控大环内酯类抗生素内酯环合成方面有着重要的生物学功能。
了解糖基的合成途径、糖基转移酶的结构特点和糖基生物学功能对研制新结构抗生素，解决当前日益严重的致病菌耐药性问题起着重要的指导作用。
通过基因工程的方法改造糖基，已经合成了一系列具有抗菌活性的新结构化合物。
本文就目前所了解的糖基合成途径、糖基转移酶的结构特点和糖基重要生物学功能做一综述，并简单介绍基因工程改造糖基合成新结构抗生素的研究进展。
【关键词】大环内酯类抗生素糖基生物学功能结构改造Glycosyl synthesis and biofunction of macrolide antibioticsCao Meng chan and Zhang Bu chang(School of Life Sciences, Anhui University, Hefei 230039)ABSTRACT The review summarized synthesis pathway of glycosyl linked to macrolide antibiotics, the structure feature of their glycosytransferase and glycosyl biofunction ofmacrolide antibiotics, and briefly introduced progress in modifying glycosyl to synthsize novel structure antibiotics by genetic engineering.KEY WORDS Macrolide antibiotics; Glycosyl; Biofunction; Structure modification大环内酯类抗生素是一类根据其结构特点命名的广谱抗生素，由多元内酯环和后修饰基团相连而成。
根据内酯环碳原子数目不同，可分为12～16元环抗生素，其中，在临床上最重要、最常见大环内酯类抗生素有12元环的酒霉素(methymycin)、苦霉素(pikro mycin)，14元环的红霉素(erythromycin)、竹桃霉素(oleandomycin)，15元环的阿奇霉素(azithromycin)和16元环的螺旋霉素(spiramycin)、泰洛星(tylosin)等。
大环内酯类抗生素合成过程中要经过一些后修饰，如羟基化、甲基化和糖基化等［1～4］，这些后修饰基团都有着重要的生物学功能，其中，通过糖基化后修饰连接于内酯环上的糖基特别是脱氧糖基参与靶位点的分子识别作用，是抗生素表现抗菌活性的必要组成成分。
近几年，随着分子生物学技术的发展，在研究抗生素某些合成基因功能的时候，又发现了内酯环上连接的糖基的其它生物学功能，虽然目前还不清楚其中有些糖基生物学功能的确切机理，但了解了这些生物学功能对解决当前日益严重的致病菌耐药性问题，研制新结构抗生素起着重要的指导作用。
通过基因工程改造糖基合成一系列具有抗菌活性新结构物质的研究已取得了一定进展。
本文就目前所了解的大环内酯类抗生素上连接糖基的合成途径，糖基转移酶的结构特点，糖基在抑菌、生产菌自我保护和调控大环内酯类抗生素内酯环合成方面的生物学功能做一综述，简单介绍基因工程改造糖基合成具有抗菌活性新结构物质的研究进展。
1 糖基合成途径及其转移酶的结构特点连接于大环内酯类抗生素内酯环上的后修饰糖基基团大部分属于6 脱氧己糖(6 deoxyhexose，6 DOHS)，以2，6 脱氧己糖(2，6 dideoxyhexose)居多，迄今至少有80种不同的6 DOHS 被报道［5～7］，其中大多数参与构成不同的抗生素。
在临床上常见的大环内酯类抗生素上连接的脱氧糖基有D 红霉糖胺(desasomine)、L 夹竹桃糖L oleandrose)和D 碳霉糖(D mycaminose)等等(表1)。
目前这些脱氧糖生物合成过表1 几种常见大环内酯类抗生素上连接的脱氧糖糖基添加到内酯环上需要糖基转移酶的作用。
许多大环内酯类抗生素的糖基转移酶具有底物灵活性的特点。
根据其针对的底物灵活性不同，可把糖基转移酶分为对脱氧糖具有灵活性、对底物内酯环具有灵活性、对脱氧糖和内酯环都具有灵活性三种。
已报道对底物糖基具有灵活性的糖基转移酶有OleG2、对底物内酯环具有灵活性的糖基转移酶有DesvII、TylM2、MycB等［10～12］，而糖多孢红霉菌中的eryCIII编码的红霉糖胺糖基转移酶却具有相对严格的底物特异性［13］。
研究发现这些糖基转移酶在一级结构序列上几乎不具相似的保守性，却具有高级结构上相似性：有双叶状的两个结合域，一个是具有亲核性内酯环骨架的结合位点，另一个是具有亲电性NDP 糖的结合位点［14］。
转移糖基的过程也就是NDP 糖捕获内酯环的过程。
在利用整合生物合成的方法合成新结构抗生素方面，具有底物灵活性糖基转移酶是一种重要的工具。
近年来随着生物技术发展，对其编码基因的深入了解，可以通过突变、敲除等方法来改变糖基转移酶结合域的特异性，产生更多具有底物灵活性转移酶，为合成新结构抗生素提供有力工具［15］。
