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第二章 发酵工业菌种改良1

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发酵工程 第2章 发酵工业菌种PPT课件

发酵工程 第2章 发酵工业菌种PPT课件

lys.HCl 2.1 g/l
F6-16 (leu -, Thr -)
20.8 g/l
F9-50 (leu -, Thr -, AEC r)
33.5 g/l
42
代谢工程的定义
利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进 行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调 控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新 的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一 个新的学科领域。
13
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例：礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生 物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
14
的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选 高产菌。
28
放线菌的分离： 以产链霉素菌种的分离为例
（从退化菌种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
采用稀释法制平板，获取单菌落
根据高产菌的特点，选择目的菌落
筛ห้องสมุดไป่ตู้模型：形态依据
斜面保藏
高产菌恢复
放大培养，发酵液性能测试
物理：紫外，快中子
{ 诱变剂
化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍
35
（一）、诱变剂的作用原理（略） （二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题
化学诱变剂使用过程的安全性
亚硝酸：0.07MNa2HPO4 亚硝基胍：1MNaOH
诱变剂量的选择
诱变剂的选择 出发菌株的选择
36
（三）、诱变育种的一般步骤 (略)

第二章发酵工业微生物菌种制备与培养基

第二章发酵工业微生物菌种制备与培养基

生长方式是菌丝末端的伸长和顶端分支，彼此 交错呈网状。菌丝的长度既受遗传性的控制，又受 环境的影响，其分支数量取决于环境条件。菌丝或 呈分散生长，或呈菌丝团状生长。
工业上常用的霉菌有： 藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红 曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等； 产品： 酶制剂（enzyme preparation）、抗生素 (antibiotic)、有机酸（organic acid）及甾体激素 （steroid hormone） 等。
5、 担子菌（Basidiomycetes ）：所谓的担 子菌就是人们通常所说的菇类(mushroom)生物 。担子菌资源的利用正愈来愈引起人们的重视 ，如多糖(polysaccharide)、抗癌(anticancer)药 物的开发。 近几年来，日本、美国的一些科学家对香菇 的抗癌作用进行了深入的研究，发现香菇中的 “1，2-β-葡萄糖苷酶”及两种糖类物质具有抗 癌作用。
4、 放线菌(Actinomycetes)
放线菌因菌落呈防线状而得名。它是一个原 核生物类群，在自然界中分布很广，尤其在含有 机质丰富的微碱性土壤中较广。大多腐生，少数 寄生。 放线菌主要以无性孢子进行繁殖，也可借菌 丝片段进行繁殖。后一种繁殖方式见于液体沉浸 培养（submerged cultures）中。其生长方式是 菌丝末端伸长和分支，彼此交错成网状结构，成 为菌丝体。菌丝长度既受遗传性的控制，又与环 境相关。
保存方法：
应能较长期地保存原有菌种的优良性能，使菌种稳定，同 时也要考虑到方法本身的经济简便。不同的菌种有不同的保 存方法，以便长期保藏。 酵母菌：定期移植斜面低温保藏法。也可采用石蜡油封 保藏法。 霉菌：沙土管保藏法。 细菌和放线菌：一般细菌以采用冷冻干燥保藏法为佳。 放线菌可用沙土或冷冻保藏法保藏。

发酵工程第二章 发酵工业菌种的选育

发酵工程第二章 发酵工业菌种的选育

2、大肠杆菌 (Escherichia coli)
➢ 可利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等 ➢ 大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶在工业上被用来进行谷氨酸 的定量分析 ➢ 基因工程的很好材料
3、乳酸杆菌 (Lactobacillus sp.)
➢ 革兰氏阳性，无芽孢，厌氧或兼性厌氧 ➢ 可生产乳酸 ➢ 干酪的成熟、乳脂的酸化和腌菜、泡菜制作
第一组 长宽比为1～2 细胞多为圆形、卵圆形； 主要供生产啤酒、白酒和酒精及面包
第二组 长宽比为2 多供生产葡萄酒、果酒用
第三组 长宽比大于2 耐高渗透压，供发酵甘蔗糖蜜生产酒精用
啤酒酵母在液体培养基中的生长行为有两类：
上面酵母—发酵度较高，不易凝集沉淀，浮于上面
下面酵母—发酵度较低，易凝集沉淀
➢ 与一般放线菌不同，菌丝体长入 培养基内，不形成气生菌丝，而在 基内菌丝体上长出孢子梗，其顶端 生一个球形、椭圆形孢子。
➢ 菌落致密，与培养基紧密结合在 一起，表面凸起，多崎岖，疣状； 菌落常为橙黄色、红色、深褐色、 黑色和兰色。
➢ 可产多种抗生素，如产庆大霉素
3、游动放线菌属 （Actinoplanes）
➢ 野油菜黄单胞菌(X. campestris) 可以用淀粉生产黄原胶
10、假单胞菌 (Pseudomonas)
G-细菌，能发酵生产维生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡 萄糖酸、色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转化； 有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。
（二） 放线菌
• 菌落呈放射状，原核微生物类 群，在自然界中分布很广，尤 其在有机质丰富的微碱性土壤 中较多。 • 大多腐生，少数寄生。 产生多种抗生素（12 000余种， 60%左右来自放线菌），经济 价值大。革兰氏阳性、高( G + C) mol% 含量( >55% )

