β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ的工艺

酶水解淫羊藿提取物制备宝藿苷Ⅰ的研究目录摘要........................................................................................................................... . (I)ABSTRACT........................................................................................................... ...........................III 前言.. (1)第一部分用淫羊藿提取物制备宝藿苷Ⅰ的酶水解工艺研究 (5)1引言 (5)2实验部分 (5)2.1仪器、材料与试药 (5)2.1.1仪器 (5)2.1.2材料 (6)2.1.3试药 (6)2.2淫羊藿苷与宝藿苷Ⅰ在HPLC中摩尔吸收校正因子的测定 (7)2.2.1对照品溶液的制备 (7)2.2.2校正因子的测定 (7)2.2.3淫羊藿苷转化率的测定 (7)2.3预实验 (7)2.3.1静态与动态酶水解反应的比较试验 (7)2.3.2采用不同厂家纤维素酶进行酶水解反应的比较试验 (8)2.4纤维素酶水解淫羊藿提取物（淫羊藿苷含量≥90%）的工艺研究 (9)2.4.1单因素试验 (9)2.4.1.1酶用量的考察 (9)2.4.1.2缓冲液pH的考察 (10)2.4.1.3底物质量浓度的考察 (10)2.4.1.4反应时间的考察 (11)2.4.1.5反应温度的考察 (12)2.4.1.6结论 (12)2.4.2Plackett-Burman试验设计（P-B试验设计） (12)2.4.2.1因素及水平范围 (12)2.4.2.2P-B实验设计与结果 (13)2.4.2.3结论 (13)2.4.3CCD响应面法优化工艺 (13)2.4.3.1CCD因素、水平及结果 (13)2.4.3.2回归分析 (15)2.4.3.4纤维素酶水解淫羊藿提取物工艺实验验证 (16)2.5纤维素酶水解淫羊藿提取物（淫羊藿苷含量≥30%）的工艺研究 (17)2.5.1单因素试验 (17)2.5.1.1酶用量的考察 (17)2.5.1.2底物质量浓度的考察 (18)2.5.1.3反应时间的考察 (18)2.5.1.4结论 (19)2.5.2CCD响应面法优化工艺 (19)2.5.2.1CCD因素、水平及结果 (19)2.5.2.2回归分析 (20)2.5.2.4纤维素酶水解淫羊藿提取物工艺实验验证 (22)2.6不同浓度的淫羊藿提取物对工艺适应性的验证研究 (23)2.6.1采用淫羊藿提取物（淫羊藿苷含量≥98%）验证工艺研究(23)2.6.1.1淫羊藿提取物（淫羊藿苷含量≥98%）的酶水解反应 (23)2.6.1.2淫羊藿提取物（淫羊藿苷含量≥98%）转化率的测定 (23)2.6.2采用淫羊藿提取物（淫羊藿苷含量≥20%）验证工艺研究(24)2.6.2.1淫羊藿提取物（淫羊藿苷含量≥20%）的酶水解反应 (24)2.6.2.2淫羊藿提取物（淫羊藿苷含量≥20%）转化率的测定 (24)第二部分从酶水解液中分离、纯化宝藿苷Ⅰ (25)1引言 (25)2实验部分 (25)2.1仪器、材料与试药 (25)2.1.1仪器 (26)2.1.2材料 (26)2.1.3试药 (26)2.2宝藿苷Ⅰ含量测定方法的建立 (27)2.2.1宝藿苷Ⅰ含量测定方法的确定 (27)2.2.1.1色谱条件 (27)2.2.1.2对照品的制备 (27)2.2.1.3供试品溶液的制备 (28)2.2.1.4检测波长的选择 (28)2.2.2耐用性考察 (28)2.2.2.1流速考察 (28)2.2.2.2流动相比例考察 (29)2.2.2.3流动相pH值的考察 (30)2.2.2.4柱温考察 (31)2.2.2.5色谱柱考察 (32)2.2.2.6检测波长的考察 (33)2.2.2.7结论 (34)2.2.3方法学考察 (34)2.2.3.1色谱条件与专属性试验 (34)2.2.3.2线性范围考察 (35)2.2.3.3精密度试验 (36)2.2.3.5重复性试验 (36)2.2.3.6加样回收试验 (37)2.3从酶水解反应产物中分离宝藿苷Ⅰ的研究 (37) 2.3.1水洗酶水解产物过程中水温的考察 (37) 2.3.2水洗酶水解产物过程中水用量的考察 (39) 2.3.3结论 (39)2.4宝藿苷Ⅰ纯化方法的研究 (40)2.4.1重结晶法 (40)2.4.1.1单一溶剂的选择 (40)2.4.1.2用单一溶剂对宝藿苷Ⅰ进行重结晶 (41)2.4.1.4乙醇回流对宝藿苷Ⅰ重结晶的影响 (42)2.4.1.5结论 (42)2.4.2大孔树脂吸附法 (42)2.4.2.1树脂的预处理 (42)2.4.2.2宝藿苷Ⅰ的纯化 (43)2.4.3萃取法 (43)2.4.4聚酰胺树脂吸附法 (43)2.4.4.1拌样 (43)2.4.4.2上样与检测 (44)2.4.5小结与讨论 (44)2.5最终样品含量测定 (45)2.6小结 (45)结论与展望 (46)结论 (46)展望 (47)参考文献 (48)第三部分综述生物酶水解技术在淫羊藿中的应用现状和展望 (51)参考文献 (58)附图一：HPLC图 (61)附图二：薄层色谱图 (66)致谢 (70)在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果 (71)声明及授权书 (72)摘要宝藿苷Ⅰ（BaohuosideⅠ）为小檗科淫羊藿属植物淫羊藿Epimedium brevicornum Maxim.中的一种多羟基黄酮类单体化合物，也是淫羊藿药材中的一种有效成分，国内外文献报道其抗肺癌细胞活性和生物药剂学性质明显优于淫羊藿中其他黄酮苷类化合物。