2 糖基的生物学功能2.1 活化内酯环的作用大环内酯类抗生素内酯环本身没有抑菌活性，要经过后修饰基团如甲基、羟基、糖基等活化后才具有抗菌活性［1～4］。
其中糖基尤其氨基糖基是活化内酯环关键性基团，在抑菌方面起着关键性作用(以红霉素和泰洛星为例说明)。
14元环的红霉素主要通过与核糖体50S亚型的23S rRNA的domainV结构域A2058位点结合，促进转录阶段的肽早熟性分离和阻碍新生肽的释放来抑制细菌生长。
与A2058结合的是红霉素内酯环C 5位红霉糖胺的2 OH［16］。
A2058的残基N1离domainV中二脱氧 D(L) 己糖合成路径细菌生长。
与A2058结合的是红霉素内酯环C 5位红霉糖胺的2 OH［16］。
A2058的残基N1离domainV 中心A2451位点大约有15nm的距离，A2451是肽酰转移酶催化中心的结合位点，当合成的新生肽链长度达到3～5个氨基酸时，红霉素通过与A2058位置结合阻断肽链的延伸，促进转录阶段的肽早熟性分离。
位点A2058又是靠近肽酰转移酶的底部，并且在新生肽释放隧道的入口处，结合在此位点上红霉素分子又会有效地阻碍新生肽的释放。
16元环泰洛星作用机理是通过影响肽酰转移酶的活性来阻碍新生肽的肽键形成，抑制细菌的生长。
泰洛星内酯环上连接的二糖上的mycarose是其活性所必不可少的基团，缺乏mycarose会使泰洛星失去抑制细菌蛋白合成的能力［17］。
研究发现mycarose的结合位点是U2506［18］，U2506与肽酰转移酶(tRNAPhe)3′端的2N3A76在P位点上的结合位点横穿连接［19］，而U2506又距离domainV 中心位点A2541(A2451是肽酰转移酶催化中心的结合位点)只有大约90nm。
由于空间距离上的靠近，使内酯环上连接的另外一个糖基mycinose直接干涉了肽酰转移酶的反应，阻碍新生肽肽键形成，抑制细菌生长。
2.2 调节内酯环合成的作用泰乐酮(tylactone)内酯环上连接的碳霉糖糖基具有调节内酯环合成的作用，是1997年Fish等［20］在研究泰洛星产生菌弗氏链霉菌(S.fradiae)中的碳霉糖转移酶基因tylM2功能时候发现的。
Fish发现敲除基因tylM2的弗氏链霉菌不能合成内酯环泰乐酮，当只有外加碳霉糖基化的泰乐酮或其它连有碳霉糖基的抗生素后，弗氏链霉菌才恢复合成泰乐酮的能力。
在弗氏链霉菌的染色体上，tylM2处于泰乐酮合成基因tylG和调控基因tylR的下游，基因tylM2的敲除可能不会直接影响tylG和tylR的表达，但可能会影响调控基因tylR表达的调控因子TylR的功能。
推测碳霉糖基化的泰乐酮可能是作为调控蛋白TylR的一个辅因子，与调控蛋白结合，共同调节tylG表达［20，21］，但是对于具体调控机理至今未有文献报道。
同样的调控机理可能也存在大环内酯类抗生素spinosad的生产菌S.spinosa中，鼠李糖(rhamnose)是第一个连接到spinosad内酯环上的糖基，当敲除L 鼠李糖基(L rhamnosyl)转移酶基因spnG后，生产菌没有spinosad和其它前体的合成［22］，同样，当加入外源的糖基化前体后，菌株恢复合成spinosad 和其内酯环的能力，具体的调控机理也不清楚。
2.3 失活抗生素的作用某些大环内酯类抗生素生产菌为防止抗生素对自身致死性作用，进行自我保护，需要具有失活抗生素的作用。
就目前所了解，这种失活抗生素作用的机制有三种：①对细菌核糖体上的抗生素结合位点进行甲基化或磷酸化等修饰机制；②加速抗生素外排机制；③糖基化失活抗生素机制。
其中，第三种是生产菌对抗生素内酯环上6 脱氧己糖做进一步糖基化修饰以失活抗生素。
这种自我保护机制最初在淡青紫链霉菌(S.lividans)中发现［23］。
之后又在竹桃霉素的产生菌抗生素链霉菌(S.antibioticus)、酒霉素和新酒霉素(neome thymycin)产生菌委瑞内拉链霉菌(S.venezuelae)中发现［24］。
现已知道，在32种生产聚酮类抗生素的链霉菌中有15种存在这种抗性机制［25］。
下面就以抗生素链霉菌为例来说明这种作用机制。
在抗生素链霉菌中，糖基化作用是以UDP 葡萄糖为糖基的供体，在位于细胞质中的糖基转移酶OleI 作用下，对竹桃霉素内酯环C 5位单糖夹竹桃糖的2 OH进行糖基化修饰。
2 OH是与核糖体靶位点结合的功能性基团，修饰后葡萄糖基阻碍了2 OH与靶位点的结合，致使竹桃霉素失去活性。
同时，分泌到细胞外的竹桃霉素在胞外β 糖苷脱糖基酶OleR作用下脱去2 OH上的糖基［26］，重新得到活化。
正是这种糖基化修饰与脱糖基化平衡机制的存在，为抗生素生产菌提供了自我保护，而又不会使合成的抗生素永久性失活。
3 改造糖基的研究进展一些糖基与抗生素的活性密切相关，可以通过基因工程对糖基进行改造，合成新结构的抗生素，来解决当前日益严重的致病细菌耐药性问题。
其方法归纳起来有三种：①改变脱氧糖基结构；②替换连接的糖基；③去除糖基。
3.1 通过基因工程改变脱氧糖基结构随着对抗生素上连接的糖基特别是脱氧糖基合成过程和具有灵活性的糖基转移酶的了解，可以通过两种方法来改变脱氧糖基结构，一是通过表达外源基因对脱氧糖基做进一步的修饰。