【发酵工艺学总论】第二章_工业发酵菌种

【发酵工艺学总论】第二章_工业发酵菌种

代表微生物类型 革兰氏阳性球菌
高产培养基设计的几个原则




制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素； 使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物 阻遏； 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。

酶发酵生产常用的微生物
微生物
枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 黑曲霉 米曲霉 青霉 木霉 根霉
生产的酶类
α -淀粉酶、蛋白酶、β -葡聚糖酶、碱性磷酸酶等 谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 糖化酶、 α -淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢 酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纤维素酶等 糖化酶和蛋白酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等 葡萄糖氧化酶、果胶酶、纤维素酶、磷酸二酯酶、脂肪酶、凝乳酶、核 酸酶等 纤维素酶等 糖化酶、 α -淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果 胶酶、纤维素酶等

样品的预处理

目的：提高分离效率 方法：


物理方法：热处理（减菌）；膜过滤法（浓缩）； 离心法（浓缩） 化学方法：通过在培养基中添加某些化学成分来增加特
定微生物的数量。
几丁质——放线菌；CaCO3——嗜碱性放线菌

诱饵法
石蜡、花粉、蛇皮、毛发等
分离方法的选择

根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法 菌种的营养特征独特 选择性分离 生长特征独特 无选择性特征 根据产物的特征进行 随机分离


增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长 或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选

第二章发酵工业微生物菌种ppt课件

第二章发酵工业微生物菌种ppt课件

2019
-
7
(1) 曲霉属(Asprgillus)：曲霉种类繁多、分布 广泛，工业上利用曲霉生产各种酶制剂和有机 (2) 青霉属（Penicillium）：j既是使果实腐 酸。如米曲霉（ Asp. oryzae）用于酿酒和L败和实物变坏的有害菌，又是青霉素后葡萄 乳酸生产。制酱油用的酱油曲霉以及制造柠檬 糖酸的产生菌。 酸、草酸、葡萄糖酸和糖化酶、酸性蛋白酶、 (3) 根霉属（Rhizopus）：用于米酒、黄 果胶酶、单宁酶等的黑曲霉 (Asp. niger)。 酒生产。此外，广泛用作淀粉糖化菌、有机 酸发酵以及甾体转化等许多方面。 (4) 毛霉属（Mucor）：产生蛋白酶，有分 解大豆蛋白的能力。腐乳、酱油、转化甾族 化合物。土曲霉：衣康酸
11
连续培养菌种的筛选 比生长速率(u):每克菌体每小时增长的 菌体量.u=1/XdX/dt.
2019
-
12
比生长速率u
A B
r
2019 -
基质浓度
13
限 制 性 基 质
当进行流加时基质浓度<r 时,A菌先被洗出; 当进行流加时基质浓度>r 时,,B菌先被洗出;
培养液
固体培养法
2019 14
2.随机分离方法 （1）.抗生素产生菌筛选 试验菌的灵敏性，以及与抗生素有关的酶、 酶的抑制剂（例如棒酸）、激活剂、抗体 等建立起来的高灵敏度、专一的检测技术。 （2）.药理活性化合物的筛选 （3）.生长因子产生菌的筛选 （4）.多糖生产菌的筛选 （5）.免疫激活剂产生菌的分离
2019
-
3
(3) 乳酸菌：由糖类生成乳酸的一类细菌总称为乳 酸菌，有乳链球菌和乳酸杆菌之分，主要用来制 造乳制品。凡发酵产物中只有乳酸者，称为同型 乳酸发酵；凡发酵产物中除乳酸外还有乙酸等和 CO2者，称为异型乳酸发酵。肠膜状明串珠菌属 于乳酸菌族，是制药工业生产有旋糖酐的重要菌。 (4) 大肠杆菌：工业上利用大肠杆菌的谷氨酸 脱羧酶，进行谷氨酸定量分析。还可以利用 大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。 医药方面用它制造治疗白血症的天冬酰胺酶。 另外，在研究细菌遗传变异方面，以及构建 基因工程菌时，大肠杆菌是理想的研究材料。

发酵工程第二章 工业发酵菌种选育

发酵工程第二章 工业发酵菌种选育

• 酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主 要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的 有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。
啤酒酵母：酿酒、辅酶类物质的发酵 酒香酵母：酿酒 汉逊酵母：酿酒，用于乙酸乙酯的发酵 假丝酵母：单细胞蛋白生产，石油发酵
霉菌
• 霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产多种 酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。
土样采集方法
• 森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下 层向上层顺序采集； • 水田等浸水土壤在不损土层结构的情况 下插入圆筒采集。如果层次要求的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。 • 在采集植物根际土样时，一般方法是自 土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水 中浸渍约 20min ，洗去粘附在根上的土 壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的 土，这部分上却为根际土样。
采样的注意事项
• 1、采样时应尽可能保持相对无菌； • 2、所采集的样本必须具有某种代表性； • 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日 期、地点以及采集地点的地理、生态参数等； • 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真 正的原地菌群的出现可能是短暂的； • 5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存 于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采 样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态 环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体 之间就会出现消长
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
• 担子菌（basidiomycetes）：主要用于多糖、 橡胶物质和抗癌药物的开发。 • 藻类（alga）：许多国家已把它作为人类保健 食品和饲料。还可通过藻类将CO2转变为石油； 国外还有从“藻类农场”获得氢能的报道。
担子菌 硅藻
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？

