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2.发酵工业菌种

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发酵工艺 第2章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术

发酵工艺 第2章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术

微生物菌种保藏机构名称和缩写
中国 缩写
ACCC
SH IA CCGMC AS-IV
CAF
IFFI
ID IV CIVBP
名称 中国农业微生物菌种保藏管理中 心 上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中 心 轻工业部食品发酵工业科学研究 所 中国医学科学院皮肤病研究所 中国医学科学院病毒研究所 中国兽医药品监察所
最常用的工业微生物
放线菌
– 链霉菌属 – 小单孢菌属 – 地中海诺卡氏菌 – 米苏里游动放线菌
藻类
藻类包括数种不同类以光 合作用产生能量的生物。 它们一般被认为是简单的 植物，并且一些藻类与比 较高等的植物有关。虽然 其它藻类看似从蓝绿藻得 到光合作用的能力，但是 在演化上有独立的分支。 所有藻类缺乏真的根、茎、 叶和其它可在高等植物上 发现的组织构造。藻类与 细菌和原生动物不同之处， 是藻类产生能量的方式为 光合自营性 ；琼脂（棕 藻）
国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心 2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部 3、CSH：美国冷泉港研究所 4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所 5、IFO：日本发酵研究所（大阪） 6、NCTC：英国国立标准菌种收藏所 7、CBS：荷兰真菌中心保藏所
三、生产中常用菌种的分离、选 育（screening ）
（一）微生物菌种的分离 四步骤： 样品采集 增值培养 纯种分离 生产性能的测定
1.施加选择压力分离法
施加选择性压力分离法
主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营 养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、 氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微 生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到 使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如 可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物 分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生 物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在 分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加 选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗 生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。

发酵工业菌种选育 酿酒主要微生物

发酵工业菌种选育 酿酒主要微生物

黑根霉
菌落生长初期为自色，后期为灰褐色 至黑褐色。此菌能产生果胶酶，常引起 水果的腐烂和甘薯的软腐。其最适生长 温度为30℃ ,37℃时不能生长。
毛霉
总状毛霉
总状毛霉是毛霉中分布最广 的一种。菌丝灰白色，菌丝 直立而稍短，孢子囊柄总状 分枝，孢子囊球形，浅黄色 至黄褐色。在豆腐坯和熟大 豆上生长迅速，我国四川的 豆豉即用此菌制成。
02 01
鲁氏毛霉
此菌种最初是从我国小曲中分离出来 的，菌落在马铃薯培养基上呈黄色，在 米饭上略带红色，袍子囊柄呈假轴状分 枝，厚垣孢子数量很多，大小不一，黄 色至褐色。鲁氏毛霉能产生蛋白酶，有 分解大豆的能力，我国多用它来做豆腐 乳。
活性干酵母
鲜酵母经过低温脱水后 制得水分7.0～8.5%酵 母为活性干酵母
卡尔酵母
卡尔酵母是啤酒酿造中典型的下面酵母，又称卡尔斯伯酵母。常用于啤酒酿造。能发 酵葡萄、半乳糖、Байду номын сангаас糖、麦芽糖及全部棉子糖。
球拟酵母
具有酒精发酵力
在工业上利用糖蜜生产 甘油
球拟酵母能使葡萄糖转化为多元醇
耐高渗透压
在酱油和酱的发酵中产 生香气的重要菌种
红曲霉
红曲霉在培养基上生长时，菌丝体初为白色，以后变成淡粉色、紫红色或黑灰色等，
通常都能形成红色素，可作为食品加工中天然红色色素的来源。如在红腐乳、饮 料、肉类加工中用的红曲米，就是用红曲霉制作的。
米根霉
这个种在我国酒药和酒曲中常看到， 在土壤、空气，以及其他各种物质中亦 常见。菌落初期为白色，后期为灰褐色 至黑褐色。此菌有糖化淀粉、转化蔗糖 的能力。
毕赤酵母
是酿造的有害菌，经常在酱醪或醋醅表面形成黏稠皮膜，并产生不愉快的气味，影响 发酵的正常进行，还能在酱油表面形成白花，消耗酱油中的糖分、氨基酸等，形成难闻的 气味，破坏酱油的品质。

