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酶工程第五章酶细胞原生质体固定化优秀课件

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酶与细胞的固定化课件.ppt

酶与细胞的固定化课件.ppt

采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶的热稳定性
固定化果胶酯酶的pH稳定性
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶作用的最适温度
固定化果胶酯酶作用的最适pH值
5、酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 二者电荷不同，因静电作用，固定化酶的表观Km值低于溶液的Km值； 电荷相同，由于亲和力降低，固定化酶的表观Km值显著增加。
Cefaclor(R1=H,R3=Cl) Cephalexin(R1=H,R3=Me) Cefadroxil(R1=OH,R3=Me)
酶促合成头孢类抗生素
CHCOOCH3 + H2N
NH2
O
S
Synthetase
N CH3
COOH
Esterase
CHCOOH +
NH2
CHCONH
NH2 O
S
N CH3
交联法有2种形式即酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。
酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间 的平衡。
酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起 酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、 血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。
二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征 （一）固定化酶的性质 1、酶的活性 多数情况下固定化酶的活力常低于天然酶。原因：酶结构变化与空间
位阻。
2、酶的稳定性 大多数固定化酶具有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命。

第五章 酶、细胞、原生质体固定化

第五章 酶、细胞、原生质体固定化

3．最适PH值： 最适PH值 酶经过固定化后，其作用的最适pH值往往会发生一 酶经过固定化后，其作用的最适pH值往往会发生一 些变化。这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。 些变化。这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。影 响固定化酶最适pH值的因素主要有两个 值的因素主要有两个， 响固定化酶最适pH值的因素主要有两个，一个是载体的 带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质。 带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质。 4．底物特异性： 底物特异性： 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同， 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同， 其变化与底物分子量的大小有一定关系。 其变化与底物分子量的大小有一定关系。
二、固定化微生物细胞的特点
① 固定化微生物细胞保持了细胞的完整结构和天然 状态，稳定性好。 状态，稳定性好。 ② 固定化微生物细胞保持了细胞内原有的酶系、辅 固定化微生物细胞保持了细胞内原有的酶系、 酶体系和代谢调控体系，可以按照原来的代谢途径进行 酶体系和代谢调控体系， 新陈代谢，并进行有效的代谢调节控制。 新陈代谢，并进行有效的代谢调节控制。 ③ 发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长 发酵稳定性好， 的一段时间。例如，用海藻酸钙凝胶包埋法制备的黑曲 的一段时间。例如， 霉细胞，用于生产糖化酶可以连续使用一个月。化动物细胞可反复使用或连续使用较长的时 间。例如，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)生产人干扰素可以 例如，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)生产人干扰素可以 稳定地生产30 d。 稳定地生产30 d。 ④ 固定化细胞易于与产物分开，利于产物分离纯化， 固定化细胞易于与产物分开，利于产物分离纯化， 提高产品质量。 提高产品质量。
②包埋法：是将植物细胞包埋在琼脂、角叉菜胶、 包埋法：是将植物细胞包埋在琼脂、角叉菜胶、 海藻酸钙凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、明胶等多孔凝胶之中。 海藻酸钙凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、明胶等多孔凝胶之中。 包埋方法与微生物细胞包埋时基本相同。此法已在 包埋方法与微生物细胞包埋时基本相同。 植物细胞固定化，以及发酵生产刺激代谢物方面广泛应 植物细胞固定化， 用。 1979年 Brodelius等人首次用海藻酸钙凝胶包埋 1979年，Brodelius等人首次用海藻酸钙凝胶包埋 法制备固定化长春花细胞、毛地黄细胞和海巴戟细胞， 法制备固定化长春花细胞、毛地黄细胞和海巴戟细胞， 开创了植物细胞固定化的研究。 开创了植物细胞固定化的研究。

