免疫组织化学及HE染色实验步骤复习过程

免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学和HE（Hematoxylin and Eosin）染色是常用的组织学研究技术。

免疫组织化学用于检测组织中特定抗原的表达，可以帮助研究者了解细胞和组织的功能和性质。

HE染色则是常用的常规组织染色方法，用于观察组织的形态学特征。

下面将分别介绍免疫组织化学和HE染色的实验步骤。

1.获取组织标本：首先，需要获取要研究的组织标本，可以是活体组织或固定的组织。

固定的组织标本一般使用10%缓冲福尔马林进行固定。

2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。

切片厚度一般为3-5微米。

3.去蜡：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，使组织切片恢复水化。

4.抗原修复处理：将切片放入抗原修复液中，通过高温或酶解方法进行抗原修复处理，使细胞或组织中的抗原保持完整。

修复液的选择和具体实验要求有关。

5.阻断非特异性结合：将切片浸入阻断液中，阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。

6.一抗孵育：将合适浓度的一抗溶液加到切片上，使其孵育一段时间。

根据要检测抗原的性质选择合适的一抗。

7.二抗孵育和信号增强：将与一抗结合的二抗溶液加到切片上，同时可以加入信号增强剂，提高检测灵敏度。

8.反应显色：将切片加入显色液中，使阳性细胞或组织部分显示出颜色反应。

常用的显色方法有原位杂交、过氧化物酶法和碱性磷酸酶法等。

9.脱水和封片：经过显色后，将切片在酒精中进行脱水处理，然后用透明介质嵌片，并保护封片，以便于观察。

HE染色的实验步骤如下：1.获取组织标本：同样，首先需要获取组织标本，可以是活体组织或固定的组织。

2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。

切片厚度一般为3-5微米。

3.去蜡和水化：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，然后用醇和水进行水化，使组织切片恢复水化。

4.酸性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用血红素作为酸性染料，将细胞核染成蓝色。

5.碱性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用溴化钡和噻唑蓝作为碱性染料，将细胞质和胞浆染成红色。

组织固定及HE染色步骤
1、固定：刚取的新鲜组织块经福尔马林溶液固定48小时（一般固定2天）
2、用镶子取出放到大的蜡盒上，用刀片切成1*0.5厘米的小块，用小白蜡盒包上，放入80%
的乙醇中过夜
3、脱水：第二天早上8点，把蜡盒依次放入95% I的乙醇中（3h）— 95%II的乙醇中（3h）
—100% I的乙醇中（3h）— 100%II的乙醇中（过夜）
4、透明：第二天早8点从100%11的乙醇中取出小蜡盒放到二甲苯1、二甲苯II中各30 分钟
5、浸蜡：放入蜡缸中I、II、IIL中各浸泡30分钟
6、包埋
7、切片
8、烤片
HE染色
二甲苯 I （30min）—二甲苯II （30min）一100% I 的乙醇中（lOmin）一 100%II 的乙醇中（lOmin） 95%的乙醇中（5min）— 90%的乙醇中（5min）— 80%的乙醇中（5min）—自来水缸中浸泡5min —苏木精染核5min —水洗一1%的盐酸酒精分化一水洗一弱氨水返蓝一水洗一镜下观察一伊红染质（15min）—水稍洗一80%的乙醇、95%的乙醇I、95% 的乙醇II中各过一下即可一100% I的乙醇中（5min）— 100%II的乙醇中（lOmin）—二甲苯I （lOmin）一二甲苯II （lOmin）一中性树胶封片
免疫组化步骤
切片常规脱蜡至水洗预处理（热修复或酶消化）阻断3%的H202 PBS洗封闭加一抗（鼠或兔抗人） PBS洗加二抗（生物素标记IgG鼠或兔））PBS洗加三抗（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）PBS洗DAB（AEC或BCIP/NBT）显色水洗复染核水洗弱氨水返兰水洗脱水透明封片。

