GUS 组织化学染色-拟南芥

GUS组织化学染色GUS组织化学染色GUS组织化学染色1. 实验原理适宜的反应条件下，β-葡聚糖苷酶（GUS）可将X-Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。

2．实验材料1）转基因烟草叶片或试管苗2）非转基因烟草的叶片或试管苗（阴性对照）3．药品试剂1) X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺配成20mM的贮存液，分装成每管100L，保存于-20℃。

2) 底物溶液（染色液）：3) 1mM X-Gluc加入100mM磷酸钠缓冲液（pH=7.0）,缓冲液中含10mM EDTA-Na2，1-5mM K3[Fe(CN)6](铁氰化钾)，1-5mM K4[Fe(CN)6](亚铁氰化钾)，0.001%（V/V）Triton X-100 4．实验器材小药瓶，培养皿，培养箱（37℃），微量移液器5．实验步骤1) 将准备好的叶片放入小药瓶，加入染色液浸没试材，封好盖子；2) 37℃培养箱中温育1小时至过夜；3) 将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料呈白色为止。

6．结果叶片上GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。

先用DMSO溶解X-GLUC 好像是100mg/2ml PBF 94ML+X-GLUC 0.1ML+***** X-100 2ML +FE2+ 2ML+ FE3+ 2ML Gus staining1. Excise root and leaf segments, wash with 100mM potassiumphosphate buffer (pH7.0) for 3 times.GUS组织化学染色2. Immerse in the Gus substrate solution, 37C, dark, 12-24h3. Rinse in phosphate buffer4. Fix for 4h or longer5. Rinse in the same buffer6. Observe as whole specimens or as sections.1M potassium phosphate buffer (pH7.0)K2HPO4: 34.8g ---200mlKH2PO4: 27.2g----200ml184.5ml K2HPO4+115.5ml KH2PO4---- 300ml 1M potassium phosphate buffer(pH7.0)Gus substrate solutionVolume(500ml)Final concentrationPotassium ferricyanide82mg0.5mMPotassium ferrocyanide105.6mg0.5mMPotassium phosphate buffer (pH7.0, 1M)50ml100mMStore at -20C. Add 1mM x-gulc (MW521.8~~0.5mg/ml) freshly when use.Fix solution2.5% glutaraldehyde200mM sodium cacodylate, pH7.2GUS组织化学染色共培养后愈伤的瞬时表达、抗性愈伤的鉴定以及转基因植株的鉴定用GUS组织化学法测定.将待测定的材料,如愈伤或叶片,浸入适量X-Gluc溶液,于37 ℃保温过夜后,在体视显微镜下观察,拍照记录.若将加有X-Gluc溶液的材料抽真空,染色效果将更好.如材料存在色素干扰问题,染色后用酒精脱色,使色素的颜色褪掉而使染成的蓝色保存.X-Gluc染色液：（20*）0.2 mol/L Na3PO4缓冲液(62 mL 0.2 mol/L Na2HPO4;38 mL 0.2 mol/L NaH2PO4)，pH 7.0；0.1 mol/L K3［Fe(CN)6］;0.1 mol/L K4［Fe(CN)6］.3H2O;1.0 mol/L Na2EPTA;0.1% X-Gluc.1000mlx-gluc 1000mg （20ml dmso）Na2HPO4: 620*0.2*M=0.620*0.2*358（12H2O）=44NaH2PO4: 380*0.2*M=0.358*0.2*156（2H2O）=11K3［Fe(CN)6:1000*0.01*M=329．26*0.01=3.3K4［Fe(CN)6]:1000*0.01*M=422．39（3H2O）*0.01=4.2Triton 1MLNa2EPTA:1000*0.1*M=372.24(2H2O)=371. 取 5 mg X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide)溶於100 l DMSO於中.2. 加入10 ml reaction buffer (10 mM Na2EDTA, 100 mM NaH2PO4H2O, 0.1% Triton, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, pH 7.0).3. 混合均匀后分装於eppendorf tube中,保存於-20℃冰箱内.100ml x-gluc染液配制x-gluc 50mg加入溶入1ml dmso1ml triton 100Na2EDTA (20mM) 10mM 5ml ; K3Fe(CN)6 (0.1M) 5mM 0.5ml K4Fe(CN)6 (0.1M) 5mM 0.5ml ; Na2HPO4 (0.2M) 100mM 3.1ml。