酶的固定化ppt课件

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b．将植物细胞吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝中，或将 植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。 (2)固定化细胞的优点 ①固定化细胞仍能进行正常的生长、繁殖和代谢，可以像 游离的细胞一样用于发酵生产。 ②固定化细胞技术免去了破碎细胞提取酶等步骤，能充分 利用细胞内的酶，因而，固定化细胞内酶的活性基本没有 损失。 ③保留了细胞内原有的多酶系统，对于多步催化的连续反 应优势就更加明显。
2．用固定化酵母细胞发酵(应用) (1)将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗2～3次。 (2)将150 mL质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200 mL 的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25 ℃下发酵 24 h，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒香。
【巩固2】 酶固定化技术与细胞固定化技术的关系是 ( )。 A．酶固定化技术是细胞固定化技术的基础 B．细胞固定化技术是酶固定化技术的基础 C．酶固定化技术与细胞固定化技术是同时发展起来的 D．细胞固定化技术先于酶固定化技术
C．包埋法
D．交联法
答案 B
2． 固定化细胞常用包埋法固定化，原因是
( )。
A．包埋法固定化操作最简便
B．包埋法对酶活性的影响最小
C．包埋法固定化具有普遍性
D．细胞体积大，难以被吸附或结合
解析 因为细胞个大，而酶分子很小，个大的细胞难以被
吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。
答案 D
3． 根据酵母细胞固定化技术，回答下列有关问题。 (1)酵母细胞的活化：向干酵母中加入________，使其恢复 正常的________。 (2)配制CaCl2溶液。 (3)配制海藻酸钠溶液。在加热时要用______或______。 (4)________溶液与________混合。 (5)固定化酵母细胞。 (6)用固定化酵母细胞发酵：将凝胶珠加入用于发酵的 ________溶液后，发现有________产生，同时有________ 味散发。 答案 (1)蒸馏水 生活状态 (3)小火 间断加热 (4)海藻酸钠 酵母细胞 (6)葡萄糖 气泡 酒

酶、细胞、原生质体的固定化-PPT课件

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吸附法
共价偶联法
交联法
包埋法
酶的四种固定化方法
各种固定化方法的优缺点比较
固定化方法
吸附法
物理吸附法 离子吸附法
易 中等 高 可能 低 不变 易 弱 高，酶易流失 可能 低 不变
包埋法
共价结 交联法 合法 难 强 低 不能 高 可变 较难 强 中等 不能 中等 可变
制备难易 结合程度 活力回收 再生 费用 底物专一性
酶固定化的方法


依据酶的性质及用途不同，可分为吸附法、结 合法、交联法、包埋法4种 吸附法
最简单、最经济的方法，可分为物理吸附法和离子 交换吸附法，常用的载体有无机载体（如活性炭、氧 化铝、硅藻土、多孔玻璃、磷酸钙、金属氧化物等）、 有机载体以及淀粉、白蛋白等天热高分子载体。吸附 过程可达到纯化和固定化的目的，而且酶失活后可重 新活化再生。
较难 强 高 不能 低 不变
耦合固定法

单一的吸附固定化酶存在酶和载体容易脱落、结合不牢固等问题。 为解决上述问题，研究者不断提出新的载体和固定化方法并在耦 合固定化方面进行了大量的研究，所谓耦合固定化是指几种固定 化方法或载体的联合使用，即添加稳定因子和促进因子的固定化 方法。耦合固定化技术能够平衡和改善传统单一固定化方法的优 缺点，使酶在保持原有活性的基础上， 稳定性有所提高， 还具 有操作简单，成本低廉等优点。

结合法
根据酶与载体结合的化学键不同，可分为离子结 合法和共价结合法。 离子结合法是通过离子键结合于具有离子交换基 因的水不溶性载体的固定化方法。常用的阴离子交换 剂载体：DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶， Amerlite IRA-193、IRS-410、IRA-900;阳离子交换 剂载体有CM-纤维素， Amerlite CG-50、IRC-50、 IR-120，Dower-50等。