2发酵工业菌种制备原理和技术(1)

2发酵工业菌种制备原理和技术(1)


这些纯种培养物称为种子。
13

种子制备的过程大致可分为：
实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段

14
9
微生物菌种保藏机构名称和缩写
中 国 缩写 ACCC SH IA CCGMC AS-IV CAF IFFI ID 名称 中国农业微生物菌种保藏管理中心 上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中心 轻工业部食品发酵工业科学研究所 中国医学科学院皮肤病研究所 缩写 ISF CACC SIA AS CFCC CICC CMCC 名称 中国农业科学院土壤肥料研究 所 抗菌素菌种保藏管理中心 四川抗菌素工业研究所 中国科学院微生物研究所 林业微生物菌种保藏管理中心 工业微生物菌种保藏管理中心 医学微生物菌种保藏管理中心
4
最常用的工业微生物

细菌


枯草芽孢杆菌 醋酸杆菌 棒状杆菌 短杆菌 大肠杆菌
5
最常用的工业微生物

酵母菌

酿酒酵母 假丝酵母属


产朊假丝酵母 解脂假丝酵母 热带假丝酵母

毕赤酵母属、汉逊酵母属
6
最常用的工业微生物

霉菌 曲霉属 米曲霉 黑曲霉 青霉属 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉 根霉属 德氏根霉 米根霉、小麦曲根霉 红曲霉属 紫红曲霉
7
最常用的工业微生物

放线菌



链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
8
微生物工业对菌种的要求



能在廉价原料制备的培养基上迅速生长 和生成所需的代谢产物产量高。 培养条件易于控制 生长迅速，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体能力强 菌种不易变异退化 安全性（不是病源菌，不产毒素）

发酵原理第二章 发酵工业菌

发酵原理第二章 发酵工业菌

• 营养菌丝
生长于培养基内， 生长于培养基内，具有吸收营养的功能
• 气生菌丝
（长在空气中）营养菌丝长到一定程度长 长在空气中） 出培养基
• 孢子丝（繁殖菌丝） 孢子丝（繁殖菌丝）
气生菌丝发育到一定程度， 气生菌丝发育到一定程度，上端分化成产 生孢子的菌丝
酵母菌
形态结构
单细胞真核生物， 单细胞真核生物， 无鞭毛， 无鞭毛，有一定形 态大小， 态大小，随菌龄和 环境条件的变化而 一般为圆形、 异，一般为圆形、 椭圆形、卵圆形、 椭圆形、卵圆形、 柠檬形等， 柠檬形等，有的可 形成假菌丝
方法的选择性和灵敏度 注意
发酵工业对菌种的要求
• 在廉价原料制成培养基上生长，目 在廉价原料制成培养基上生长， 的产物产量高， 的产物产量高，易回收 • 生长速度快，发酵期短 生长速度快， • 培养条件易控制 • 抗噬菌体和杂菌污染能力强
• 稳定的遗传学特性：菌种质量稳定，不易 稳定的遗传学特性：菌种质量稳定， 变异退化 • 对放大设备的适应性强 • 菌种不是病原菌，无有害的生物活性物质 菌种不是病原菌， 和毒素产生
未培养微生物 • 概念
未培养微生物：采用现有的微生物纯培养分 未培养微生物： 离和培养方法还没有获得纯培养的微生物 极端微生物： 极端微生物：在极端环境下能够生长的微生 物 • 研究方法 模拟自然培养法和宏基因组分析法
模拟自然培养法 模拟微生物 生长的自然环 境进行可培养 研究。 研究。集中在 原位培养， 原位培养，培 养条件优化和 单细胞操作等 方面
从菌种保存机构直接购买
从自然界分离筛选 发酵水平的批号中重新分离筛选
符 合 要 求 的 菌 种
采集样品 样品处理 富集培养 菌种初筛 菌种复筛 性能鉴定 菌种保藏