第2章 发酵工业菌种

第2章 发酵工业菌种

（3）诱饵法： 将一些固体物质加到待分离的土壤或 水中做成诱饵富集目的菌。 2.2.3 富集培养 利用不同微生物生长繁殖对环境和营养 的要求不同，投其所好取其所抗，使目的 菌成为人工环境下的优势菌。
（1）控制培养基的营养成分：如唯一碳源 （2）控制培养条件：如T、DO、pH、添加 抑制剂等 2.2.4 菌种分离 常用的纯培养分离方法有： （1）平板划线法 （2）稀释分离法 （3）简单平板分离法 （4）涂布分离法 （5）毛细管分离法 （6）小滴分离法
5、液氮超低温保藏法 ①方法：准备安瓿管 制备菌悬液 分装和 熔封安瓿管 冷冻 保藏 复活 ②原理：超低温，M的所有代谢活动暂时停止 ③适用范围：除少数对低温损伤敏感的M外，该 法适用各类M ④保存期限：一般可达4—15年 ⑤优点：保存期长、变异小、适用范围广 ⑥缺点：需特殊设备，液氮消耗多、操作费用 高、操作复杂
从自然界分离筛选菌种的一般步骤： 样品采集 样品预处理 富集培养 菌种分离 初筛、复筛 性能鉴定 2.2.1 样品采集 总原则是：（1） 样品来源越广，获得新菌种 的可能性越大； （2）要了解目标产物的性质和可能产目标产 物的微生物种类及其生理特征。
①了解微生物的代谢规律。如初级代谢基本 相同，但通常丝状菌及产芽孢细菌才能进 行次级代谢。 ②考虑微生物的生理特征。如营养类型、生 长环境等。
第2章
发酵工业菌种
• 在发酵工业中，工业生产水平主要由三个 要素决定，即： 1、 生产菌种性能 2、发酵及提取工艺条件 3、 生产设备 其中，生产菌种是最重要的因素，是发酵 的灵魂。
2.1 发酵工业常用菌种
一、发酵工业对菌种的要求 1 菌种不能是病源菌 2 发酵周期短，生产能力强 3 发酵过程中不产或少产与目标产物性质相 似的副产物 4 原料来源广价格低廉，菌种能高效地将原 料转化成产品 5 对需添加的前体有耐受能力，且不能将前 提作为一般碳源利用

《发酵工程》第2章 菌种与种子扩大培养

《发酵工程》第2章 菌种与种子扩大培养

基酸生产中应用较多。控制菌体在不同生 长期的条件。（营养生长与代谢产物积累
时条件不同）
eg: 酶制剂两步法液体深层培养
特点：将菌体生长条件（营养期）与产酶条件（自我繁 殖期）区分开来。 操作：菌种先在营养丰富的培养基上大量繁殖→收 集菌体浓缩物→洗涤→添加诱导物的产酶培养基中 培养
eg: 氨基酸生产的两步法液体深层培养：
二、工业上常用的微生物
微生物在工业上的用途很广，包括化工、
医药、食品、水产、国防、纺织、石油 勘探及石油化工等方面。 微生物的代谢产物多，已超过1300多种， 而用于大规模工业生产的不足100多种； 微生物酶有近千种，而工业上用的不过 40－50种。微生物具有巨大的潜力可挖 掘。 工业上常用菌种举例：
A、固体培养 （曲法培养）
浅盘固体培养 深层固体培养
B、液体培养
浅盘液体培养 液体深层培养：
目前几乎所有的好
气发酵均采用液体深
层发酵法；
C、载体培养：用天然（或人工）多孔材料
（如脲脘泡沫塑料）代替麦麸之类固态基质作 微生物生长的载体，营养成分可严格控制。
D、两步法液体深层培养：在酶制剂和氨
保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体 （孢子、芽孢等），其次是要创造一个最有利于休眠的 环境，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，以达到 降低其代谢活动，延长保存期的目的。
3、菌种保藏的方法：
斜面保藏法、矿物油保藏法、砂土保管保藏法、真空 冷冻干燥法、冷冻法、液态真空干燥法、琼脂穿刺封 口保藏法、曲法保藏、麦粒保藏法、无水硅胶保藏法。
四、防止菌种退化的措施
1、菌种退化：菌种的发酵能力降低、繁
殖能力降低、发酵产品的得率降低
区别于杂菌污染：