酶细胞原生质体的固定化.pptx

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由于其失去了分子间相互作用的机会，从而抑制降 解并有利于提高稳定性。
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3、固定化酶的最适pH变化
• 原因可能是：
（1）载体性质对最适pH值的影响（微环境表面电荷的影响） 带负电荷载体（阴离子聚合物）制备的固定化酶，其最适 pH值较游离酶偏高。 原因：多聚阴离子载体会吸引溶液中阳离子，包括H+，使 其附着于载体表面，结果使固定化酶扩散层H+浓度比周围 的外部溶液高，即偏酸，这样外部溶液中的pH值必须向碱 性偏移，才能抵消微环境作用，使其可表现酶的最大活力。 反之，使用带正电荷的载体其最适pH值向酸性偏移。
• 酶的固定化：采用各种方法，将酶与水不溶性的载 体结合，制备固定化酶的过程。
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一、固定化酶的制备原则
• 1、维持酶的催化活性及专一性
酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位，要尽量避 免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。固定化时 要采取尽量温和的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基 团。
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3、结合法
• 选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶
结合在一起的固定化方法。
（1）离子键结合法
• 酶通过离子键结合于水不溶性的 离子交换剂载体。
• 常用载体有多糖类离子交换剂和合成 高分子离子交换树脂。
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• 例：将处理成-OH型的DEAE-葡聚糖凝胶加至 含有氨基酰化酶的0.1M的pH7.0磷酸缓冲液中， 37 ℃条件下，搅拌5 h，氨基酰化酶就可与 DEAE-葡聚糖凝胶通过离子键结合，制成固定 化氨基酰化酶。
• 扩散阻力:
分为外扩散阻力与内扩散阻力。
• 外扩散阻力：是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递 过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前， 发生在固定化颗粒周围的液膜层。

酶、细胞、原生质体的固定化ppt课件

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己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯、异氰酸酯、
双重氮联苯胺等。
包埋法
包埋法是将酶包埋在多聚物内的一种方法。 分为：
凝胶包埋法：将酶包埋在高分子凝胶细微 网格中，常用的载体有明胶、琼脂、琼脂糖、 聚丙烯酰胺、光交联树脂、海藻酸钠等；
微胶囊法：将酶包埋在直径只需几微米至 几百微米的高分子半透膜中，方法有界面沉淀 法、界面聚合法、二级乳化法以及脂质体包埋 法。
加。 缘由： 酶蛋白分子的高级构造发生变化 载体的静电相互作用
固定化细胞的性质
与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。 〔1〕有活性升高的景象。 〔2〕稳定性的添加 。 〔3〕最适温度和最适pH常坚持不变。
固定化酶的评价目的
酶(细胞)的活力 固定化酶通常呈颗粒状，普通用于测定自然酶活
力的方法改良后才干用于测定固定化酶。 蛋白总量 1.双辛可宁酸法(BCA法) 2.考马斯亮蓝法 半衰期 在延续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为
酶、细胞、原生质体的固定化
徐彤砚 孟莉
主要内容
酶的固定化 细胞的固定化 原生质体的固定化 固定化酶与固定化细胞的性质与表征
酶的固定化
作为一种生物催化剂，酶具有专注 性强、催 化效率高、反响条件温暖等优点，在食品工业 中发扬着重要的作用。
然而，酶的稳定性差，在强酸、强碱、热及有 机溶剂等作用下容易变性，从而使酶活性降低， 甚至失活；
吸附-包埋
包埋法具有操作方便、条件温暖、根本不会改动酶的构造、酶不 易零落等优势、但也存在机械强度差、酶易走漏、传质阻力较大 等问题。利用耦合固定化技术可以很好地处理上述问题。
包埋法运用的一些凝胶分子的间隙较大，容易呵斥酶在其中的疏 漏，通常可以运用以下方法处理:①用交联或共价结合的方法处 置包埋酶颗粒；②将酶吸附在一些大分子颗粒上来增大酶分子的 体积。将葡萄糖淀粉酶吸附在凝胶化的玉米淀粉颗粒上，再利用 海藻糖包埋，处理了单一吸附呵斥的酶走漏问题，同时包埋-吸 附法改善了包埋法传质阻力大的缺陷，吸附剂的参与降低了固定 化细胞的疏漏，添加细胞在载体中的分散性 。研讨阐明将吸附 剂添加到卡拉胶包埋体系中，与单一的吸附相比固定化细胞转化 L-苯丙氨酸转化才干提高了52%，处理了转化才干差的问题