HE染色实验步骤染色实验是生物学中常用的染色技术，用于观察细胞结构、细胞器和染色体等生物学特征。

在这个实验中，我们将使用HE染色法来染色细胞和组织切片。

HE染色法是最常用的组织染色方法之一，用于观察组织结构和组织细胞的形态。

以下是HE染色实验的步骤：1.准备组织标本在进行染色实验之前，首先需要准备好需要染色的组织标本。

组织标本可以是新鲜的组织样本，也可以是已固定和包埋的组织切片。

在准备组织标本时，需要确保组织标本的质量和完整性，以保证染色结果的准确性。

2.制备切片将组织标本切割成薄片，通常厚度在5-10微米之间。

为了获得更好的染色效果，切片应该尽可能薄且均匀。

切片可以使用切片刀或者切片机进行切割。

切片完成后，将切片放在载玻片上，待干燥。

3.脱脂和脱水将切片放入甲醇中脱脂，去除切片中的脂肪物质。

脱脂时间一般为1-2分钟。

脱脂完成后，将切片依次浸入95%乙醇、70%乙醇和蒸馏水中进行脱水处理，时间每次均为1-2分钟。

脱水处理的目的是去除切片中的水分，以便后续染色。

4.染色处理将脱水后的切片依次浸入hematoxylin染料、蒸馏水、酸性洗涤剂和eosin染料中进行染色处理。

hematoxylin染料用于染色细胞核，eosin染料用于染色胞质。

染色时间根据实验需要，通常为1-10分钟。

染色完成后，将切片洗净并进行脱水处理。

5.脱水和封片将染色后的切片依次浸入70%乙醇、95%乙醇和透明剂中进行脱水处理。

脱水完成后，将切片放入透明剂中进行透明化处理，以使组织切片更加透明。

最后，将切片放入显微镜载玻片上，加入透明胶封片，并静置干燥。

6.观察和记录将封片好的切片放入显微镜中，用适当的倍数镜头观察组织结构和细胞形态。

观察时，可以记录下细胞核的形态、胞质的颜色和组织结构等信息。

通过观察和记录，可以得到关于组织和细胞的详细信息，为后续研究和分析提供参考。

7.结果分析根据观察和记录的结果，对染色切片进行分析和比较。

HE染色与免疫组化实验步骤：1) 取材与固定用小号解剖针挑取一定量本室培养之成螨，雌雄各半，用PBS洗去培养物后用擦镜纸包裹，常温浸没于Bouin固定液中24小时。

2) 盐酸预处理固定后的粉尘螨以PBS清洗后挑入4％的盐酸溶液中浸泡半小时。

3) 琼脂预包埋A. 配置1.5％琼脂溶液，微波炉中加热至完全溶解，稍冷却后注入自制包埋器。

B. 将盐酸处理后的粉尘螨以PBS清洗后挑入琼脂溶液中，让其自然凝固。

C. 解剖镜下修整琼脂块，形成边长与虫体对称轴相一致的长方体，虫体位于琼脂块中央。

4) 脱水、透明与浸蜡A. 将预包埋的尘螨置于50％乙醇中2小时（中间换液一次），然后置于70％乙醇中室温过夜。

B. 第二天取出后依次入梯度乙醇脱水并以二甲苯透明：80％乙醇I（1小时）80％乙醇II（1小时）95％乙醇I（30分钟）95％乙醇II（30分钟）100%乙醇I（15分钟）100%乙醇II（15分钟）乙醇：二甲苯（1：1）混合液（10分钟）二甲苯I、II透明（共约15分钟）镜下观察至虫体透明即可终止c．将经透明的琼脂块取出，按如下流程浸蜡：二甲苯：塑化石蜡（1：1）混合液（10分钟）塑化石蜡I、II、III（各一小时）5) 塑化石蜡包埋折叠大小适中的纸盒进行包埋。

