ctab法提取dna的原理

赵瑞杰　严海燕　谭艳平　王朝元　林爱华　

（中南民族大学生命科学院，湖北武汉４５００７５）　厂＿］　董　

摘要：针对实际操作中常用的动物基因组ＤＮＡ提取方法所面临的一些不足，对ＣＴＡＢ法进行改进，将其运用于动物基因　

组ＤＮＡ的提取。结果表明，改进后的ＣＴＡＢ法具有时间短、质量高、成本低的优点，与实验教学中植物ＤＮＡ和ＲＮＡ提取的方　

法相一致，使分子生物学教学用品一体化，价格低廉化，效果改进，是一个不仅可以用于研究，也可以大规模用于实验　

教学的好方法。　关键词：ＤＮＡ提取，ＣＴＡＢ法，动物基因组　

ＤＯＩ：１　０．；５９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１　６７１—６５９６．２０１　１．２１．００４　

Ａｎｉｍａｌ　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｃ１＝ＡＢ　Ｍｅｔｈｏｄ　ＺＨＡＯ　Ｒｕｉ．ｉｉｅ，ＹＡＮ　Ｈａｉ．ｙａｎ，１＝ｃ　Ｎ　Ｙ＿ａｎ．ｐｉｎｇ，、）ｌ　ＮＧ　Ｃａｏ．ｙｕａｎ，ＬＩＮ　Ａｉ．ｈｕａ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｏｕｔｈ．ｃｅｎｔｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｗ＿ｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ　４３００７３）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＤＨｅ　ｔｏ　ｓｏｍｅ　ｄｅｆｅｃｔｓ　ｅｘｉｓｔｅｄ　ｉｎ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｒｏｍ　ａｎｉｍａｌ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｒｏｕｔｉｎｅ　ｌａｂ　ｗｏｒｋ．ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＣＴＡＢ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ａｎｉｍａｌ　ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ　ｈａｄ　ｐｒｉｖｉｌｅｇｅｓ　ｏｆ　ｓｈｏｒｔ　ｔｉｍｅ　ｓｐａｎ，ｈｉｇｈｅｒ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｐｒｏｄｕｃｔ，ｌｏｗ　ｃｏｓｔ，ａｎｄ　ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ　ｆｏｒ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｌａｂ　ｔｅａｃｈｉｎｇ．ｉｎ　ｗｈｉｃｈ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｐｌａｎｔ．ｍａｋｉｎｇ　ｉｔ　ａ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌａｂ　ｔｅａｃｈｉｎｇ．Ａｎｄ　ｔｈｕｓ．ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｎｏｔ　ｏｎｌｙ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｂｕｔ　ａｌｓｏ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｃａｌｅ　ｌａｂ　ｔｅａｃｈｉｎｇ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ；Ａｎｉｍａｌ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　

前言：今天终于把一株黑曲霉DNA提取出来了，由于实验室条件简陋，购买试剂盒不划算，只好发挥实验室一切能用到的方法：冰冻、水煮、微波、超声波、溶菌酶解，等等效果都不佳，无奈，这次结合几种方法在一起，虽然有点麻烦，但是效果还可以，用来扩增16S没有一点问题，提取霉菌DNA只是雕虫小技，在此献丑了。

改良的CTAB法提取霉菌DNA

1、PDA液体培养基，32℃过夜培养菌体，取1ml菌液于1.5ml 离心管，8000rpm离心3min，去上清，再取1ml 1倍PBS漂洗，去上清，吸干水分，65℃烘箱中烘约30min，至半干燥