发酵工业菌种概述

发酵工业菌种概述

分离：利用分离技术得到纯种。
发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包 括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生 长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。
二、新种分离与筛选的步骤 1. 采样
（1）采样对象
以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼 泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物 的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野 果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物， 腐败物品，某些水域等。
二、新种分离与筛选的步骤 3. 培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生 物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。 在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进 一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种 分离的方法有划线分离法、稀释分离法。
二、新种分离与筛选的步骤 4. 筛选 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件， 通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适 合于工业生产用菌种。
四、基因工程育种 基因重组育种：是运用体外 DNA 各种操作或修 改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质 粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细 胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表 达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞 的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另 —个细胞的方法。
四、基因工程育种
三、诱变育种
3. 紫外线的诱变育种
被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml 左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个 /ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液 不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电 磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照 射时和照射后的处理应在红灯下进行。

发酵工业菌种选育 微生物代谢类型

发酵工业菌种选育 微生物代谢类型

初级代谢产物和次级代谢产物的关系
3.存在范围不同
初级代谢：代谢系统、代谢途径和代谢产物在各类生物中都基本相同
普遍存在于各类微生物中的一种基本代谢类型 次级代谢：只存在于某些微生物中，并且代谢途径和代谢产物因生物
不同而不同
4.对微生物的作用不同
初级代谢:初级代谢产物通常是机体生存必不可少的物质 次级代谢：次级代谢产物一般对菌体自身的生命活动无明确功能
初级代谢产物和次级代谢产物的关系
1.概念不同 初级代谢：在微生物的新陈代谢中，一般将微生物从外界吸收各种 营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和 能量的过程 次级代谢：是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前 体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程
2.产物不同 初级代谢→初级代谢产物 次级代谢→次级代谢产物
7.相关酶的专一性不同
初级代谢:催化初级代谢产物合成的酶专一性强 次级代谢：催化次级代谢产物合成的某些酶专一性不强
8.两者既有区别性又有 连续性
初级代谢是次级代谢的基础 次级代谢则是初级代谢在特定条件下的继续与发展
初级代谢产物和次级代谢产物的关系
2. 工业发酵菌种的选育
2.1.1微生物代谢产物的类型
初级代谢产物
初级代谢产物是指微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖 所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。
次级代谢产物
次级代谢产物
02
次级代谢是微生物在一定的生理阶段出现的 一种特殊代谢类型，是某些微生物为了避免 在代谢过程中某些代谢产物的积累造成的不 利作用，而产生的一类有利于生存的代谢类 型，次级代谢产物通常是在生长后期合成。
5.同微生物生长过程的 关系

【发酵工艺学总论】第二章_工业发酵菌种

【发酵工艺学总论】第二章_工业发酵菌种

代表微生物类型 革兰氏阳性球菌
高产培养基设计的几个原则




制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素； 使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物 阻遏； 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。

酶发酵生产常用的微生物
微生物
枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 黑曲霉 米曲霉 青霉 木霉 根霉
生产的酶类
α -淀粉酶、蛋白酶、β -葡聚糖酶、碱性磷酸酶等 谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 糖化酶、 α -淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢 酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纤维素酶等 糖化酶和蛋白酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等 葡萄糖氧化酶、果胶酶、纤维素酶、磷酸二酯酶、脂肪酶、凝乳酶、核 酸酶等 纤维素酶等 糖化酶、 α -淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果 胶酶、纤维素酶等

样品的预处理

目的：提高分离效率 方法：


物理方法：热处理（减菌）；膜过滤法（浓缩）； 离心法（浓缩） 化学方法：通过在培养基中添加某些化学成分来增加特
定微生物的数量。
几丁质——放线菌；CaCO3——嗜碱性放线菌

诱饵法
石蜡、花粉、蛇皮、毛发等
分离方法的选择

根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法 菌种的营养特征独特 选择性分离 生长特征独特 无选择性特征 根据产物的特征进行 随机分离


增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长 或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选

发酵工程第二章发酵工业微生物菌种

发酵工程第二章发酵工业微生物菌种

李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽 土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的 土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果 生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐 败物品，某些水域等。
新种分离与筛选的步骤
（五）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为 生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种， 更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆 壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒 性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的 毒性试验。
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂
李 先 磊
Fermentation Engineering
生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培 养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一 点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离 法。
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
李 先 磊
（二）增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择 性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。