用镊子轻轻夹取琼脂块，置于纸盒底部并注满石蜡。

解剖镜下迅速摆正琼脂块的位置，以便准确选取不同的方向进行切片。

待蜡块表面稍凝固后，连同纸盒一起沉入水中，使其迅速冷却。

6) 切片与展片先对蜡块进行修整，使其边与琼脂块的边相平行。

使用手摇轮转式切片机，调整切片厚度为4-6μm，连续切片。

将恒温水浴箱加热至45℃左右，同时将已包被Poly-L-lysine的载玻片预热。

在载玻片上滴加少许温水，截取适当长度的蜡带，在载玻片上进行展片。

晾干后置于60℃烤箱中2小时，使蜡带贴附牢固。

7) HE染色按常规方法进行染色。

由于尘螨体积微小，在染色过程中容易掉片，而且各组织嗜染性不同，故在试验中对各步骤进行了一些调整，获得较满意的效果。

HE染色方法与步骤吐血整理染色是一种常见的实验技术，用于观察和分析生物样品中的细胞或组织结构。

HE染色是一种常用的组织和细胞染色方法，它能够同时染色细胞核和细胞质，因此得名HE（hematoxylin and eosin）染色。

下面是HE染色的步骤：1.染色前的准备工作：-选择合适的组织样品，通常是已固定和包埋的组织切片。

-准备好需要使用的试剂和设备，包括显微镜玻片、切片刀、染色盘、醇和蜡解剂、染色液和显微镜。

-将切片从包埋蜡中去蜡，并通过浸泡在蜡解剂中来溶解蜡质。

2.组织切片的处理：-将组织切片通过水洗涤，去除蜡解剂和剩余的蜡质。

-将切片通过不同浓度的醇溶液进行脱水处理，使得切片逐渐转移到无水状态。

-将脱水处理后的切片通过透明质量更好的试剂（如亚硫酸氢钠或甘油）进行透明处理，以利于细胞的观察。

3.组织切片的染色：-首先进行碱性染色，即将切片浸泡在染色盘中的伊洛酮溶液中，伊洛酮是一种天然的染色物质，能够与细胞核结构中的DNA结合，使细胞核染色为暗蓝色。

-然后进行酸性染色，即将切片浸泡在染色盘中的苏木精溶液中，苏木精是一种带正电荷的染色物质，能够与细胞质结构中的负电荷部分结合，使细胞质染色为粉红色。

4.组织切片的脱水和封片：-将染色后的切片通过不同浓度的醇溶液进行脱水处理，使得切片从水状态逐渐转移到无水状态。

-将切片在醇溶液中固定一段时间，然后转移到透明的试剂（如苏木精和二甲苯混合溶液）中进行浸泡。

- 最后将切片取出，放在显微镜玻片上，滴入固定剂（如Canada Balsam）并加盖玻片，使切片固定在玻片上。

5.显微镜观察和分析：-使用显微镜观察染色后的组织切片，并通过不同增大倍数的镜头进行详细观察。

-根据观察到的细胞和组织结构，进行分析和研究，并将观察结果记录下来。

需要注意的是，HE染色是一种简单、快速且广泛应用的染色方法，但在不同类型的组织和细胞中可能会有不同的染色效果。

因此，在进行HE染色时，需要根据具体实验要求和样品的特点，进行相应的优化和调整。

HE染色步骤：1.脱蜡至水（二甲苯1、二甲苯2、二甲苯3各15分钟；100%酒精1、100%酒精2、95%酒精1、95%酒精2各5分钟；90%酒精3分钟；80%酒精2~3分钟），自来水冲洗（洗酒精的）2.苏木素染色5分钟，自来水冲洗，1%的盐酸乙醇分化（处理结合过多的苏木素），自来水冲洗，返蓝液返蓝（使胞核更加蓝化），自来水冲洗，伊红染色1.5~2分钟，自来水快速冲洗3.脱水（80%、90%、两个95%涮洗即过，两个100%各3~5分钟）4.二甲苯透明：二甲苯1、二甲苯2、二甲苯3各2分钟5.封片：盖玻片免疫组化染色：1.脱蜡至水（二甲苯1、二甲苯2、二甲苯3各15分钟；100%酒精1、100%酒精2、95%酒精1、95%酒精2各5分钟；90%酒精3分钟；80%酒精2~3分钟），自来水冲洗（洗酒精的）2.抗原修复：根据抗体说明书，选择抗原修复液（分两种：一、柠檬酸修复液配方——A柠檬酸钠29.41g溶入1000ml蒸馏水、B柠檬酸21g溶入1000ml蒸馏水，取A液41ml+B液9ml+450ml蒸馏水，测PH6.0，把配好的修复液放入高压锅里，开始加热待修复液沸腾后，将脱蜡好的片子放入耐高温的修复夹中，一起放入高压锅里，盖好锅盖等待锅嗤嗤响时，开始计时1分40秒），时间到后关火，把锅放入水池中降温，开小水冲洗缓慢降温，等锅凉后把锅打开，取出修复夹，自来水冲洗。

画圈（画圈笔或石蜡，目的节省抗体）3.3%过氧化氢封闭（针对石蜡切片中的红细胞），0.3%过氧化氢封闭（针对冰冻切片和爬片的红细胞），20分钟4.PBS洗5*3分钟，PBST涮洗，0.15%的triton破膜（30分钟），PBS洗5*3分钟，PBST涮洗，加二抗来源的血清（45分钟~1小时）5.甩掉血清加一抗，4度（18~24小时）或室温3~4小时，室温复浴45分钟~1小时6.PBS洗5*5分钟，PBST涮洗，加二抗（30分钟），PBS洗5*5分钟，PBST涮洗，加三抗（20分钟），PBS 洗5*3分钟，PBST涮洗，DAB显色（5~10分钟），自来水终止，苏木素衬染，自来水冲洗，1%盐酸乙醇分化，自来水冲洗，返蓝液返蓝，自来水冲洗，脱水、透明、封片。

HE染色加免疫组化方法组织块石蜡包埋的步骤：1.取材：尽量活杀，在处死30min内取材完毕，组织块的大小一般为（1.0-1.5cm）*1.0cm*(0.2-0.3cm)2.固定：常用甲醛液浓度为4%，是40%甲醛溶液和水按1:9比例配制而成。

固定时间以12-24h为宜。

（4℃冰箱可放置1-3个月）3.冲洗：将组织块放在固定的容器中用流水冲洗24h.4.脱水：一次70%酒精2h, 80%酒精2h, 90%酒精1h, 95%酒精40min,无水乙醇Ⅰ40min, 无水乙醇Ⅱ30min。