发酵工程与设备第二章、第三讲 发酵工业菌种的改良

发酵工程与设备第二章、第三讲 发酵工业菌种的改良

微生物肥（2003） 准字（0110）号
米曲霉、啤酒酵母 枯草芽孢杆菌
使用方法 秸秆腐熟还田： 1. 平铺秸秆 均匀平铺秸秆于田间，切忌碎草成堆。 2. 施用腐熟剂 每亩撒用本产品2kg，使之均匀散落于秸秆下层。 3. 施用底肥（化肥） 为加速秸秆腐熟，播种前应合理施用底肥，调 整碳氮比，根据需要可施适当氮肥（如尿素，5~10kg /亩），切忌 将本产品和化肥直接混合使用！ 4. 播种 免耕田，旱地适当加大播种量（约10%），撒种要均匀，拍 打秸秆，使种子接触土壤，以利出苗和保肥，播后适当泼清粪水或 灌跑马水，以提高出苗率。水田抛秧7天后秧根须接触到水。翻耕田， 将腐熟剂和秸秆一同翻入土中，按常规方法播种。 秸秆堆肥： 秸秆水分调至65%左右，每吨秸秆加入100~200kg禽畜粪便或 5~10kg尿素调节碳氮比，均匀撒入菌剂，拌匀后上堆，盖上薄膜。 堆温升至55℃以上时翻堆，以后每隔5~7天翻堆一次，共翻4次即可 使用。
序号
企业名称
产品商品名
产品登记证号
产品菌种名称
1 2
3
佛山金葵子植物营养有限公司
腐秆剂
微生物肥（2003） 准字（0076）号
枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆 菌、多粘芽孢杆菌、杂色曲 霉
嗜热性侧孢霉 北京春熙生物工程有限责任公司 微生物秸秆速腐剂 微生物肥（2003） 准字（0095）号
淮安市大华生物制品厂
自然选育 诱变育种 杂交育种 (有性、准性) 转导和转化 原生质体融合育种 基因工程育种
1、自然选育
在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变 而进行菌种筛选的过程叫自然选育。 自发突变(spontaneous mutation)，也称自然突变，指某些 微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味 着这种突变是没有原因的。 一般认为引起自然突变有两个原因：即多因素低剂量的诱变 效应和互变异构效应。

发酵工程第二章发酵工业微生物菌种

发酵工程第二章发酵工业微生物菌种
施加选择性压力分离法 随机分离法 这两种方法都是针对菌种从样品中分离所采用的
方法，实际发酵工业上菌种分离的步骤要有很多 步骤。
新种分离与筛选的步骤
定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。
采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为的通过控制养分或培养条件，使所需
菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包
工业上常用的微生物菌种
③ 霉菌： 工业上常用的霉菌有根霉、毛霉、红曲 霉、青霉等，主要生产酶制剂、抗生素、有机酸 和甾体激素等。
④ 放线菌： 工业上常用的有链霉菌属、小单胞菌 属和诺卡菌属，主要用于生产多种抗生素。
⑤ 担子菌： 即常说的蕈菌，主要用于生产多糖、 药物开发。
⑥ 藻类： 工业上常用的藻类有螺旋藻、单烈藻等， 主要用于生产食品，替代能源等。
新种分离与筛选的步骤
（三）培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物
的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在 这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一 步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分 离的方法有划线分离法、稀释分离法。
施加选择性压力分离法
施加选择性压力分离法：利用不同种类微生物生 长繁殖对环境和营养要求不同，人为控制这些条 件，使之利于某类或者某种微生物生长，不利于 其他微生物生存，以达到使目的菌占优势，从而 快速分离纯化的目的。
括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生 长和发酵最适温度、最适值、提取工艺等。
新种分离与筛选的步骤
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的 步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样 中所包含的所有微生物总数和种类。

发酵工程第二章 发酵工业菌种的选育

发酵工程第二章 发酵工业菌种的选育
微生物工程工业生产 水平的三个决定要素:
生产菌种的性能 生产设备 发酵和提取工艺条件
优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生 产的第一环节。
第二章 发酵工业菌种的选育
2.1 发酵工业常用菌种 2.2 发酵工业菌种的分离筛选 2.3 发酵工业菌种鉴定 2.4 发酵工业菌种改良 2.5 发酵工业菌种保藏
• 生长迅速，营养要求不高，易培养； • 安全性好； • 比哺乳动物细胞操作简单； • 具有一定的修饰蛋白的能力。
2.2发酵工业菌种的分离筛选
菌种分离 将混杂着各种微生物的样品按需要和菌株的特性迅 速、准确、有效的方法对其进行分离、筛选，得到所需微生 物的过程。
菌种分离方法 依据生产需要、目的代谢产物性质、可能 产生所需目的产物的微生物种类、微生物分布、理化特性、 生活环境等，设计选择性高的分离方法。
➢ 野油菜黄单胞菌(X. campestris) 可以用淀粉生产黄原胶
10、假单胞菌 (Pseudomonas)
G-细菌，能发酵生产维生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡 萄糖酸、色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转化； 有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。
（二） 放线菌
• 菌落呈放射状，原核微生物类 群，在自然界中分布很广，尤 其在有机质丰富的微碱性土壤 中较多。 • 大多腐生，少数寄生。 产生多种抗生素（12 000余种， 60%左右来自放线菌），经济 价值大。革兰氏阳性、高( G + C) mol% 含量( >55% )
近年来，利用啤酒酵母提取核酸、麦角固醇、 细胞色素C、凝血质和辅酶A等；生产单细胞蛋白 (SCP) 、药用和作为饲料；它的转化酶可用于转 化蔗糖，制造酒心巧克力。
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)