2、液氮充分研磨后， 加入0.3 ml 3% CTAB提取缓冲液；

3、65℃水浴45 min，取上清转到离心管中， 加入40 μl 1 mg/ml蛋白酶K，15ul 10mg/ml 溶菌酶，

37℃水浴30min；

4、 加入350 μl Tris饱和酚， 摇匀， 13000 r/min离心10min；

5、取上清， 加入等体积的氯仿/异戊醇， 摇匀，13000 r/min离心10 min；

6、1/10体积3M醋酸，等体积异丙醇沉淀1h

7、离心，弃上清，70%酒精洗涤1-2次。

8、弃上清，晾干后用ddH2ORanase水溶解。

附效果：

左边：DNA扩增16SrDNA 中间：Marker 2000bp-100bp 右边：DNA效果图

参考：1、吴发红， 黄东益， 黄小龙等，几种真菌DNA提取方法的比较 ，中国农学通报 2009

2、scau 农学院分子遗传实验室历届研究生内部资料。

后记：参考吴等人的方法，其步骤更为复杂，要用到大离心管，小量抽提DNA不太可取，若小量抽提用他们的方法，结果是没有DNA.故此我做了两点改变：1、65℃水浴后，直接加酶，37℃温浴，时间可以不变，2、第一次氯仿：异戊醇抽提后，直接用异丙醇沉淀，酒精洗涤。省时，且能保证DNA的量。 另外我多了溶菌酶，没做对照，也不知道有没有起作用，如果实验室没有条件，也可以不加试试。其实很多方法都能提取到霉菌DNA，关键还是要根据自己实验室的条件，做适当的调整。

CTAB法[30]提取玉米（或其它植物）基因组DNA

1) 取0.5~1 g玉米叶片，加入液氮粉碎，加入2mL 2% 65℃保温的2×CTAB抽提液，混匀，65℃保温30～60min。

2) 加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀，10000r/min，离心5min。

3) 取上清，加入1/10体积（约0.2mL）的65℃的10×CTAB/NaCl溶液，颠倒混匀。

4) 用等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提，10000r/min，离心5min。

5) 取上清，加入（正好）等体积的CTAB沉淀液，颠倒混匀，如沉淀可见，继续做下步，否则，65℃保温30min。

6) 4℃，2700 r/min，离心5min。

7) 去上清，用高盐的TE buffer重悬（0.25～0.5mL）。（可65℃保温30min，至大部分溶解）。

8) 加入0.6体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀，4℃，10000 r/min，离心15min。

9) 去上清，80%乙醇洗涤沉淀，干燥，用尽可能少的TE buffer重悬。

高盐的TE buffer

终浓度 配制50ml

10mM Tris.Cl, pH8.0 0.5ml(1M 母液)

0.1mM EDTA, pH8.0 0.01ml(0.5M 母液)

1M NaCl 1.8g

室温可保存几年

CTAB提取液

终浓度 配制200ml

2%(W/V) CTAB 4g

100mM Tris.Cl, pH8.0 20ml(1M 母液)

改良CTAB法提取黄瓜RNA

1、叶片液氮研磨，0.05g放入2ml离心管中，加入1mlCTAB裂解液，20ulβ-巯基乙醇提取缓冲液65℃水浴30-40min。800

2、8000rpm离心5min，取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）混匀离心8min,(重复1次，2ml离心管)600 500

3、取上清，加入1/4体积的LiCl(10M),-20℃放置2-3h(1.5ml离心管).125ul

4、10000 rpm/min离心10min，沉淀用100ulDEPC-H2O溶解。

5、 溶解液中加入等体积的酸酚/氯仿/异戊醇(25:24：1)抽提（酸酚现加）涡旋混匀，12000 rpm离心10min.

6、上清液用等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提1-2次，冰上放置5-10min，12000 rpm离心10min.80

7、 取上清加入1/30体积的NaAC（pH=5.2）、1/10体积的无水乙醇冰浴10min（冰箱），12000 rpm离心10min（去糖）。60

8、取上清加入1/10体积的NaAC，2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置30-40min，12000 rpm离心15min.

9、去上清，用70%乙醇洗涤2次，每次洗后10000 rpm离心3min，风干沉淀用50ulDEPC- H2O溶解（不可太干，否则难溶解）.

10、取5ul溶解的RNA用紫外分光光度计测定260nm处吸光度，并计算RNA含量，再取1-3ug用于1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。如果质量好，DNAase酶消化后超低温冰箱保存。