当前位置：文档之家 › CTAB法提DNA

CTAB法提DNA

  • 格式：docx
  • 大小：18.28 KB
  • 文档页数：2

一、CTAB法提取DNA主要试剂及配方：

CTAB缓冲液（2%）：

试剂 用量(g/L)

CTAB 20

NaCl 81.816

Tris-base 7．444

EDTA-Na2 12.114

β巯基乙醇 2~3mL

pH 8.0

称量好后65℃水浴，搅拌，直至完全溶解，然后定容，调pH

24:1溶液：

24:1为体积比，如果是一瓶新的三氯甲烷（500mL），可直接加入21mL异戊醇即可。

70%乙醇：

二、CTAB法提取DNA的简要步骤

步骤 备注

1将新鲜叶片叶脉去掉，剪碎置于研钵中，加入液氮快速研磨成粉末状，转入2mL离心管，加入65℃预热的CTAB提取液900 uL充分混匀，65℃保温40

-60min，在此期间轻轻颠倒离心管几次。 加入CTAB后，需及时充分混匀，然后水浴。开始混匀可以使劲，后面的混匀要轻，保证DNA的完整性。此步骤是裂解细胞，释放细胞产物

2水浴完后，冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)混合液轻轻摇动10 min。12000 r/min离心10 min； 第一次抽提24:1尽量加满2mL的离心管，摇和离心的时候尽量轻拿轻放。此步骤是用氯仿抽提有机相，异戊醇的作用是去除气泡。

3取上清液，再用等体积的氯仿/异戊醇抽提一次，12000 r/min离心10 min； 离心后，DNA溶于上层水相，变性蛋白溶于下层氯仿，第二次24:1抽提加1mL即可。

4小心吸出上清液于另一2mL离心管中，加入0.6倍上清液体积的异丙醇，缓慢混匀，于-20℃冰箱中沉淀DNA； 第二次吸上清尽量不要吸到中间层，按需要浓度大小，可选择性吸取。异丙醇用前需预冷。

5挑出成团的DNA，用70％乙醇洗2～3次； 挑出的DNA还是含有一定的杂质，因此，第一次70%乙醇洗时间建议长些，一般不低于10分钟，期间上下摇晃几次，但不可太长，否则DNA要断裂

6无水乙醇洗1次；

7倒干残余乙醇，自然干燥 也可以进行真空干燥

8加无菌水溶解DNA

RNA酶可以加到水中，溶解DNA 9 RNA去除，按100微升DNA溶液加1微升RNA酶

10溶解后放置几小时后（尽量过夜）便可电泳检测，浓度测定

三、提取过程中可能出现的一些情况（主要是提玉米DNA）

可能出现的情况 可能原因 建议

第一次24:1抽提后上清是绿色的浑浊液体。 样取的较多 1、样品取样适量；2、加CTAB时可以适量多点。

第一次上清是褐色的（正常情况应该是浅黄色，透明） 样品在裂解过程中被氧化了或是降解了。 取样的时候尽量取了及时放在液氮中；确定β巯基乙醇按比例加在了CTAB缓冲液中；再者，样磨完了加CTAB缓冲液的时候速度要快，混匀要充分；如果机器磨样，尽量倒出钢珠，再加CTAB缓冲液。

加入异丙醇后没见絮状沉淀 取样太少；样品碾磨不够好 12000r/min离心2min，一般都会有沉淀附着管壁，同样可以收集到DNA。

DNA电泳检测时候有拖尾，点样孔不干净 拖尾是DNA降解，点样孔不干净是含有部分蛋白 对于这两种情况，只能尽量做好每一步，减少每一步不必要的影响

四、10×TBE配方

Tris-base 108g/L

硼酸 55 g/L

EDTA-Na2 7.444 g/L

pH 8.0

合集下载

CTAB法提DNA

CTAB法提DNA

CTAB法提取基因组DNA

（1）水浴加热CTAB提取液至60-65℃；

（2）取叶片200 mg，液氮研磨成粉末；

（3）用预冷的小药匙将粉末迅速转入预冷的1.5 mL 离心管中加入650 µL

CTAB提取液并且迅速混匀；

（4）60°C-65℃水浴30 min至1 h，期间每隔5-10 min轻摇一次；

（5）加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混合；

（6）12,000 rpm离心10 min，将上清液转移到新管中，注意不要触动中间的蛋白质层；

（7）向上清中加入0.6倍至等体积异丙醇（提前预冷），颠倒混匀，-20℃冰箱中静止15min使DNA从溶液中析出，形成絮状沉淀；

（8）12,000 rpm离心10 min收集DNA沉淀，弃上清，75%酒精洗涤（两次），晾干，加入适量超纯水溶解，置于-20℃保存；

溶解后的DNA取部分稀释至100 ng/µL备用。

植物总DNA提取缓冲液（CTAB提取缓冲液）：Tris·Cl pH 8.0 100 mM，EDTA

20 mM，NaCl 1.4 M，CTAB 2%（w），巯基乙醇 0.2%（先将除巯基乙醇之外的药品配好，高压蒸汽灭菌之后加入巯基乙醇）。

CTAB法提取动物DNA

CTAB法提取动物DNA

赵瑞杰　严海燕　谭艳平　王朝元　林爱华　

（中南民族大学生命科学院，湖北武汉４５００７５）　厂＿］　董　

摘要：针对实际操作中常用的动物基因组ＤＮＡ提取方法所面临的一些不足，对ＣＴＡＢ法进行改进，将其运用于动物基因　

组ＤＮＡ的提取。结果表明，改进后的ＣＴＡＢ法具有时间短、质量高、成本低的优点，与实验教学中植物ＤＮＡ和ＲＮＡ提取的方　

法相一致，使分子生物学教学用品一体化，价格低廉化，效果改进，是一个不仅可以用于研究，也可以大规模用于实验　

教学的好方法。　关键词：ＤＮＡ提取，ＣＴＡＢ法，动物基因组　

ＤＯＩ：１　０．；５９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１　６７１—６５９６．２０１　１．２１．００４　