发酵工程第二章工业发酵菌种-32学时

发酵工程第二章工业发酵菌种-32学时
1、操作简便、高效、保藏期一般可到达15年 以上，是目前被公认的最有效的菌种长期保藏 技术之一。
2、除了少数对低温损伤敏感的微生物外，该 法适用于各种微生物菌种的保藏。
3、可使用各种培养形式的微生物进展保藏， 无论是孢子或菌体、液体培养物或固体培养物 均可采用该保藏法。
缺点：需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较 多，操作费用较高。
菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的保藏 效果较好。 缺点： 1、对很多厌氧性细菌的保藏效果较差， 2、不适用于某些能分解烃类的菌种。
3、冷冻〔真空〕枯燥保藏法 ***
❖简称：冻干法。用保护剂制备拟保藏菌种 的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在 低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空， 使水升华将样品脱水枯燥，形成完全枯燥 的固体菌块。并在真空条件下立即融封， 造成无氧真空环境，最后置于低温下，使 微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。
❖ 应用：酱油、酱类〔淀粉酶〕
❖ 米曲霉
❖ 应用：产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒 制曲和酱油制曲
青 霉 菌
青霉菌
曲霉
黑曲霉
红曲霉
根霉
❖ 根霉： 米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉
❖ 应用：酿酒
三、工业发酵生产菌种来源 ***
❖ 1 、从自然界别离筛选
❖ 2 、从菌种保藏机构获得
❖ 3、从生产过程中已有的菌种中筛选发生正
2、矿油封藏法〔液体石蜡保藏法〕***
在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水 分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面 上，高出斜面顶端lcm，使培养物与空气 隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂 直放在室温或4℃冰箱内保藏。保存期为 1年。
优点： 1、保存时间长，能使保藏期达1～2年。 2、操作简单，适于保藏霉菌、酵母菌、放线

【发酵工程】余龙江版-第2章-发酵工业菌种

【发酵工程】余龙江版-第2章-发酵工业菌种
在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白 质等，同样可以促进水中微生物的增殖。
培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。 另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如
无菌的植物组织或土壤浸出液。 通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、
中温菌和嗜高温菌。
次代培养及纯化步骤
1. 采样
(2) 采样对象
土壤、水、空气及枯枝落叶等，以土壤为主。
从土壤中采样要考虑土壤的以下特点：
① 有机质含量和通风状况
耕地、菜园 山坡上的森林
（有机质丰富、通气保水性能好）——细菌、放线菌
（有机质丰富、阴暗潮湿）——霉菌、酵母菌
沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地
——微生物少
② 取样的土层深度：5-25cm
3. 富集培养
富集培养的策略
（2）控制培养条件
➢ 溶氧浓度——好氧/厌氧 ➢ 高温——嗜热微生物 /非嗜热微生物 ➢ PH——嗜酸性/嗜碱性
4. 菌种分离
平板划线分离法 稀释分离法 毛细管分离法 小滴分离法
• 稀释倒 平板法
稀释分离法
• 平板 涂布法
注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。
1. 采样
③ 土壤的酸碱度
偏碱——细菌、放线菌 偏酸——霉菌、酵母菌
④ 土壤的植被状况
葡萄成熟时——根部酵母菌增多
⑤ 地理条件
南方土壤比北方土壤微生物含量多
⑤ 季节条件
秋季菜土样最理想
2.样品的预处理
（1）物理方法
热处理：根据目的菌较非目的菌的耐热性高 从而增加目的
菌的比例。
膜过滤法：浓缩水中的微生物细胞。 离心法：同上。
植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出 液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂 布平板。

第二章 发酵工业菌种改良1

第二章 发酵工业菌种改良1
↓ 制备待处理的菌悬液 ↓ 诱变处理
↓
筛选
↓
保藏和扩大试验
出发菌株的选择

出发菌株应具备
①对诱变剂的敏感性高； ②具有特定性状的生产能力
◆出发菌株的来源 ①自然界分离到的野生型菌株： ②历经生产考验的菌株： ③已经历多次育种处理的菌株：
制备单细胞或单孢子悬液

要求 ①菌体处于对数生长期， ②细胞分散且为单细胞， 方法：① 玻璃珠打散10-15min; ② 加０.3%吐温80 ③ 用无菌脱脂棉过滤。 制备：物理诱变剂——生理盐水 化学诱变剂——缓冲液 浓度： 细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml
（3）诱变剂剂量的选择