酶和细胞固定化优秀课件

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1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，取得进展。 固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有利于胞内物质的分 泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方向。
本章 目录
5.3 酶固定化技术
固定化酶操作的注意事项
活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团 固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严 密的条件下进行。
缺点： 固定化过程中往往会引起酶的失活 首次投入成本较高 大分子底物较困难
本章 目录
5.2 固定化酶的研究历史
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer和Schleith 采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核 酸酶等结合，制成固定化酶。
60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的千烟一郎首 次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基 酸，实现了酶应用史上的一大变革。
凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一 定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需 要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、 明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。
半透膜包埋法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成 固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等
酶和细胞固定化优秀课件
酶应用过程中的一些不足
酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如α-淀粉酶、Taq酶等；和 胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、 强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。
酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系 统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力， 也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高， 而且难于连续化生产。

酶与细胞的固定化PPT课件

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• 1.琼脂-多孔醋酸纤维素固定化法 • 用生理盐水配制3%～4%的琼脂，加热溶解灭菌后，至50℃左右，与等体
积的一定浓度的原生质体悬浮液混合将混合液用滴管滴到一定形状的多孔醋 酸纤维素上,置于冰箱或冰盒中冷却凝固，制成固定化原生质体。
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1.吸附法
吸附法分为物理吸附法和离于交换吸附法 （1）物理吸附法 通过氢键、疏水作用和π电子
亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上。 从而制成固定化酶。常用的载体有： （1）有机载体
纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等
（2）无机载体
氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。
体。
第27页/共40页
二、原生质体固定化
• 原生质体制备好后，把离心收集到的原 生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲 液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液。然 后采用包埋法制成固定化原生质体。
• 原生质体固定化一般采用凝胶包埋法。 常用的凝胶有:琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角 叉菜胶和光交联树脂等。现举例说明如下:
第20页/共40页
• 2．包埋法 包埋法是将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、明胶和角叉莱胶等多孔凝胶中。 BredeliUS等(1979）首次用海藻酸钙包埋制备了固定化长春花细胞。毛地黄细胞、海巴朝细胞。
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三、动物细胞固定化
• 动物细胞比菌体细胞、植物细胞更娇嫩，需要最温 和的固定化方法。因前，动物细胞固定的方法有吸 附法和包埋法两种，其中吸附法用的最多。
第16页/共40页
• 包埋法： • 1．聚丙烯酰胺凝胶包埋法 • 2．琼脂凝胶包埋法 • 3．海藻酸包埋 法 • 4．卡拉胶包埋法 • 5．明胶包埋法
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活性炭
多孔玻璃
氧化铝 碳酸钙凝胶
纤维素
α-淀粉酶、β-淀粉酶 蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶 核糖核酸酶、木瓜蛋白酶
脂肪酶、葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶
➢ 常用载体
a. 无机吸附剂： 硅藻土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微孔玻璃、羟 基磷灰石、活性炭等。无机吸附剂的吸附容量一般 很低，多在1mg蛋白/g吸附剂。