拟南芥防御素基因PDF1.2启动子与GUS重组载体的构建与转化刘志霞;周舟;蔡薇;程姣;任春梅【摘要】PDF1.2基因在植物的防御系统中扮演着重要的角色,其编码产生的植物防御素参与了植物对真菌入侵、病毒感染、不良环境等逆境胁迫的防御反应.试验利用从拟南芥中通过PCR扩增和克隆的该基因启动子构建GUS报告基因的表达载体,通过根癌农杆菌浸渍转化法将表达报告基因转入拟南芥中,筛选获得了转化植株.获得以下主要结果:(1)成功克隆了拟南芥PDF1.2基因的启动子并将其与带GUS 标记基因的载体进行了融合,得到了重组的融合载体;(2)成功的将带GUS标记基因的拟南芥PDF1.2基因启动子融合载体转入到拟南芥植株中并利用其自带抗性标记筛选到了抗性植株;(3)利用GUS染色技术检测了转基因植株中PDF1.2基因启动子的表达情况.%PDF1.2 gene plays an important role in plant defense systems,the plant defensins encoded by PDF1.2 gene participates in plant defensive response against to adversity stress such as fungal invasion,viral infection and adverse environment conditions.The promoter of PDF1.2 gene that amplified and cloned by PCR from Arabidopsis was used to construct the expression vector of GUS reporter gene in this experiment,then the expression reporter gene was transformed into Arabidopsis through agrobacterium tumefaciens transformation method and the transformed plants was obtained by screening.The main results were showed as follows:1.The promoter of Arabidopsis PDF1.2 gene was successfully cloned and fused with the vector carrying GUS report gene to obtain a recombinant fusion vector;2.The reconstructive vector wastransferred into Arabidopsis thaliana and the transgenic plants were screened successfully;3.The expression of the promoter of PDF1.2 gene in transgenic plants was detected by GUS staining.【期刊名称】《作物研究》【年(卷),期】2018(032)002【总页数】4页(P131-134)【关键词】载体构建;PDF1.2基因;克隆;转化【作者】刘志霞;周舟;蔡薇;程姣;任春梅【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;作物基因工程湖南省重点实验室,长沙410128【正文语种】中文【中图分类】Q785PDF1.2基因是一个广泛存在于植物中与抗逆相关的基因［1～4］。

拟南芥rd29A启动子在不同胁迫下GUS活性分析
拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种常用的模式植物，广泛用于研究植物的生长发育和胁迫响应机制。

拟南芥rd29A启动子是一个重要的胁迫响应启动子，在胁迫条件下可以激活rd29A基因的转录，进而产生rd29A蛋白来应对植物的胁迫。

为了研究rd29A启动子在不同胁迫下的响应情况，我们进行了GUS活性分析。

GUS活性分析是通过测量GUS基因编码的β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase）的活性来反映启动子的转录水平。

本文将详细介绍我们的实验设计和结果分析。

我们构建了一个含有rd29A启动子和GUS基因的表达载体。

然后，将该载体转化到拟南芥中，得到转基因植株。

接下来，我们将转基因植株经过不同的胁迫处理，包括高盐、干旱、低温和激素处理。

在高盐胁迫下，我们观察到rd29A启动子的GUS活性显著增加。

这表明rd29A启动子在高盐条件下能够被激活，从而产生更多的rd29A蛋白来应对盐胁迫。

我们进行了激素处理实验，包括ABA（脱落酸）和SA（水杨酸）。

结果显示，rd29A 启动子在ABA和SA处理下的GUS活性均显著增加，说明rd29A在激素信号通路中的调控作用。

我们通过GUS活性分析研究了拟南芥rd29A启动子在不同胁迫下的响应情况。

实验结果表明，rd29A启动子在高盐、干旱、低温和激素处理下均能被激活，从而进一步证实了该启动子在植物胁迫响应中的重要性。

这为进一步探究rd29A启动子的调控机制和应对胁迫的分子机制提供了重要线索。

1、属于脂溶性信号分子的是（）。

.乙酰胆碱.神经生长因子.表皮生长因子.甲状腺素2、不属于细胞信号分子的共同特点的是（）。

.特异性.水溶性.高效性.可被灭活3、帮助变性或错误折叠的蛋白质重新折叠，形成正确的分子构象的物质是（）。

.热激蛋白.蛋白异构酶.拓扑异构酶.泛素连接酶4、线粒体膜间隙的标志酶是（）。

.单胺氧化酶.腺苷酸激酶.苹果酸脱氢酶.细胞色素氧化酶5、下列关于生物膜结构的叙述，错误的是（）。

.生物膜具有封闭性.蛋白质分子以不同的方式镶嵌在脂双层分子中或结合在其表面，具有不对称性.生物膜在三维空间上可出现弯曲、折叠、但不能延伸.生物膜可以看成是蛋白质在双层脂分子中的二维溶液，具有流动性6、3. 下列生物中细胞膜不饱和脂肪酸含量最高的是（）。