发酵工业菌种选育 菌种保藏方法

发酵工业菌种选育 菌种保藏方法
保护剂
保存期：4℃冰箱，保存5~10年适用：广泛缺点：繁琐，设备技术要求高
低温保藏法
真空冷冻干燥保藏法
保存期：-150℃~-169℃，保存15年适用：最为广泛优点：高效缺点：购置设备、费用高
干燥-载体保藏法
干燥-载体保藏法
寄主保藏法、基因工程菌保藏法
此方法适用于一些难以用常规方法保藏的动植物病原菌和病毒。
基因工程菌的保藏法
寄主保藏法
取细菌培养物，加入灭菌甘油(甘油应在1.034×105Pa高压下蒸汽灭菌20min），振荡培养物使甘油分布均匀，然后转移至标记好的、带有螺口和空气密封圈的保存管内，在乙醇-干冰或液氮中冻结后转至-70℃长期保存。复苏菌种时，用灭菌的接种针刮拭冻结的培养物表面，然后立即把黏附在接种针上的细菌划于含适当抗生素的LB琼脂平板表面于37℃培养过夜。
01
02
03
缺点：存活率低
矿物油浸没保藏法
矿物油浸没保藏法
悬液保藏法
原理
保藏时间
适用
悬液保藏法
寡营养保藏，是将微生物混悬于不含养分的媒液中，如蒸馏水、生理盐水、0.25mol/L磷酸缓冲液(pH6. 5)等，加以保藏的方法。
1年左右
大部分的放线菌、酵母菌、霉菌以及肠道科细菌等
真空冷冻干燥保藏法
2. 工业发酵菌种的选育
2.3.3 菌种保藏方法
斜面保藏法
斜面保藏法
适用：细菌、放线菌、酵母菌
保存期：1~6个月
条件：4℃冰箱，相对湿度50%~70%
影响因素：培养基和培养条件
优点：简单、成本低，随时观察菌株性状
缺点：自发突变、染：数年
适用：产孢子或形成孢芽的微生物

发酵工业菌种概述

发酵工业菌种概述

发酵工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料,简单培养基，大量高效地合成产物。 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可
操作性要强。 遗传性能要相对稳定。 不易感染它种微生物或噬菌体。 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病
菌无关。 生产特性要符合工艺要求。
发酵工业菌种概述
未培养微生物 是指迄今所采用微生物纯培养分离方法还未获得
的纯培养微生物，其在自然环境微生物群落中占有 非常高的比例，约为99％。
一些极端微生物，例如：高温、高压、低温、高 盐、高辐射、极强酸碱环境。
研究方法：模拟自然培养法、宏基因组分析法 （metagemomic analysis）
发酵工业菌种概述
• 细菌类：
短杆菌：GA, Gln, lys…… 枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性 蛋白酶等
地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温α-淀粉酶) 苏 云金芽孢杆菌：BT生物农药…… 梭状芽孢杆菌：丙酮、丁酸等的发酵
发酵工业菌种概述
放线菌：各种抗生素：链霉素、金、土、 庆大、卡那霉素等 链霉菌属：小单孢菌属 链霉素：灰色链霉菌、 氯霉素：委内瑞拉链霉菌 卡那霉素：卡那霉素链霉菌 葡萄糖异构酶：密苏里游动放线菌 庆大霉素：绛红小单孢菌、棘孢绛红小单
பைடு நூலகம்
发酵工业菌种概述
酵母菌 1 啤酒酵母：酿酒酵母、辅酶类物质的发酵 酒精酵母： 汉逊酵母：乙酸乙酯的发酵 假丝酵母：scp生产，石油发酵 担子菌：抗癌药物-1，2-B-葡萄糖苷酶 藻类 保健食品：螺旋藻
发酵工业菌种概述
霉菌 ：曲霉属、青酶属、 黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业（UV-11,UV-48）、 酶制 剂工业（糖化酶） 黄曲霉：酱油生产(3042)，面酱 青霉菌：青霉素的生产 红曲霉：红曲制造，用于南方红曲酒（女儿红）的生产； 使用红色色素的生产；豆腐乳的生产赤霉菌：赤霉素的 生产，是一种植物生长激素