b. 有机吸附剂： 纤维素、胶原、火棉胶等。有机吸附剂的吸附容量 一般较高，如火棉胶膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸 酯酶等，吸附容量为70mg蛋白/cm2膜。
固定化技术——固定化酶（immobilized enzyme）
有效改善方法之一 思路：设计一种方法，将酶束缚于特殊的相中，
使它与整体分开但仍能进行底物和效应物的分 子交换。 效果：固定化的酶可像一般化学反应中的固体 催化剂一样，既有酶催化特性，又有一般化学 催化剂可回收、反复使用等优点，并可使生产 工艺连续化、自动化。
一、固定化酶的制备
早期： 水不溶酶（water insoluble enzyme） 固相酶（solid phase enzyme）
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶（固定化酶）
1. 固定化酶（Immobilized enzyme）定义
限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是 指借助物理或化学方法将酶固定于水不溶性载体， 使得酶与整个流体分隔开，但仍能发挥催化效能 的酶制剂形式。
第六章 酶、细胞、原生质体固定化
知识点回顾
1. 酶（Enzyme）
Organic chemical substance (a catalyst) formed in living cells, able to cause changes in other substance without being changed itself.
载体结合法
（1）物理吸附法
➢ 原理 ： 通过氢键、疏水作用和π-电子亲和力等物理作用， 将酶固定于水不溶性载体上。
➢ 制备方法: a. 静态法 (static procedure) b. 电沉积法 (electrodeposition procedure) c. 混和振摇装载法 (mixing or shaking bath loading process) d. 反应器装载法 (reactor loading process)
1969年，千佃一郎首次在工业规模上用固定化氨 基酰化酶从混合氨基酸中生产L-氨基酸。
1971年，第一届国际酶工程会议在美国召开，会 议的主题是固定化酶（immobilized enzyme） 。
我国：1970年（中科院微生物所、上海生化所）。
固定化酶发展历史
1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌 菌体中的天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸。
酶工程原理和基本过程
菌种→扩大培养→发酵→发酵酶液→酶的提取→ 酶成品
酶的固定化 原料→ 前处理→ 杀菌→ 酶反应器 ←
↓ 反应液→ 产品提取→ 产品
固定化酶发展历史
1916年，Nelson和Griffin发现酶的固定化现象 （蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性）。
20世纪50年代，Grubhofer和Schleith采用聚氨基 苯乙烯树脂为载体，分别制成固定化的胃蛋白酶、 淀粉酶等。
酶工程第五章酶细胞 原生质体固定化
强生稳豪倍易血糖仪
工作原理: 利用试纸上的固定化酶 (葡萄糖氧化酶, Glucose oxidase , GOD) 与血液中的葡萄糖反应产生 的电流来测血糖值。
葡萄糖氧化酶电极
半透膜 酶胶层
感应电极
酶电极示意图
ß-D-葡萄糖＋O2
D-葡萄糖酸-1, 5-内酯＋H2O2
制备固定化酶的过程叫做酶的固定化。
.
2 优点
固 定 化 酶 的 特
点 缺点
（1）提高酶稳定性 （2）可反复或连续使用；易于和反应产
物分开；酶的使用效率提高，成本降低 （3）酶反应过程可严格控制 （4）产物溶液无酶残留，简化提纯工艺；
增加产物收率，提高产物质量 （5）较游离酶更适合多酶反应
（1）固定化时酶活有损失 （2）增加了生产初始成本 （3）只能用于可溶底物且较小分子 （4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应
20世纪70年代后期：固定化细胞技术 1982年，日本首次用固定化原生质体生产谷氨酸 近年来，随着纳米材料和磁性材料等新材料的出
现，使固定化酶又成为研究热点，目前酶的固定 化方法已超过200种。
本章主要内容
第一节 酶固定化 第二节 细胞固定化 第三节 原生质体固定化
第一节 酶的固定化
活性中心外
专一性 催化性质
必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变， 则酶的活性丧失。
活性中心：酶分子中直接与底物结合，并和酶 催化作用直接相关的部位。
4. 酶的特性
优点：① 催化效率高 ② 专一性强 ③ 反应条件温和 ④ 催化活性受到调节和控制
缺点：① 溶液酶很不稳定 ② 增加分离的难度和费用 ③ 影响产品质量 ④ 回收困难，一次性使用
活细胞产生的，能在细胞内外起催化作用的生 理活性物质。
2. 酶的组成
单纯酶 酶பைடு நூலகம்
结合酶 （全酶）= 酶蛋白 + 辅因子
辅酶 辅基 酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分。 辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。
3. 酶的活性中心（active center）
必需基团
活性中心
结合基团 催化基团
➢ 优点 ① 活性中心不易被破坏，高级结构保持完整； ② 操作简单，固定化和纯化过程可能同时实现； ③ 酶失活后载体仍可再生。
➢ 缺点 ① 最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不 一定呈平行关系； ② 酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活 下降并污染产物。
物理吸附法固定化酶举例
载体
固定化酶
3. 固定化酶制备原则
（1）维持酶的催化活性及专一性 （2）应有最小的空间位阻 （3）酶与载体必须结合牢固，稳定性好 （4）载体不与底物、产物或反应液发生化学反应 （5）成本要低，有利于生产自动化、连续化
4. 酶的固定化方法
酶的固定化
载体结合法 交联法 热处理法 包埋法
凝胶型 微囊型 脂质体 物理吸附 离子结合 共价结合