可将组织放于70%酒精中过夜。

5.透明：将脱水后组织直接浸入二甲苯透明剂中（二甲苯Ⅰ, 二甲苯Ⅱ），每次透明为10min。

6.浸蜡：常规制片常用熔点高于56℃以上的石蜡，普通采用56℃-58℃石蜡。

先将组织浸入软蜡Ⅰ1h左右, 再浸入软蜡Ⅱ40min；硬蜡Ⅰ40min, 硬蜡Ⅱ1h。

（一般浸蜡时间为3-4h）软蜡熔点为45℃-50℃，硬蜡熔点为55℃-60℃。

7.包埋：将蜡液注入包埋硬具中，迅速将组织块平放入蜡液中，摆正并铺平，然后移至冷却台，使组织块同蜡液凝固在一起的过程。

（硬蜡凝固定型）石蜡切片法：在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为“修块”），但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。

一般切片厚度为4-6μm。

贴片时先在干净的载玻片上涂一层蛋白甘油，然后于60℃恒温箱中烘烤1h，若未烤干可适当延长时间；若组织剥脱可涂一层蛋清加以固定。

做免疫组化时，玻片应涂多聚赖氨酸，亦可买防脱玻片。

HE染色的步骤：二甲苯Ⅰ5-10min→二甲苯Ⅱ5-10min→无水乙醇Ⅰ1-3min→无水乙醇Ⅱ1-3min→90%酒精1min→80%酒精1min→70%酒精1min→水洗→苏木精3-5min→水洗→盐酸酒精1-3s→水洗→饱和碳酸锂（氨水）10-30s→水洗→伊红3-5min→水洗（短）→70%酒精1-2s→80%酒精3-5min→90%酒精3-5min→95%酒精3-5min→无水乙醇5-10min→二甲苯Ⅰ3-5min→二甲苯Ⅱ3-5min→中性树胶封片染色液的配制：1.Harris苏木精的配制苏木精 1g硫酸铝钾 15g无水乙醇 10ml蒸馏水 200ml先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。

免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学（immunohistochemistry，简称IHC）是一种用于检测组织切片中特定蛋白质的方法，其原理是通过特异性抗体识别目标蛋白质并将其可视化。