发酵工业菌种

发酵工业菌种

I
II
无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大 有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性
试验菌
金黄色葡萄球菌209p 枯草杆菌6633 大肠杆菌 耻垢分枝杆菌607 白色念珠菌 青霉菌
代表微生物类型
革兰氏阳性球菌 革兰氏阳性杆菌 革兰氏阴性肠道细菌
结核杆菌 酵母状真菌 丝状真菌
菌种不易变异退化； 对放大设备的适应性强； 菌种不是病原菌，不产生任何有害的生
物活性物质和毒素。
1. 筛选的两种指导思想
先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。 分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。
结果有两种可能：
▪ 获得适于工业发酵菌株 ▪ 只获得选育所需的出发菌株
2.分离筛选工作在实际中应用的几个方面
选择性分离
无选择性特征 根据产物的特征进行
随机分离
▪ 选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控 制，从而实现定向富集筛选。
选择性分离原理和技术
生长条件的选择与控制原理 控制营养成分 控制培养基酸碱度 添加抑制剂 控制培养温度 控制通气条件
选择性分离技术 富集液体培养技术 施加选择压力，进行定向筛选 固体培养技术
在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（copy 法）
平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 u.v线杀死长好的菌落
随机分离方法
(用筛选方案- 检测系统进行间接分离）
富集液体培养 固体培养基条件培养 (初筛)
菌种纯化
复筛
菌种纯化
初步工艺条件摸索
再复筛 生产性能测试
较优菌株1-3株
保藏及进一步做生产试验 或作为育种的出发菌株
某些必要试验和 毒性试验等
含微生物样品的采集

发酵工业菌种.

发酵工业菌种.

酿酒酵母
假丝酵母
红酵母
（3）霉菌 是一群在营养基质上形成绒毛状、网状、 絮状菌丝真菌的通称。分布于偏酸性环境中， 常用的有根霉、毛霉、青霉等
根霉
曲霉
青霉
（4）放线菌 因其菌落呈放射状而得名。属原核微生物 类群。分布于有机质丰富的微碱性环境中，大 多腐生，少数寄生 。最大价值在于能生产多 种抗生素，从微生物中发现的抗生素有60%以 上的是来自于放线菌。 常用的有链霉菌属、小单孢属等。
分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用 透明圈法初筛
在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊 状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形 成清晰的透明圈

透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的 依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板 上圈的大小之间并不完全成正比。
但作为初筛的手段是有意义的
2.2.2 样品的预处理 预处理可提高菌种的分离效率，常使 用的方法有： （1） 物理方法： ① 热处理：常用来减少样品中的细菌数。 ② 膜过滤和离心法：用来浓缩水中的微生 物细胞。 （2） 化学方法： 在培养基中添加某些化学成分来增加 特定微生物数量。
（3）诱饵法： 将一些固体物质加到待分离的土壤或 水中做成诱饵富集目的菌。 2.2.3 富集培养 利用不同微生物生长繁殖对环境和营 养的要求不同，投其所好取其所抗，使目 的菌成为人工环境下的优势菌。
①了解微生物的代谢规律。如初级代谢基本 相同，但通常丝状菌及产芽孢细菌才能进 行次级代谢。 ②考虑微生物的生理特征。如营养类型、生 长环境等。
1 土样选择 如酵母菌 果园 产蛋白酶菌 鱼、肉加工厂 高温酶产生菌 火山或温泉 耐压菌 油井或海洋深处
2 采样深度 离地表5-25cm处较好。
3 季节条件 避免雨季，一般以秋季最理想。 4 采样方法 用无菌器具按规范取样，记录采样地 点、时间、环境情况等以备考证。