专利名称：β-葡萄糖苷酶的用途及用其制备宝藿苷Ⅰ的方法专利类型：发明专利
发明人：傅荣昭,刘立辉,曹磊,刘滔滔,郭杏林
申请号：CN201880038008.3
申请日：20180425
公开号：CN110770351A
公开日：
20200207
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：提供了一种使用β‑葡萄糖苷酶制备宝藿苷Ⅰ的方法，包括用β‑葡萄糖苷酶催化底物水解制备宝藿苷Ⅰ，底物为淫羊藿提取物、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、箭藿苷A和箭藿苷B中的任意一种或多种，所述β‑葡萄糖苷酶具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

该方法能够将淫羊藿、朝藿定A、朝藿定B、箭藿苷A及箭藿苷B全部水解成宝藿苷Ⅰ，提高了淫羊藿提取物的有效利用率，大大降低了宝藿苷Ⅰ的制备成本。

还提供了所述β‑葡萄糖苷酶以及含有所述β‑葡萄糖苷酶基因的微生物菌株在催化淫羊藿提取物、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、箭藿苷A和箭藿苷B中的任意一种或多种水解，制备宝藿苷Ⅰ中的应用。

申请人：邦泰生物工程(深圳)有限公司,江西邦泰绿色生物合成生态产业园发展有限公司
地址：518102 广东省深圳市宝安区西乡街道铁岗桃花源科技创新园第三分园1栋厂房1层A-2国籍：CN
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710079813.8(22)申请日 2017.02.15(71)申请人 鲁南制药集团股份有限公司地址 276005 山东省临沂市红旗路209号(72)发明人 张贵民　齐长鹏　刘文平　(51)Int.Cl.C07H 17/07(2006.01)C07H 1/08(2006.01)(54)发明名称一种淫羊藿苷的制备工艺(57)摘要一种制备淫羊藿苷的工艺，包括以下步骤：(1)提取：将淫羊藿原料粉碎，用醇溶液加热回流提取，提取液浓缩。

(2)萃取：用正丁醇或乙酸乙酯萃取浓缩过的提取液，回收有机溶剂得含有淫羊藿苷的萃取物。

(3)醇洗：将含有淫羊藿苷的萃取物用无水甲醇或无水乙醇或40-95％乙醇或30-95％甲醇洗，醇洗所剩固形物用于下步结晶用。

(4)结晶：将上步所得固形物结晶，即成。

本发明工艺简单，对设备要求低，产品收率高，适合工业化大生产。

权利要求书1页 说明书4页CN 106831913 A 2017.06.13C N 106831913A1.一种制备淫羊藿苷的工艺，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取：将淫羊藿原料粉碎，用醇溶液加热回流提取，合并提取液，过滤，并减压真空浓缩提取液；(2)萃取：将步骤(1)所得提取浓缩液用正丁醇或乙酸乙酯萃取，萃取液减压真空浓缩回收有机溶剂，得到含有淫羊藿苷的萃取物；(3)醇洗：将步骤(2)所得萃取物加入无水甲醇或无水乙醇或40-95％乙醇或30-95％甲醇，搅拌，过滤得淫羊藿苷醇洗物；(4)结晶：将步骤(3)所得淫羊藿苷醇洗物用结晶溶剂加热回流溶解，趁热过滤，滤液浓缩，浓缩液冷却至室温，静置析晶，过滤，固形物在真空干燥箱中干燥，得淫羊藿苷成品。