用 50—85% 的杀菌剂量，此 时正突变率高，特别是出 发菌株已是高产菌株
诱变剂的剂量对产量变异影响的可能结果
a.未经诱变剂处理；b.变异幅度扩大，但正负突变相等； c.正突变占优势；d.负突变占优势
（4）诱变剂的处理方法
诱变剂使用方式 单一处理 复合处理 诱变处理条件： 温度（生长温度） PH（缓冲剂） 处理时间 诱变作用的终止：用解毒剂、用水稀 释
（二）诱变育种
诱变 + 筛选 诱变是随机的；筛选是定向的 目前发酵工业生产菌株都是经 过突变改造过的。
1、诱变育种的基本规律
2、诱变育种中的几个原则
诱变剂的选择 诱变基本过程 诱变剂剂量的选择 诱变剂的处理方法


突ห้องสมุดไป่ตู้株的筛选
（1）诱变剂的选择
诱变剂作用的普遍性：
在其它菌种选育中诱变效果好的诱变剂。 如：UV 亚硝基胍（NTG），快中子

一组：1 二组：2 三组：3 四组：4 五组：5

第二章工业发酵菌种选育

第二章工业发酵菌种选育

应用： 应用：生产甲义丁二酸
毛
霉
应用：可以产生蛋白酶， 应用：可以产生蛋白酶，我国多 用于豆腐乳、 用于豆腐乳、豆豉等的制作
根霉
种类：米根霉、华根霉、少根根霉、 种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉 应用： 应用：酿酒
青霉菌
应用：生产青霉素、 应用：生产青霉素、葡萄糖氧 化酶
4、放线菌 、
2、微生物次级代谢与初级代谢的关系 、
许多抗生素的基本结构是由少数几种初级代谢产物构 成的，所以次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍 成的 ， 所以 次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍 生出来的，次级代谢途径并不是独立的， 生出来的 ， 次级代谢途径并不是独立的 ， 而是与初级 代谢途径有密切关系的。 代谢途径有密切关系的。 糖代谢中间体，既可用来合成初级代谢产物， 糖代谢中间体 ， 既可用来合成初级代谢产物 ， 又可用 来合成次级代谢产物，这种中间体叫做分支中间体 分支中间体。 来合成次级代谢产物，这种中间体叫做分支中间体。 微生物次级代谢，其目的产物的生物合成途径取决于 微生物次级代谢， 微生物的培养条件和菌种的特异性 培养条件和菌种的特异性。 微生物的培养条件和菌种的特异性。
（一）采样
1、采样对象 、 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中， 以采集土壤为主。 一般园田土和耕作过的沼泽土中 ， 以细菌和放线菌为主， 以细菌和放线菌为主 ， 富含碳水化合物的土壤和沼泽 地中， 酵母和霉菌较多， 如一些野果生长区和果园内。 地中 ， 酵母和霉菌较多 ， 如一些野果生长区和果园内 。 采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。 采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。 2、根据微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境取样 、 如产纤维素酶菌、产壳聚糖酶菌、 如产纤维素酶菌、产壳聚糖酶菌、 产蛋白酶菌或脂肪 酶菌、产淀粉酶菌或糖化酶菌、极端微生物等。 酶菌、产淀粉酶菌或糖化酶菌、极端微生物等。 3、采土方式： 在选好适当地点后， 用小萨子除去表土， 、 采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土， 取离地面5-25cm处的土约 处的土约10-25g，盛入无菌的牛皮纸袋 取离地面 处的土约 ， 或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、 或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条 件等，以备查考。 件等，以备查考。

发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术

发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术
第二章 发酵工业微生物菌种 制备原理和技术
发酵工程 工业生产水平的
生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件
三个决定要素
生产设备
获得优良的生产菌种是实现高水平发酵工程工 业生产的第一环节。
本章内容
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
第二节 自然界中微生物菌种的选择性分离
第三节 微生物菌种的选育
第四节 微生物菌种的退化、复壮和保藏 第五节 工业微生物菌种的扩大培养 第六节 种子培养基及其制备
集的培养物到固体培养基，分离优势微生物的单
菌落。

移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。
连续富集培养（恒化式富集培养）

改变限制性基质浓度来控制两种菌的比生长速率。 用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。
固体培养基的使用

ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
常用于分离酶产生菌，选择培养基中常含有所
需的基质，以便促使酶产生菌的生长，并在菌落
使目的微生物在种群中占优势，使筛选 1. 目的：
变得可能。
2. 两种方案：
（1）施加选择性压力分离法：采用特定的有利于 目的微生物富集的条件进行培养，使目的微生物 占优势，以实现快速分离纯化的目的。 （2）随机分离法：不能提供任何有助于筛选产生 菌的信息时，只能通过随机分离法进行分离。
（1）施加选择性压力分离法
酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。