【发酵工程】余龙江版-第2章-发酵工业菌种

【发酵工程】余龙江版-第2章-发酵工业菌种
在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白 质等，同样可以促进水中微生物的增殖。
培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。 另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如
无菌的植物组织或土壤浸出液。 通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、
中温菌和嗜高温菌。
次代培养及纯化步骤
1. 采样
(2) 采样对象
土壤、水、空气及枯枝落叶等，以土壤为主。
从土壤中采样要考虑土壤的以下特点：
① 有机质含量和通风状况
耕地、菜园 山坡上的森林
（有机质丰富、通气保水性能好）——细菌、放线菌
（有机质丰富、阴暗潮湿）——霉菌、酵母菌
沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地
——微生物少
② 取样的土层深度：5-25cm
3. 富集培养
富集培养的策略
（2）控制培养条件
➢ 溶氧浓度——好氧/厌氧 ➢ 高温——嗜热微生物 /非嗜热微生物 ➢ PH——嗜酸性/嗜碱性
4. 菌种分离
平板划线分离法 稀释分离法 毛细管分离法 小滴分离法
• 稀释倒 平板法
稀释分离法
• 平板 涂布法
注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。
1. 采样
③ 土壤的酸碱度
偏碱——细菌、放线菌 偏酸——霉菌、酵母菌
④ 土壤的植被状况
葡萄成熟时——根部酵母菌增多
⑤ 地理条件
南方土壤比北方土壤微生物含量多
⑤ 季节条件
秋季菜土样最理想
2.样品的预处理
（1）物理方法
热处理：根据目的菌较非目的菌的耐热性高 从而增加目的
菌的比例。
膜过滤法：浓缩水中的微生物细胞。 离心法：同上。
植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出 液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂 布平板。

发酵工业菌种选育 自然选育

发酵工业菌种选育 自然选育
1、微生物选择性分离原理 根据菌种的特性，通过控制营养和培养条件以有利于待分离菌株的生长和抑制非目的微生物的生长，或 通过添加显色剂、指示剂以方便待分离菌株的挑选，还有根据目的微生物的生理特性或利用某些代谢产 物生化反应来设计选择培养基进行分离的方法。
利用平板的生化反应进行分离的方法
变色圈法
在底物平板上加人指示剂或显色 剂，由于目的微生物分解底物或代 谢产物引起平板上出现变色圈，使 所需微生物能够被快速鉴别出来。
2. 工业发酵菌种的选育
2.2.1 自然选育
自然选育的概念
在生产过程中，不经过人工诱变处理，利用菌种的自发突变面进行菌种筛选的过程，称为自然选育或自 然分离。
自然选育的步骤
1.采样
• 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中， 以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼 泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果 园内。
• 纤维素酶产生菌选择枯枝落叶富含纤维素的森林土；
• 淀粉酶产生菌选择面粉厂、酒厂、糕点厂等场所的 土壤；
• 蛋白酶和脂肪酶产生菌可选择肉类加工厂附近污泥 等。
自然选育的步骤
从自然界筛选
自然选育的步骤
• 采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 • 采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表
土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的 牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时 间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样 中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步 分批寄回，以便及时分离。
自然选育的步骤 目的微生物富集的一些基本方法
➢富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。 ➢富集的主要方案： 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件， 进行培养。控制营养和培养条件增加目的微生物数量， 也可高温高压、加入抗生素等减少非目的微生物的数量长圈法