2.根据权利要求书1所述的制备淫羊藿苷的工艺，其特征在于，步骤(1)中，所述醇溶液为乙醇水溶液或甲醇水溶液，加热回流提取2-3次，每次提取所加入溶剂的体积相当于淫羊藿原料重量的5-30倍，提取时间为1-3小时。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710448315.6(22)申请日 2017.06.14(71)申请人 江苏康缘药业股份有限公司地址 222047 江苏省连云港市经济技术开发区江宁工业城申请人 南京林业大学(72)发明人 萧伟　赵林果　葛林　丁岗　裴建军　王振中　(74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限公司 11227代理人 赵青朵(51)Int.Cl.C12N 9/24(2006.01)C12N 9/42(2006.01)C12P 17/06(2006.01)(54)发明名称一种糖苷酶组合物及酶法制备淫羊藿苷元的方法(57)摘要本发明涉及酶工程及生物医药技术领域，尤其涉及一种糖苷酶组合物及酶法制备淫羊藿苷元的方法。

本发明筛选获得了一种能有效降解淫羊藿苷母核结构上鼠李糖残基的α-L-鼠李糖苷酶及能高效降解其母核结构中葡萄糖残基耐高温β-葡萄糖苷酶，随后通过双酶转化高效制备具有完全保持原有生物活性的淫羊藿苷元。

本发明提供的组合物中，两种糖苷酶的最适反应温度都较高，底物溶解性较好，不需要助溶剂；并且酶解时间短，得率高。

实验表明，采用本发明提供的糖苷酶组合物对淫羊藿苷进行酶解，摩尔转化率为98.3％，淫羊藿苷元的得率为90％。

权利要求书1页 说明书15页序列表23页 附图3页CN 107641621 A 2018.01.30C N 107641621A1.一种糖苷酶组合物，其特征在于，由α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶组成；所述α-L-鼠李糖苷酶源自Aspergillus terreus CCF 3059、Aspergillus niger NL-1或Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482；所述β-葡萄糖苷酶源自Thermotoga thermarum DSM 5069 GH1家族、Thermotoga thermarum DSM 5069 GH3家族、Thermotoga petrophila DSM 13995 GH1家族、Thermotoga petrophila DSM 13995 GH3家族或Aspergillus niger NL-1GH3家族。

新型双相酶水解体系制备宝藿苷Ⅰ汪燕;张小溪;邵建兵;王海艳;周怡莹;杨鸿;杨欢;沈玉萍;贾晓斌【期刊名称】《中成药》【年(卷),期】2018(040)012【摘要】目的构建新型双相酶水解体系制备宝藿苷Ⅰ.方法单因素试验优化缓冲液pH值、酶与底物质量比、酶解时间、反应温度,并在淫羊藿苷处理量、酶重复使用、操作方便性方面上与传统酶水解法进行比较.结果在醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.0)和乙酸乙酯构建的双相酶水解体系中,当β-葡萄糖苷酶与淫羊藿苷的质量比为1∶1时,于55℃下反应6h后水解率达到100％,双相水解法可将淫羊藿苷处理量提高到60 mg/mL,是传统酶水解法的2倍,并且制备步骤得以简化.此外,双相酶水解体系中酶液使用2次后,淫羊藿苷转化率仍能达到98.58％.结论该方法可高效、便捷地水解淫羊藿苷以获取宝藿苷Ⅰ,并实现了酶的重复利用.【总页数】4页(P2775-2778)【作者】汪燕;张小溪;邵建兵;王海艳;周怡莹;杨鸿;杨欢;沈玉萍;贾晓斌【作者单位】如皋市人民医院药剂科,江苏如皋226500;江苏大学药学院,江苏镇江212013;如皋市人民医院药剂科,江苏如皋226500;江苏大学药学院,江苏镇江212013;江苏大学药学院,江苏镇江212013;江苏大学药学院,江苏镇江212013;江苏大学药学院,江苏镇江212013;江苏大学药学院,江苏镇江212013;江苏大学药学院,江苏镇江212013;中国药科大学中药学院,江苏南京211198【正文语种】中文【中图分类】Q556【相关文献】1.HPLC梯度洗脱法同时测定参茸延龄片中补骨脂素、异补骨脂素、淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ含量 [J], 莫志斌2.宝藿苷Ⅰ混合胶束的制备、表征及其体外活性研究 [J], 魏渝鉴;娄彬;王新东3.宝藿苷Ⅰ减轻急性神经炎症所致的大鼠海马神经元损伤 [J], 邓媛媛;高虎;石琬岚;李菲4.淫羊藿苷及宝藿苷I对气管切开模型大鼠肺组织病理学及炎症因子的影响 [J], 鞠静;彭玲玲;潘宇政;谭人千;潘茂华;韦进新5.宝藿苷Ⅰ减轻链脲佐菌素诱导大鼠海马神经元结构损伤的作用机制研究 [J], YIN Caixia;CHEN Jing;ZHANG Jue因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。