本文将介绍IHC实验的基本步骤和HE染色实验的步骤。

IHC实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。

2.抗原修复：将组织切片放入含有钠胼胝土缓冲液或其它抗原修复液中进行抗原修复。

可以选择使用高温或酶解等方法。

3.阻断非特异性结合：将组织切片浸泡在阻断液中，如BSA、牛血清蛋白等，以防止抗体与非特异性的蛋白质结合。

4.一抗孵育：将含有一抗的抗体溶液滴在组织切片上，孵育一段时间，使一抗与目标蛋白质发生特异性结合。

5.二抗孵育：选择与一抗宿主不同的二抗标记物，如荧光素、过氧化物酶等，将含有二抗的溶液滴在组织切片上进行孵育。

6.吸附剂清洗：将组织切片用洗涤缓冲液洗去未与标记物结合的二抗。

7.标记物检测：根据所选择的标记物，可以进行荧光显微镜观察、酶反应等，将目标蛋白质可视化。

8.盖片封装：将组织切片用适当的缓冲液封装至玻璃盖片上。

HE染色实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。

2.脱蜡：将组织切片放入甲醇中脱去石蜡包埋。

3. 染剂处理：将组织切片依次浸泡在嗜铬酸钾溶液中，漂洗后浸泡在碱性染剂中，如伊红（Eosin）染料。

4. 酸性染剂处理：将组织切片浸泡在酸性染剂中，如苏木红（Hematoxylin）染料。

5.脱染：将组织切片用酒精和醋酸溶液进行脱染。

6.脱水：将组织切片依次浸泡在酒精梯度中，脱去水分。

7.透明化：将组织切片逐渐浸泡在透明剂中，如苯酚乙醇、二甲苯等，使组织切片透明。

8.盖片封装：将组织切片用适当的透明剂封装至玻璃盖片上。

以上是免疫组织化学和HE染色实验的基本步骤。

通过这些步骤，可以标记和可视化组织切片中的特定蛋白质，进而获得研究和诊断所需的信息。

免疫组化HE染色步骤免疫组化和HE染色是在病理学中常用的技术，用于对组织样本进行分析和诊断。

下面将详细介绍免疫组化和HE染色的步骤。

免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过使用抗体来检测组织样本中特定抗原的技术。

它可以用于确定细胞或组织中特定蛋白质的位置和表达水平。

免疫组化主要包含以下步骤：1.取得组织样本：首先需要从患者的切除组织或活检组织中获取样本。

样本通常以固定和包埋的形式保存在蜡块中。

2. 切片：将蜡块切割成非常薄的切片（通常为4-5um）。

这些切片通常被放置在载玻片上。

3.去蜡和脱水：跳过这一步，因为该步主要是用于从蜡中去除组织样本。

已经固定在切片上的组织样本无需这一步。

4.抗原检出：在这一步中，需要使用一种抗体来标记想要检测的抗原。

这个抗体会与目标蛋白质结合，并形成一种可以用来检测的复合物。

5.清洗：使用缓冲液对切片上的抗体复合物进行清洗，以去除未结合的抗体。

6.显色：在这一步中，需要使用一种可独特识别的物质来标记已结合的抗体。

典型的显色素有DAB、VIP等。

7.顶气及封片：使用适当的溶剂和覆盖剂对切片进行顶气和封片，以保护其结构并使其可供观察。

通过观察组织样本中的抗原的显色情况，可以确定抗原在组织中的分布和表达水平。

免疫组化广泛应用于病理学诊断中，可以帮助医生进行肿瘤分类、病理分级以及预后评估等。

HE染色（Hematoxylin and Eosin staining）是一种常用的组织染色技术，主要用于病理学的初步观察和诊断。

HE染色主要包含以下步骤：1.取得组织样本：与免疫组化相同，首先需要从患者的切除组织或活检组织中获取样本。

样本通常以固定和包埋的形式保存在蜡块中。

2. 切片：将蜡块切割成非常薄的切片（通常为4-5um）。

这些切片通常被放置在载玻片上。

3.去蜡和脱水：类似于免疫组化，这一步主要用于从蜡中去除组织样本。

4.染色：在这一步中，使用两种染色剂：血红素和紫杉醇。

HE染色操作流程HE染色（Hematoxylin and Eosin Staining）是一种常用的组织学染色方法，用于观察和诊断组织学切片。

HE染色通过染色剂HE染料的组合，使细胞核染成紫色，胞质染成粉红色，从而揭示组织的结构与形态。

HE染色的操作流程一般包括标本处理、脱水、透明化、分解蜡和染色五个步骤。

下面将详细介绍每个步骤的具体操作。

1.标本处理：首先，将切割好的组织标本放入10%中性缓冲福尔马林进行固定，一般固定时间为24-48小时。

固定后，将组织标本转移到70%乙醇中进行离子交换，使组织中的水分逐渐去除。

2.脱水：将固定的组织标本依次转移到浓度逐渐提高的乙醇溶液中，如80%乙醇、95%乙醇和绝对乙醇，每个乙醇浓度保持15-30分钟。

这个过程称为脱水，目的是逐渐去除组织中的水分，使组织内的乙醇浓度逐渐升高。

3.透明化：将脱水后的组织标本依次转移到透明剂中，如苯并三氮唑、次氯酸、二氯甲烷等。

每种透明剂浓度和时间要根据实验需求进行调整，这个步骤的目标是使组织中的乙醇慢慢溶解，透明度增强。

4.分解蜡：将透明后的组织标本转移到蜡纸中，加热到60-65°C的融点，使固定的组织标本逐渐融化。

蜡纸是由石蜡和植物油混合而成，有助于固定和保护组织的形态。

5.染色：将脱蜡的组织标本依次转移到碱性染料（如血红素）溶液中，染10-15分钟，然后洗净；接着将组织标本转移到酸性染料（如紫杉醇）溶液中，染5-10分钟，然后洗净。

紫杉醇染料使细胞核染色成紫色，血红素染料使细胞胞质染色成粉红色。

最后用安全过滤垫将组织标本封装在玻片上，去除水分，然后用覆盖玻片进行固定。

骨组织石蜡切片制作步骤：1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲液内固定12—24h。

2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h.3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。

4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。

5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I1小时，石蜡II1小时。

6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。

7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。

免疫组化检测步骤：1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min二甲苯1（10min）二甲苯2（10min）。

2.水化：100%酒精1（2min）100%酒精（2min）95%酒精（2min）80%酒精（2min）70%酒精(2min)。

3.PBS冲洗3次，每次5min.。

4.抗原修复：将组织片置0.01M的柠檬酸缓冲液（PH6.0）中煮沸15min,自然冷却至室温。

5.PBS冲洗3次，每次5min。

6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活性。

7.PBS冲洗3次，每次5min。

8.滴加1抗（GFP1：100稀释,4℃过夜）9.PBS冲洗3次，每次5min。

10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min,PBS冲洗3次，每次5min。

11.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min,PBS冲洗3次，每次5min。

12.DAB显色5min。

13.自来水冲洗10min。

14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。

15.自来水冲洗10min。

16.常规脱水，透明，封片，镜检。

HE染色试剂配置A：0.5~1%的伊红酒精溶液：称取伊红Y0.5~1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。

以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。

B：苏木素染液配方：(配制3000ml，可按比列减少)苏木精6g无水乙醇100ml硫酸铝钾150g蒸馏水2000ml碘酸钠1.2g冰醋酸120ml甘油900ml配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。