发酵工程 2 发酵工业菌种

发酵工程 2 发酵工业菌种
2
思考题
发酵工业菌种
1、常见的工业微生物包括哪些类群？
2、作为工业生产菌株应具备哪些基本特性？ 3、了解发酵工业中的细菌、酵母菌、霉菌、放 线菌及其生产的产品。 4、掌握菌种分离筛选的基本过程。
5、诱变育种及其原理。
6、常用的化学诱变剂。
7、菌种退化、原因与防治。
8、菌种保藏的方法。
广义的微生物：
5．其它 担子菌：香菇、灵芝等。 藻类：螺旋藻、单胞藻等。 基因工程菌：基因工程菌在发酵工程已得到广泛 应用，如酶制剂、胰岛素、干扰素、生长激素、 乙型肝炎病苗等的生产。
二、工业生产对菌种的要求 （1）能在廉价原料制成的培养基上生长，且 生成的目的产物产量高、易于回收； （2）生长较快，发酵周期短；
挑出高产斜面
1、自然选育 不经人工处理，利用微生物的自然突变进行 菌种选育的过程称为自然选育（spontaneous
mutation）。
自然选育最为成功的例子是目前被广泛使
用的卡介苗(BCG vaccine)。法国的卡尔密脱
(Calmette)和介林(Guerin)把牛型的结核分枝 杆菌接种在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上， 连续传代培养230代，前后经历13年时间，终 于在1923年获得显著减毒的结核杆菌----卡介
能力和转化蔗糖的性能，还能产生脂肪酶。能发
酵产生乳酸、反丁烯二酸。
华根霉：华根霉多出现在我国酒药和酒曲中， 具较强的耐高温性能（45℃能生长），淀粉酶液 化力强，有溶胶性，能产生酒精、芳香脂类、乳 酸及反丁烯二酸，能转化甾族化合物。
4）红曲霉属(Monascus) 菌丝呈红色以至紫色，
可由我国南方红曲中分离得到。
一个或少数几个核苷酸的插入或缺失，从而使该部
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二 ①施加选择性压力
、 发
压力的选择 营养、环境条件
酵
工 ②随机分离法
业
菌 种
抗生素产生菌的分离:如抑菌圈法、稀释法、
的 分
扩散法、生物自显影法
离 筛
酶抑制剂产生菌的分离 体外
选 抗病毒药物产生菌的分离 噬菌斑
发 酵 工 程 — 菌种
6.发酵性能测定
二 、
对筛选出的菌种进行生产性能测定。这些特
发 酵 工
菌 种
须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，
选 育
且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其
常 敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要
规 当心。
育
种
发 酵 工 程 — 菌种
诱变剂的选择
①碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但
三 、
很少使用，回复突变率高，效果不大。
优 良 菌
②亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的 遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙
三 前体或产品的耐受力。
、 优
(4)抑制或消除产品分解酶。
良 菌 种
(5)改进菌种外泌产品的能力。 (6)消除代谢产品的反馈抑制。
选
育
发 酵 工 程 — 菌种
具体来讲，有以下途径：
㈠提高特定基因的表达水平
三 、
(1)引入强转录及翻译信号，可通过在一高效
优 良 菌
表达载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引 入强启动子；修改现有表达信号，提高基因
二、发酵工业菌种的分离筛选
二 、
典型步骤：样品采集→样品预处理→目标菌 富集→初筛→复筛→发酵性能测试→菌种鉴
发 酵
定→菌种保藏
工
业 菌
1.含微生物材料的样品采集
种
的 分
先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特
离 性，有针对性地采集样品。
筛
选
发 酵 工 程 — 菌种
2.标本的预处理：优化目标菌生长环境
发 酵 工 程 — 菌种
1.菌种代谢生理与分子生物学
初级代谢与次级代谢
三 代谢调控机制：酶活成的调节(诱导、阻遏)；
、 优
酶活性的调节(激活、抑制)
良
菌
种
选
育
发 酵 工 程 — 菌种
2.工业菌种的育种
包括下列3个步骤：
三 (1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型
、 的引入。
优 良
(2)希望基因型的选出。
、 的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培
优 良
养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。
菌
种
选 育
诱变处理
常 根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结
规 育
合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。
种
发 酵 工 程 — 菌种
中间培养
由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一
三 、
个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀
工业菌种改良途径
(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过
增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表
Байду номын сангаас三 、
达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中
优 引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代
良 菌
谢途径。
种 选
(2)增加前体物的浓度。
育
发 酵 工 程 — 菌种
(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以
及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、
性包括形态、培养特征、营养要求、生理生 化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受
业 菌
最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、
种 提取工艺等。
的
分
离
筛
选
发 酵 工 程 — 菌种
7.菌种鉴定：经典方法、现代方法
二 、