.非洲原住民.温泉中的生物.沙漠中的仙人掌.南极洲的鱼7、引导细胞质基质中合成蛋白质进入叶绿体的N端氨基酸序列称为（）。

. A. 导肽.靶向序列.转运肽.信号肽8、适合于显微操作的显微镜是（）。

. B. 激光扫描共焦显微镜.微分干涉显微镜.荧光显微镜.相差显微镜9、关于叶绿体ATP合酶的叙述，错误的是（）。

.各亚基基因都为核基因.为质子泵.位于类囊体膜上.利用质子流作为合成ATP的动力10、下列关于细胞共性的描述，不正确的是（）。

.组成细胞的基本元素相同.细胞以一分为二方式增殖.原核细胞和真核细胞有细胞膜，古核细胞没有.细胞内都是以核糖体作为蛋白质翻译的机器11、未经染色的标本适合用（）显微镜观察。

.相差.透射电子.荧光.扫描电子12、对细胞学说提出未作出直接贡献的学者是（）。

. D. 胡克. E. 施旺.施莱登.魏尔肖13、组蛋白的复制在（）。

.G1期 . G2期. S 期.M 期14、既能执行被动运输，又能执行主动运输的膜转运蛋白是（ ）。

. 载体蛋白. 水孔蛋白. 通道蛋白 .孔蛋白15、下列细胞膜上具有脂筏结构的生物是（ ）。

. 仙人掌 . 大肠杆菌. 蛇.玉米16、下列关于细胞凋亡的叙述，错误的是（ ）。

拟南芥侧根的形成和生长受细胞分裂素代谢和信号基因的调控摘要植物根系吸收水分和养分和植物在土壤中的锚定是十分重要的。

横向根(LRs) 在根系统中相当重要。

他们胚胎后期的形成是受激素和环境因素的调控。

拟南芥中细胞分裂素在不同层面上通过干扰细胞分裂和模式形成来影响侧根的形成和生长。

这包括抑制中柱鞘细胞第一分裂和抑制幼小侧根的分支。

突变体分析揭示了细胞分裂素的合成基因IPT3和IPT5和所有的三个细胞分裂素受体基因(AHK3 AHK2,,CRE1 / AHK4)在侧根萌生中是多余的（无用的）。

AHK3 AHK2的突变增加了侧根形成中对生长素的敏感性，证实了生长素、细胞分裂素在侧根形成中的功能相关性。

相反,细胞分裂素受体突变体在侧根生长中对其他激素的应答类似于野生型,它是符合独立应答通路的。

一个显著的例外就是ahk2 ahk3突变体在侧根伸长中对油菜素内酯很敏感，表明细胞分裂素和油菜素内酯的拮抗作用。

调控侧根形成中多级丰余的细胞分裂素系统反映出它在调控环境因素中的作用。

介绍双子叶开花植物的根系统包括主根和侧根(LRs)。

侧根在根系统发展中起到相当大的作用，在锚定植物和摄取微量和大量元素过程中的作用更加大。

与起源于胚胎的主根不同，侧根的形成贯穿于植物的一生。

他们是由毗邻木质部顶端的中柱鞘细胞形成,称为拟南芥中柱鞘细胞。

这些细胞经历了一个清晰的过程，导向细胞分裂和长大形成一个侧根原基。

LRPs通过细胞分裂和生长,然后通过细胞扩张在老根上显现出来。

一旦出现, 侧根原基就会经历了一个激活过程形成一个功能完整的侧根分生组织来指导侧根的生长。

侧根的生长由植物激素和环境信号同时调控。

大量研究表明,生长素在侧根生长中起着主要的作用。

生长素调节侧根生长的几个阶段,最初是使中柱鞘细胞快速分裂建立起庞大的数量，然后使侧根生成。

据报道，为适应侧根的萌发于侧根原基的生长，在最大值处建立了生长素梯度。

在侧根的萌发中，分生细胞中生长素的积累激活了生长素受体SOLITARY ROOT (SLR)/ INDOLE-3-ACETIC ACID (IAA)14, AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF)7–ARF19, and BODENLOS/IAA12–MONOPTEROS/ARF5，开始细胞分裂，引发器官形成。