Ａｎｉｍａｌ　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｃ１＝ＡＢ　Ｍｅｔｈｏｄ　ＺＨＡＯ　Ｒｕｉ．ｉｉｅ，ＹＡＮ　Ｈａｉ．ｙａｎ，１＝ｃ　Ｎ　Ｙ＿ａｎ．ｐｉｎｇ，、）ｌ　ＮＧ　Ｃａｏ．ｙｕａｎ，ＬＩＮ　Ａｉ．ｈｕａ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｏｕｔｈ．ｃｅｎｔｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｗ＿ｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ　４３００７３）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＤＨｅ　ｔｏ　ｓｏｍｅ　ｄｅｆｅｃｔｓ　ｅｘｉｓｔｅｄ　ｉｎ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｒｏｍ　ａｎｉｍａｌ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｒｏｕｔｉｎｅ　ｌａｂ　ｗｏｒｋ．ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＣＴＡＢ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ａｎｉｍａｌ　ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ　ｈａｄ　ｐｒｉｖｉｌｅｇｅｓ　ｏｆ　ｓｈｏｒｔ　ｔｉｍｅ　ｓｐａｎ，ｈｉｇｈｅｒ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｐｒｏｄｕｃｔ，ｌｏｗ　ｃｏｓｔ，ａｎｄ　ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ　ｆｏｒ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｌａｂ　ｔｅａｃｈｉｎｇ．ｉｎ　ｗｈｉｃｈ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｐｌａｎｔ．ｍａｋｉｎｇ　ｉｔ　ａ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌａｂ　ｔｅａｃｈｉｎｇ．Ａｎｄ　ｔｈｕｓ．ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｎｏｔ　ｏｎｌｙ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｂｕｔ　ａｌｓｏ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｃａｌｅ　ｌａｂ　ｔｅａｃｈｉｎｇ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ；Ａｎｉｍａｌ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　

CTAB法提取基因组DNA

CTAB法提取基因组DNA

CTAB法[30]提取玉米（或其它植物）基因组DNA

1) 取0.5~1 g玉米叶片，加入液氮粉碎，加入2mL 2% 65℃保温的2×CTAB抽提液，混匀，65℃保温30～60min。

2) 加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀，10000r/min，离心5min。

3) 取上清，加入1/10体积（约0.2mL）的65℃的10×CTAB/NaCl溶液，颠倒混匀。

4) 用等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提，10000r/min，离心5min。

5) 取上清，加入（正好）等体积的CTAB沉淀液，颠倒混匀，如沉淀可见，继续做下步，否则，65℃保温30min。

6) 4℃，2700 r/min，离心5min。

7) 去上清，用高盐的TE buffer重悬（0.25～0.5mL）。（可65℃保温30min，至大部分溶解）。

8) 加入0.6体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀，4℃，10000 r/min，离心15min。

9) 去上清，80%乙醇洗涤沉淀，干燥，用尽可能少的TE buffer重悬。

高盐的TE buffer

终浓度 配制50ml

10mM Tris.Cl, pH8.0 0.5ml(1M 母液)

0.1mM EDTA, pH8.0 0.01ml(0.5M 母液)

1M NaCl 1.8g

室温可保存几年

CTAB提取液

终浓度 配制200ml

2%(W/V) CTAB 4g

100mM Tris.Cl, pH8.0 20ml(1M 母液)

改良CTAB法提取DNA

改良CTAB法提取DNA

改良CTAB法提取黄瓜RNA

1、叶片液氮研磨，0.05g放入2ml离心管中，加入1mlCTAB裂解液，20ulβ-巯基乙醇提取缓冲液65℃水浴30-40min。800

2、8000rpm离心5min，取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）混匀离心8min,(重复1次，2ml离心管)600 500

3、取上清，加入1/4体积的LiCl(10M),-20℃放置2-3h(1.5ml离心管).125ul

4、10000 rpm/min离心10min，沉淀用100ulDEPC-H2O溶解。

5、 溶解液中加入等体积的酸酚/氯仿/异戊醇(25:24：1)抽提（酸酚现加）涡旋混匀，12000 rpm离心10min.

6、上清液用等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提1-2次，冰上放置5-10min，12000 rpm离心10min.80

7、 取上清加入1/30体积的NaAC（pH=5.2）、1/10体积的无水乙醇冰浴10min（冰箱），12000 rpm离心10min（去糖）。60

8、取上清加入1/10体积的NaAC，2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置30-40min，12000 rpm离心15min.

9、去上清，用70%乙醇洗涤2次，每次洗后10000 rpm离心3min，风干沉淀用50ulDEPC- H2O溶解（不可太干，否则难溶解）.

10、取5ul溶解的RNA用紫外分光光度计测定260nm处吸光度，并计算RNA含量，再取1-3ug用于1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。如果质量好，DNAase酶消化后超低温冰箱保存。