C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。

染色流程(1)二甲苯（Ⅰ）15min(2)二甲苯（Ⅱ）15min（3）二甲苯：无水乙醇=1:12min(4)100%乙醇（Ⅰ）5min(5)100%乙醇（Ⅱ）5min(6)80%乙醇5min(7)蒸馏水5min(8)苏木精液染色5min(9)流水稍洗去苏木精液1-3s(10)1%盐酸乙醇1-3s(11)稍水洗10-30s(12)蒸馏水过洗1-2s(13)0.5%伊红液染色1-3min(14)蒸馏水稍洗1-2s(15)80%乙醇稍洗1-2s(16)95%乙醇（Ⅰ）2-3s(17)95%乙醇（Ⅱ）3-5s(18)无水乙醇5-10min(19)石炭酸二甲苯5-10min(20)二甲苯（Ⅰ）2min(21)二甲苯（Ⅱ）2min(22)二甲苯（Ⅲ）2min(23)中性树胶封固注：①第（11）、（12）步可省去，（13）步冲水时间需延长至20-30min。

②第（21）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。

*冷冻切片HE染色步骤：（1）冰冻切片固定10～30s（2）稍水洗1～2s（3）苏木精液染色（60℃）30～60s（4）流水洗去苏木精液5～10s（5）1%盐酸乙醇1～3s（6）稍水洗1～2s（7）促蓝液返蓝5～10s（8）流水冲洗15～30s（9）0.5%曙红液染色30～60s（10）蒸馏水稍洗1～2s（11）80%乙醇1～2s（12）95%乙醇1～2s（13）无水乙醇1～2s（14）石炭酸二甲苯2～3s（15）二甲苯（Ⅰ）2～3s（16）二甲苯（Ⅱ）2～3s（17）中性树胶封固。

免疫组织化学及HE染色实验步骤1.取得组织标本：首先需要从患者或动物身上获得组织标本。

在手术过程中或尸检后，将组织标本取出并固定。

2.标本处理：将取出的组织标本进行固定处理，常用的固定剂有10%的中性缓冲甲醛。

需要将标本完全浸泡在固定液中，并确保标本完整。

3.嵌入和切片：将固定处理后的组织标本进行脱水和透明处理，然后用蜡块将其嵌入。

嵌入后的标本可以使用旋转式微切机进行切片，切片厚度通常为4-6微米。

4.脱蜡：将蜡包围的组织切片放入脱蜡剂中，蜡会被溶解并去除，以使细胞可被染色剂染色。

5.抗原检出：用特异性抗体结合试剂来检测组织中的特定抗原。

将切片在温床上恢复，然后用蛋白酶消化膜蛋白，以增强抗原的敏感性。

之后，使用特定的一抗（主抗体）与待检测的抗原结合，形成特异性抗原-抗体复合物。

6.二抗检出：使用特异性标记的二抗来检测抗原-抗体复合物。

通常，二抗为小鼠单克隆抗体，与抗体结合后，可通过酶标记法、光学染色或荧光染色等方法来检测二抗信号。

7.显色和镜检：通过给予染色剂，如DAB和H2O2溶液，产生可见的显色反应。

显色后的标本可以用显微镜进行观察和评估。

HE染色实验步骤：1.取得组织标本：与免疫组织化学实验类似，首先需要从患者或动物身上获得组织标本。

2.标本处理：将取出的组织标本进行固定处理，使用10%的中性缓冲甲醛溶液进行固定。

需要将标本完全浸泡在固定液中，并确保标本完整。

3.组织处理：将固定处理后的组织标本进行脱水，以至能够与石蜡亲和。

4.嵌入和切片：将脱水的组织标本注入熔化的石蜡中，以便于嵌入。

然后，使用旋转式微切机将嵌入后的标本切为薄片，厚度通常为4-6微米。

5. 脱蜡和染色：将蜡包围的组织切片放入脱蜡剂中，蜡会被溶解并去除，以使细胞可被染色剂染色。

接下来，将切片放入hematoxylin染色剂中，染出细胞核的蓝色。

6. 酸性染色：将切片转移到eosin染色剂中，以染出细胞质和胞外基质的红色。

7.脱水和渗透：将染色后的切片依次浸泡在动物级乙醇溶液中，然后放入橄榄油中进行清晰度处理。

二十四、HE染色：1›伊红染液配方：称取伊红2 g，溶于5 ml 蒸馏水，逐滴加入冰醋酸，边加边搅拌至糊状，再加入数毫升蒸馏水，继续滴加冰醋酸至沉淀不再增加，过滤，将沉淀和滤纸一起置于50-60℃温箱中烘干，溶于400 ml 95%的酒精中。

2›苏木精染液配方：A液：苏木精2 g ；无水乙醇250 ml 。

B液：钾矾（硫酸铝钾）17.6 g；水750mL 。

具体步骤：分别按以上配方配好A液和B液，并混合后加入碘酸钠0.2g，冰醋酸20mL染液配好后，将瓶口用裹着棉花的纱布塞紧，放在暗处通风的地方，并经常摇动以促进它的成熟。