第二章工业用微生物菌种课用

第二章工业用微生物菌种课用

谷氨酸菌种的定向选育
改变细胞膜的通透性：
生物素（乙酰CoA羧化酶的辅酶）营养缺陷型株 丧失脂肪酸合成酶的油酸缺陷型； 丧失a-磷酸甘油酶的甘油缺陷型。
选育温度敏感突变株：
例：使用典型的温度敏感突变株TS-88生产谷氨 酸时，通过控制发酵条件，在生长适当阶段将发 酵温度由30℃提高到40 ℃，可在生物素含量为 33ug/L，含糖3.6%的甜菜糖蜜发酵培养基中， 产生20g/L谷氨酸，对糖转化率>55%。
生物素亚适量的原因（2ug/L~5ug/L） ： 当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢； 当生物素过量时，则转为乳酸发酵。 在谷氨酸发酵过程中，影响菌种代谢途径的 因素见下表。
防止噬菌体和杂菌的污染
谷氨酸生产菌一 般都是生物素缺陷型，而在发 酵培养基中又大多是控制生物素亚适量，所以 谷氨酸生产菌对噬菌体和杂菌的抵抗能力较弱。 最怕污染噬菌体，轻则出现谷氨酸收率低、难 提取，重则倒罐，造成很大的经济损失。所 以，杂菌和噬菌体的防治工作就显得特别重要。 一定要从空气过滤、培养基、设备、环境等环 节严格把关。
3
易于控 制培养 条件, 周期短
4
5
6
原料廉 价,生长 迅速,目 的产物 产量高
7
不是 病原 菌
对诱变 剂敏感
抗污 染力 强
产物 分泌 型
工业菌种的改良方法
a)
b) c)
解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加 特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力 来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新 的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。 增加前体物的深度。 改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提 高菌种对高深度的有潜在毒物的底物、前体或 产品的耐受力。
①富集液体培养
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（一）基因突变类型（表型分类）
营养缺陷型（株）

选择性突变
抗性突变型（株）
条件致死突变（株）

非选择型突变
形态突变型（株） 抗原突变型（株）
产量突变型（株）

营养缺陷型——因突变而丧失合成某种 物质的能力，因此必须在培养基中添加 某种物质才能生长的突变类型。
抗性突变型——因突变而产生了对某种 化学药物或致死物理因子的抗性的突变 株。

（二）诱变育种
诱变 + 筛选 诱变是随机的；筛选是定向的 目前发酵工业生产菌株都是经 过突变改造过的。
1、诱变育种的基本规律
2、诱变育种中的几个原则
诱变剂的选择 诱变基本过程 诱变剂剂量的选择 诱变剂的处理方法


突变株的筛选
（1）诱变剂的选择
诱变剂作用的普遍性：
在其它菌种选育中诱变效果好的诱变剂。 如：UV 亚硝基胍（NTG），快中子
影印检出法
夹层培养法
限量补给法
在含少量的（ 0.01% ）蛋白胨的 MM 上培养, 大菌落为野生型 小菌落的为缺陷型。

C-4:鉴定缺陷型
生长谱法 组合营养物法 组 合 补 充 培 养 基 法

生长谱法

斜面菌种-----生理盐水洗下细胞-----洗涤-----涂布（105个/皿）
纸片1:氨基酸混合液; 纸片3: 核酸水解液;

突变是独立的。某一基因 发生突变不会影响其它基 因的突变率。
（三）基因突变的特点
以细菌的抗药性为例。
不对应性：突变的性状与突变原因之 间无直接的对应关系。 自发性：突变可以在没有人为诱变因 素处理下自发地产生。 稀有性：突变率低且稳定。
独立性：各种突变独立发生，不会互 相影响。 可诱发性：诱变剂可提高突变率。
第四节发酵工业菌种改良
菌种改良技术的进步是发酵工业发展的技术支撑。 所以，育种工作者的任务就是在不损及微生物基 本生命活动的前提下，采用物理、化学或者生物 学以及各种工程学的方法，改变微生物的遗传结 构，打破原有的代谢机制，使之成为“浪费型” 菌株。同时，按照人们的需要和设计安排，进行 目的产物的过量生产，最终实现产业化的目的。
孢子悬液------诱变----适当培养（表型迟）涂布平板----打孔取菌落-----琼脂块培养4 -5天—
测定琼脂块所含的抗生素的抑菌圈----效价高菌
（2）抗药性突变株的筛选（梯度平板法）
抗药性突变株的应用：
*作为菌株的遗传标记 *作为生产菌种
（结构类似物抗性突变株）
如“吡哆醇高产菌株的筛选”
诱变剂的特异性：经验之谈
四环素族抗生素用亚硝酸、羟胺， 青霉素用氮芥、乙烯亚胺、亚硝基胍．
菌株的差异：（即使是同一菌） A：遗传性不稳定的菌株-----用缓和诱变剂 B：遗传性稳定的菌株----首用强，后用缓。 考虑诱变机制： UV 嘧啶， 亚硝酸 嘌呤，因此复合用为好
（2）诱变基本过程
选择合适的出发菌株

一组：1 二组：2 三组：3 四组：4 五组：5
2 6 7 8 9
3 7 10 11 12
4 8 11 13 14

5 9 12 14 15


1）每组内无重复的营养因子 2）每组中应包含只出现一次的因子 3）每组中其他因子应分别出现二次
组合营养物法：
组合补充培养法



如是多个缺陷型菌株， 则制成各营养组合平板，将待测菌 株依次点接到这一组平板的对应位 置上， 根据在各平板上的生长情况逐个分 析各菌株的缺陷型 MM+A +B +C +A+B +A+C
（3）营养缺陷型(auxotroph)的筛 选
A：有关的三类遗传型个体：
营养缺陷型突变株： 野生型菌株： 原养型菌株：
B 有关的三类培养基