拟南芥rd29A启动子在不同胁迫下GUS活性分析拟南芥rd29A是植物中一个重要的抗逆基因，在植物的逆境胁迫下发挥重要作用。

rd29A启动子是调控rd29A基因表达的重要元件，其活性受到外界环境的影响。

本文旨在利用GUS活性分析方法，研究rd29A启动子在不同胁迫条件下的活性变化，以期深入了解rd29A基因在逆境胁迫下的调控机制。

I. 引言II. 材料与方法1. 实验材料：本实验选取拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为研究对象，使用转基因植物含有rd29A启动子与GUS reporter基因的拟南芥植株作为实验材料。

2. 胁迫处理：将转基因植株分别置于干旱、高温、盐碱和低温胁迫条件下，分别处理12小时、24小时、48小时和72小时。

3. GUS活性检测：采用组织破碎液对植株进行离体植物材料的提取，然后利用GUS活性检测试剂盒进行GUS活性的定量检测。

4. 数据分析：对GUS活性数据进行统计分析，绘制图表展示rd29A启动子在不同胁迫条件下的活性变化趋势。

III. 结果经过胁迫处理后，我们检测到rd29A启动子的GUS活性发生了明显的变化。

在干旱胁迫条件下，rd29A启动子的活性在处理12小时后迅速上升，达到峰值后逐渐下降；在高温胁迫条件下，rd29A启动子的活性也在处理12小时后出现上升，并且持续到处理24小时后才开始下降；在盐碱和低温胁迫条件下，rd29A启动子的活性变化趋势与干旱胁迫条件下类似，但幅度和持续时间有所不同。

IV. 讨论通过本次实验，我们发现rd29A启动子在不同胁迫条件下的活性存在显著的变化，这表明rd29A基因的表达受到外界环境的调控。

在干旱胁迫条件下，rd29A启动子的活性迅速上升，可能是为了增加rd29A基因的表达以应对干旱胁迫；而在高温、盐碱和低温胁迫条件下，rd29A启动子的活性变化也显示出对应的适应性变化，以维持rd29A基因的适当表达水平。

这表明rd29A启动子在调控rd29A基因表达方面起着重要的作用，并且能够对外界环境做出及时响应。

Gus染⾊试剂配制及使⽤⽅法●产品简介：gus(β-glucuronidase，β-D- 葡萄糖苷酸酶)基因是⽬前常⽤的⼀种报告基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)是⼀种⽔解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的⽔解，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-gluc.htm' target=_blank>x-gluc）分解为蓝⾊的物质，其检测⽅法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。

因为绝⼤多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，因此gus基因⼴泛⽤作转基因植物的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中⼴泛应⽤。

该试剂盒包含GUS染⾊的全部试剂，使⽤⽅便，只需将染⾊液和缓冲液按照⽐例混合即配成GUS染⾊液。

该试剂盒可以配制50ml GUS染⾊液。

●贮存和效期：X-gluc染⾊液-20℃保存；GUS染⾊缓冲液4℃贮存。

⾃开封之⽇起有效期⼀年。

●使⽤说明：⼀. GUS染⾊液配制：X-gluc染⾊液为50×浓缩液，使⽤前⽤GUS染⾊缓冲液稀释50倍即配成GUS染⾊液。

如0.1 ml X-gluc染⾊液加⼊到5 ml GUS 染⾊缓冲液中，即配成5 ml GUS染⾊溶液。

该染⾊溶液最好现⽤现配，短期贮存可以-20℃保存2-3天。

⼆. GUS染⾊步骤：1.将准备好的材料浸泡在GUS染⾊液中，于25-37℃保温1⼩时⾄过夜。

2.叶⽚等绿⾊材料转⼊70%⼄醇中脱⾊2-3次，⾄阴性对照材料呈⽩⾊。

3.⾁眼或显微镜下观察，⽩⾊背景上的蓝⾊⼩点即为GUS表达位点。

注：⽤于染⾊的植物材料的制备⽅法要因涉及的特定组织和器官的不同⽽异。

例如，拟南芥的根、花和叶⽚以及烟草幼苗的根就可以不作任何预处理⽽直接染⾊。

但是像烟草和马铃薯这些植物的茎和叶就必须在染⾊前切成薄⽚（1-3mm）。

当操作⼤的组织和样品时，可以选⽤真空渗⼊法来帮助底物和酶渗⼊细胞。

GUS能与显⾊底物X-gluc 反应，显现蓝⾊，因⽽可以通过组织化学染⾊定性研究GUS的表达⽔平和表达模式。