成熟时间约1个月。

此染液需要提前1个月配置好，备用，如果想要促进它的成熟，可在染液里加入0.2 g碘酸钠。

此染液染核效果良好，染色均匀，不会发生沉淀，而且可以长期稳定保存。

此染液可同时与伊红等进行细胞的染色。

整个染色过程包括五个内容：脱蜡复水、染色、脱水、透明和封片。

1›脱蜡复水：a. 65℃温箱烤片30min后, 石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5~10min,b. 石蜡切片依次各级浓度酒精复水：经100%酒精→100%酒精→95%酒精→80%酒精→70%酒精→50%酒精→蒸馏水，各1-2 min。

2›染色：a. 苏木精染色约4min。

染色时间主要根据染色剂的成熟度以及室温高低，可以适当缩短或延长（现在的成熟度4min左右）。

b. 水洗5-10minc. 脱水Ⅰ切片经50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇，各1-2 min。

d. 复染伊红染色10s-20s ，着色以较浅为宜。

3›脱水Ⅱ：用95%乙醇洗去切片多余的红色，然后放入100%无水乙醇两次各1.5 min，共3min。

4›透明：切片依次经乙醇-二甲苯等量混合液1.5min、纯二甲苯Ⅰ5min、Ⅱ5min。

二甲苯要定期更换，切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。

5›封片滴加中性树胶，注意组织不能有气泡。

HE染色实验步骤HE染色是一种常用的细胞染色方法，用于染色细胞核和胞质。

以下是HE染色实验的详细步骤：1.组织样本的固定：将组织样本（如组织切片）固定在玻片上，以使其保持形态和结构。

常见的固定剂有甲醛、乙醇等。

将切片置于固定剂中浸泡一段时间，通常为24小时。

2.脱水：将固定的组织样本进行脱水处理，以去除其中的水分。

脱水过程常采用不同浓度的乙醇溶液，从低浓度到高浓度逐渐浸泡，通常为70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇和绝对乙醇。

每个乙醇浓度的浸泡时间可以根据需要调整，但通常为2-3分钟。

3.渗透：为了使切片更容易与染料接触并吸收，需要对其进行渗透处理。

常见的渗透剂是亚麻酸，通常在乙醇浓度为90%时进行处理。

将切片放入亚麻酸中浸泡2-3分钟。

4.包埋：将渗透处理后的组织切片逐步置于熔蜡中，使其被包裹在蜡中。

可用化学品如戊二醛蜡、乙蜡等作为包埋材料。

首先，将切片置于低熔点蜡中，如55-60℃的乙蜡，浸泡30分钟至1小时。

然后，将切片置于高熔点蜡中，如60-65℃的戊二醛蜡，浸泡1小时至数小时。

5.包块切割：将包埋的组织块放在切片机中，用刀片切成薄片。

通常切片厚度为4-5μm。

切好的切片将浮在热水中，并从切片机上取出。

6.切片贴片：使用刷子将切片轻轻移至玻片上。

刷子应先浸泡在水中，然后轻轻刷过切片以避免切片损坏。

7.焙烧：将装有切片的玻片放在干燥器中，或将其放在烘箱中进行干燥。

干燥温度和时间可根据需要进行调整，通常为60-70℃，2-3小时。

8. 染色：使用Harris液体染料进行染色。

HE染色中的染料包括酸性染料苏丹Ⅰ（hematoxylin）和碱性染料伊红（eosin），也称为碱性苏丹染料。

将组织样本浸入苏丹Ⅰ染料中，时间为2-5分钟。

然后将其转移到酸性水中漂洗30秒至1分钟，以去除多余的苏丹Ⅰ染料。

接下来，将样本浸入伊红染料中，时间为1-2分钟。

最后，将样本漂洗并在流水下冲洗。

9.脱色：如果染色后的切片颜色过浓，需要进行脱色处理。

免疫组织化学（immunohistochemistry）1组织脱水、包埋及切片（1）将剥离出瘤组织切成合适大小的组织块放于4%多聚甲醛中固定2天，固定时间最长不能超过1个月；（2）将组织块从固定液中取出，PBS漂洗1h，然后开始进行组织脱水，程序如下：70%乙醇浸泡30min—80%乙醇浸泡30min—90%乙醇浸泡30min—95%乙醇I浸泡30min—95%乙醇II浸泡30min—无水乙醇I浸泡30min—无水乙醇II浸泡30min—无水乙醇III浸泡30min—二甲苯I浸泡30min—二甲苯II浸泡30min；（3）将组织块完全浸泡在蜡液中60℃过夜；（4）打开包埋仪器，设置相应参数，2h后将蜡液中的组织块取出放入包埋机的蜡缸中，将包埋所用铁槽清理干净放入蜡缸，用镊子将组织块放于铁槽正中央，取出铁槽接取少量蜡液使凹槽填满，将包埋盒倒置卡在铁槽上，放于低温工作台上冷却凝固，待其完全凝固后，取下包埋好的蜡块；（5）在切片前，先将蜡块表面修平，切成连续的厚度为5µm的切片，放入冷水中展片，用刀片将连续蜡带分开，然后放入40℃水浴锅中，用防脱载玻片捞出目的蜡带，放入烤片机上过夜，组织切片4℃保存。