菌种鉴定手段包括常规鉴定、 BIOLOG碳源
发 自动分析鉴定和分子生物学鉴定及其他手段
二、发酵工业菌种
发 酵 工 程 — 菌种
发 酵 工 程 — 菌种
发酵工业对菌种的要求
①培养基原料来源广、廉价；
一 、
②培养条件易控制；
发 ③发酵周期短；
酵 工
④菌株高产；
业 菌 种
⑤抗病毒（噬菌体）能力强； ⑥菌株性状稳定，不易变异退化；
概 述
⑦菌体本身不能是病原菌；
一、发酵工业菌种概述
发 酵 工 程 — 菌种
三 化学诱变剂使用过程的安全性
、
优 良 菌
诱变剂量的选择：亚硝酸，0.07M Na2HPO4； 亚硝基胍，1M NaOH；
种
选 诱变剂的选择
育
常 出发菌株的选择
规 育 种
发 酵 工 程 — 菌种
诱变育种的原理
三 、
物理诱变剂：射线如紫外线、X-射线、γ-射 线，快中子；
优 良 菌
物理因素中目前使用得最方便而且十分有效 的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫
速率大的细胞留在培养器中。
发 酵 工 程 — 菌种
4.菌种分离
二 从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌
、 发
种的特性，采用各种筛选方法，准确地把所
酵 工
需要的菌种挑选出来。
业 菌
通过稀释平板、平板划线、平板涂布等手段
种 的
获得单菌落，再进一步获得纯化菌种。
分
离
筛
选
发 酵 工 程 — 菌种
5.菌种初筛、复筛
用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变 进行的筛选，称为诱变育种
常 规
诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称
育 种
为诱变剂
发 酵 工 程 — 菌种
三
、
优
良
菌 种
诱变剂
选
育
常 规 育 种
物理：紫外线，高能粒子（Co60等） 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍等
发 酵 工 程 — 菌种
诱变剂处理过程中几个有关的问题
不易感染它种微生物或噬菌体
发 酵 工 程 — 菌种
产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学 上最好与致病菌无关）
三 生产特性要符合工艺要求
、
优 工业菌种的育种：
良 菌
运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物
种 选
技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过
育 改造，可使现存的优良性状强化，或去除不
良性质或增加新的性状。
育
发 酵 工 程 — 菌种
育种方法：常规育种、细胞工程、基于代谢
调节的育种、基因工程、蛋白质工程、代谢
三 工程等。
、 优
良 常规育种方法中，包括自然选育、诱变育种；
菌 种 选
育 自然选育
常 规
以微生物的自然变异作为基础的生产选种的
育 种
机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅 10-8-10-9左右。
种 选
酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是
育 毒性最小的诱变剂之一。
常 ③吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完
规 育
全中断。
种
发 酵 工 程 — 菌种
④紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色
三 、
体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回 复的缺失突变。但它可能影响邻近基因的性
优 良
能。
菌
种
选
育
常 规 育 种
菌 种 选
(3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生 产规模)。
育
发 酵 工 程 — 菌种
选择育种方法时综合考虑的因素
(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系
三 、
(如批式或连续发酵试验)； (2)对这一特定菌种的遗传和生物化学方面认
优 良
识的明了程度；
菌 (3)经济费用。
种
选
育
发 酵 工 程 — 菌种
种 选
效力等。
育 (2)诱导解除基因表达抑制的突变。
发 酵 工 程 — 菌种
㈡改进菌种的生长效率
提高菌株对底物的利用率方法：
三 、
a.通过确定并改变代谢中的耗能部分; b.由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实
优 良
现。
菌 种 选
c.赋予菌种对多种底物，特别是价廉而丰富 的底物的利用能力，由此可降低操作费用。
二 物理方法、化学方法、诱饵法
、
发 3.富集培养
酵
工 业
使混合微生物群体中某特定微生物比例激增
菌 的培养方法。可用促进某特定微生物生长繁
种 的
殖的选择性培养基或培养条件；或用抑制其
分 离 筛
他微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条 件；或用连续培养法，在一定稀释率下，使
选 比生长速率小的细胞溢出培养器，而比生长
良 菌
主。因此在具体方法上就有差异。
种 选
初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某
育 些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的
常 大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。
规 育
在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛
种 的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复
筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。
常 规 育 种
发 酵 工 程 — 菌种
操作步骤
①将细菌培养液以3000r/min离心5min，倾去
三 、
上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离
优 心洗涤。
良 菌
②将菌悬液放入装有玻璃珠的三角瓶内打散
种 选 育
优 良 菌
释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将 突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选
种 选
和获得稳定菌株都是极为重要的。
育
常 规 育 种