基本培养基（MM）[-]：凡是能满足野生型菌
株营养要求的最低成分的合成培养基。 完全培养基（CM）[+]：满足一切营养缺陷型 菌株生长的天然或半合成培养基。 补充培养基（SM）[x]：在MM中有针对性地


加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型
菌株生长的合成培养基。
C 营养缺陷型的筛选步骤
C-1：诱变处理（同前讲述） C-2 ：淘汰野生型（ 浓缩缺陷型 ） C-3：检出缺陷型 C-4：鉴定缺陷型
C-2：淘汰野生型（浓缩缺陷 型）
（1）抗生素法
野生型菌株在MM上生长 +青霉素—杀死Ｇ＋ 缺陷型菌株在MM上不生长 ＋青霉素—-不杀死
↓ 制备待处理的菌悬液 ↓ 诱变处理
↓
筛选
↓
保藏和扩大试验
出发菌株的选择

出发菌株应具备
①对诱变剂的敏感性高； ②具有特定性状的生产能力
◆出发菌株的来源 ①自然界分离到的野生型菌株： ②历经生产考验的菌株： ③已经历多次育种处理的菌株：
制备单细胞或单孢子悬液

要求 ①菌体处于对数生长期， ②细胞分散且为单细胞， 方法：① 玻璃珠打散10-15min; ② 加０.3%吐温80 ③ 用无菌脱脂棉过滤。 制备：物理诱变剂——生理盐水 化学诱变剂——缓冲液 浓度： 细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml
（3）诱变剂剂量的选择

用 50—85% 的杀菌剂量，此 时正突变率高，特别是出 发菌株已是高产菌株
诱变剂的剂量对产量变异影响的可能结果
a.未经诱变剂处理；b.变异幅度扩大，但正负突变相等； c.正突变占优势；d.负突变占优势
（4）诱变剂的处理方法
诱变剂使用方式 单一处理 复合处理 诱变处理条件： 温度（生长温度） PH（缓冲剂） 处理时间 诱变作用的终止：用解毒剂、用水稀 释
稳定性：变异性状稳定可遗传。
可逆性：正向突变率=回复突变率
（四）基因突变的机制
自发突变 诱发突变

二、突变与育种
（一）自发突变与育种 1、生产中育种 10-6突变率 ---寻找正向突变菌株 2、定向培育优良菌种 牛型结核杆菌------13年----230 代----卡介苗（减毒活菌疫苗）
（5）突变株的筛选
筛选条件：基因型+环境=表型 表型迟延 充分表 达
分离性迟延现象
生理性迟延现象
（5）突变株的筛选
合适的筛选方法 ： 平皿快速检测法 变色圈法 透明圈法 抑菌圈法 梯度平板法 生长圈法
摇瓶培养法
第一轮：
诱变处理
初筛
（每瓶一株）
一个出发菌株→→→ 选出200个菌株→→→ 选出50株


制霉菌素法则适合于真菌
抗生素处理完 后，离心收集 细胞，并转入 低渗溶液
（2）菌丝过滤法
适于：丝状（放线菌、霉菌）
原理： 野生型基本培养基上发育成菌 丝； 缺陷型孢子不萌发可通过滤膜， 野生型菌丝不能通过。
C-3:检出缺陷型
逐个检出法 影印检出法 夹层培养法 限量补给法

逐个检出法
纸片2:维生素混合液; 纸片4: 酵母水解液
组合营养物法：
A 将多种营养因子编组；
b. 将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养； c. 结果分析； 一组：1 二组：2 三组：3 四组：4 五组：5 2 6 7 8 9 3 7 10 11 12 4 8 11 13 14 5 9 12 14 15
复筛
→→→选出5株 （每瓶四株） 40株 复筛 40株 初筛 诱变处理 5个出发菌株→→→ →→ → 选出50株 →→ →选出5株 40株 第二轮： 40株 （每瓶一株） 40株 （每瓶四株）
3、三类突变株的筛选
产量突变株筛选 抗药性突变株的筛选 营养缺陷型的筛选

（1）产量突变株筛选
琼脂块培养法（春日霉素）
目的
防止菌种退化
解决生产实际问题 提高生产能力 提高产品质量 开发新产品
方法
基因突变： 自然选育、诱变育种
基因重组： 杂交、原生质体融合、基因工程 基因的直接进化： 点突变、易错PCR、DNA Shuffling等
一、基因突变
突变：指生物体的表型发生的可遗 传的变化。 狭义突变：基因突变—点突变 广义突变：基因突变和染色体畸变 -6 突变的几率：10 ---10-9 野生菌株 ---突变-----突变株

条件致死突变型——突变后在某种条 件下可正常生长繁殖，而在另一条 件下却无法生长繁殖的突变型
抗原突变型——因突变而引起的抗原 结构发生改变
（二）突变率




每一细胞在每一世代中发生某一性 状突变的几率。 突变率为10–8是指该细胞在一亿次细 胞分裂中，会发生一次突变。 突变率也可以用每一单位群体在每 一世代中产生突变株 突变率=突变细胞数/分裂前群体细 胞数