2免疫组化染色（1）首先，用二甲苯脱蜡，然后用梯度酒精和水使切片充分复水，详细流程为：二甲苯I浸泡10min—二甲苯II浸泡10min—无水乙醇I浸泡5min—无水乙醇II浸泡5min—90%乙醇浸泡5min—80%乙醇浸泡5min—自来水冲洗5min；（2）抗原修复：微波炉中火预热配制好的枸橼酸缓冲液3min，将切片浸入修复液内，用微波炉中火加热3min，在此过程中注意不要让修复液溢出，以免切片变干，加热后室温冷却5min，加热冷却过程重复3次，修复完成后自然冷却至室温，用PBS清洗3次，每次5min；（3）滴加适量的3% H2O2覆盖组织，室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，摇床上PBS清洗3次，每次5min；（4）用PBS配制5%的山羊血清，滴加适量至组织上封闭1h；（5）封闭结束后，甩干载玻片，用吸水纸吸去残留液体，将载玻片放人湿盒内，滴加由5%山羊血清稀释的一抗，一抗液体要完全覆盖组织，放入4℃冰箱内孵育过夜；（6）将组织切片从冰箱中取出，放于室温静置至室温，用PBS摇床清洗3次，每次10min，用5%山羊血清稀释生物素标记的二抗覆盖组织表面，室温孵育45min，PBS摇床洗3次，每次10min；（7）组织表面滴加适量亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温孵育30min，PBS洗3次，每次5min；（8）DAB显色：配制DAB显色液，滴加至组织表面，在显微镜下观察着色，待出现明显棕色且背景无明显着色时放于自来水中终止显色；（9）苏木素染核1-2min，用自来水冲洗终止染色；（10）将组织依次放入80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇I、无水乙醇II各5min，再放入二甲苯I 10min，二甲苯II 10min，完成组织脱水和透明；（11）滴加一滴中性树胶封片，显微镜下观察并拍照，室温保存。

he染色步骤 HE实验步骤动物病理切片小结[样本处理]动物麻醉后，开胸，暴露心脏，头皮针插入左心室尖，打开37?生理盐水输液装置，从右心耳下沿剪开右心房，灌洗至流出的生理盐水无血(20min)，换4%多聚甲醛固定液灌注(约5min)[固定]4%多聚甲醛固定。

[石蜡切片]取样从固定中取出待切组织，用手术刀切成2mm厚度的小样，装入脱水小盒中，铅笔标号纸条同放入小盒后流水洗30min，蒸馏水浸洗处理Mice:脱水50%乙醇 2-3h170%乙醇 1-2h80%乙醇 1h95%乙醇 2h(1h+1h)100%乙醇 2h(1h+1h)透明二甲苯 35min+35min浸蜡 1h+1h+1h (62?蜡)[HE染色]脱蜡二甲苯? 15min二甲苯? 15min二甲苯:无水乙醇(1:1) 2min无水乙醇? 2min无水乙醇? 2min95%乙醇 2min85%乙醇 2min70%乙醇 2min50%乙醇 2min蒸馏水 5min(如果是DAB染色要抗原修复)HE染色苏木素 6-8min (时间可以延长，现在10-30min)冲洗 1min(反向将载玻片反向冲洗，注意不要脱片)2含1%盐酸的乙醇进行分色(用75%乙醇配)2-3s动作要快氨水反蓝 >10min伊红 10s冲洗固定脱水95%乙醇 2min100%乙醇? 2min100%乙醇? 2min二甲苯? 2min二甲苯? 2min 树胶封片组织浸蜡-常规石蜡切片制作组织经过透明剂的完全透明后，被移放于65?左右熔化的石蜡中，于65?的电热恒温箱中浸渍的过程称为浸蜡。

组织在脱水时，组织中的脂类和类脂等物质在脱水剂的作用下被溶解掉，留下了许多腔隙，许多管腔组织和血管，也有许多腔隙，这些都严重地影响了切片。

组织浸蜡时，由于诱导剂(二甲苯)的作用，石蜡进入到组织的各个角落，并在各个角落中保存下来。

当石蜡包埋后冷却时，这浸入到里3面的石蜡便可起到支撑的作用，而且使组织不致于变形，塌陷等现象，使切片能完整的切出，便于镜下观察。