实验二 网织红细胞计数

一、实训背景网织红细胞是红细胞前体，其计数对于评估骨髓造血功能和红细胞生成情况具有重要意义。

本实训旨在通过学习网织红细胞计数的操作方法，掌握其计数原理和注意事项，提高对血液学检验的认识和技能。

二、实训目的1. 了解网织红细胞计数的基本原理和操作方法。

2. 掌握显微镜下观察和计数网织红细胞的技术。

3. 学会分析网织红细胞计数结果，并应用于临床实践。

三、实训内容1. 网织红细胞计数原理网织红细胞计数是通过染色技术将网织红细胞与成熟红细胞区分开来，然后进行计数。

常用的染色剂有煌焦油蓝、新亚甲蓝等。

染色后，网织红细胞呈现蓝绿色网状或点粒状物质，而成熟红细胞则呈红色。

2. 网织红细胞计数操作方法（1）制备血涂片：取新鲜血液2滴，加入10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液2滴，立即混匀，置37℃下15～20分钟。

（2）制片：取1小滴制成薄血涂片，自然干燥。

（3）染色：将染好的血涂片放入染色缸中，用染液染色5～10分钟。

（4）观察：在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。

（5）计数：在油镜下计数至少1000个红细胞中的网织红细胞数。

（6）计算：网织红细胞分数 = 计数的网织红细胞数 / 1000网织红细胞绝对值 = 红细胞数× 10^12 / L × 网织红细胞分数3. 注意事项（1）染色时间要适中，过长或过短都会影响计数结果。

（2）观察时要选择红细胞分布均匀的部位，避免计数误差。

（3）计数时要仔细区分网织红细胞与HbH包涵体。

（4）计算时要确保数值准确。

四、实训结果与分析本次实训，我们按照操作步骤进行了网织红细胞计数，并计算出网织红细胞分数和绝对值。

通过对计数结果的分析，我们了解到患者的骨髓造血功能和红细胞生成情况。

五、实训总结通过本次实训，我们掌握了网织红细胞计数的操作方法，了解了其计数原理和注意事项。

同时，我们也认识到，在实际操作中，要严格按照操作步骤进行，确保计数结果的准确性。

此外，我们还学习了如何分析计数结果，并将其应用于临床实践。

网织红细胞计数操作规程目的：本实验旨在规范网织红细胞计数的标准操作，以确保实验数据的准确性。

原理：网织红细胞是未完全成熟的红细胞，其包体较一般红细胞稍大，胞浆中尚有嗜碱性残留物质，可被煌焦油蓝等染成蓝色颗粒状、线状及网状结构物。

网织红细胞的数量可用百分率或每立方毫米血液中的绝对值数来表示。

材料：煌焦油蓝（灿烂甲酚蓝）、枸橼酸钠、生理盐水、香柏油、载物片（玻璃片）、推片（磨去边的玻璃片）、试管（2ml）、毛细吸管或枪头（200微升）、光学显微镜。

操作规程：染色液配制：将煌焦油蓝0.4g和3.5%枸橼酸钠20ml研磨溶解后加入生理盐水至100ml，过滤备用。

室温下可保存6个月。

血膜片制备：1.染色：取试管一支，用毛细管或枪头于其中加入染液2～5滴，然后再加入新鲜血液1滴轻摇混合，染色10～15min。

2.制片：取载物片一片，用毛细管或枪头吸取血液染色液1小滴于载物片上，并用推片约45度角推制成舌型血膜片，自然干燥备用。

3.观察：用显微镜观察，取血膜片滴入香柏油1滴，将血膜片置于显微镜载物台，用油镜观察网织红细胞。

4.计数：取计数器在油镜下检查计数红细胞，即计数红细胞中网织红细胞的数量，检查计数1000个红细胞中网织红细胞的数量，并得出千分率再除以10即为百分率。

计算公式：百分率=1000个红细胞中网织红细胞的数量/1000注意事项：1.载物片使用前必须经过酸或碱液浸泡脱脂处理后方可使用。

2.血膜片制备需要反复练推片，熟练推制血膜片的技巧。

3.血膜片的厚薄要适中，过厚或过薄均无法进行观察。

4.室温过低时，血液染色时间要适当延长，以确保细胞着色更充分。

5.血膜片需在3天内检查计数，否则其网状结构会褪色，不易观察清晰。

1．项目名称网织红细胞计数2．检验目的2．1观察贫血疗效2．2骨髓移植后监测骨髓造血恢复2．3其他疾病协诊等临床实验室3．检验原理：网织红细胞是尚未完全成熟的红细胞，其胞浆内尚存在有嗜碱性的RNA物质，甲蓝活体染色后，其胞浆内尚存在有嗜碱性的RNA物质，经煌焦油蓝或新亚呈浅蓝或深蓝色的网状结构。

4．性能参数4．1重复性4．2分析和计算参数：百分比（%）4．3样本量：染液量=1：14．4精密度5．原始样品系统：全血6．容器和添加剂类型容器采用真空负压专用抗凝管，添加剂类型为0.109M乙二胺四乙酸钾7．试剂显微镜7．1 10G/L新亚甲蓝（或煌焦油蓝）生理盐水溶液：新亚甲蓝 1.0G枸橼酸钠0.4G氯化钠0.85G溶于双蒸馏水100ML中，混匀，过滤后备用。

7．2 显微镜7．2．1 商标8．校准程序:显微镜的验证，光路系统校正灯泡大约半年更换一次9．程序步骤：9．1标本采集与要求9．1．1标本采集：抽取静脉血1.8ml，加入到含有乙二胺四乙酸钾溶液的抗凝真空试管中，并轻轻颠倒10次使之充分混匀，不得有凝块、不得形成泡沫，总量不得超过2.0±0.2ml，并在试管上做好标识。

采血应避免溶血，采血后2小时内送到检验科，需要运输时应在低温条件下运输。

采集标本时宜“一针见血”,以防止组织损伤。

9．1．2不合格标本的处理对凝固、有凝块、采血量不符合要求、无条码或无标识等不合格的标本,距采集时间超过2小时并且没有按要求储存的标本,按程序文件《样品核收、登记和保存程序》处理9．1．3标本保存检测应在标本采集后2小时内完成,2～8℃保存不超过4小时,分析后的标本保存三天。

9．2检验前准备9．2．1把接收到的标本按顺序编写序号。

9．2．2准备清洁、干燥、无尘、无油脂的载玻片、盖玻片、毛细管，玻璃笔。

9．3病人标本的检验9．3．1取小试管1支加10G/L新亚甲蓝盐水溶液2滴。

9．3．2加入末梢血（或EDTA钾抗凝静脉血）2滴于上述试管中，混匀。

网织红细胞计数检测标准操作规程1.【目的】为了规范化操作，保证检测结果准确可靠。

2.【职责】2.1实验室工作人员均应熟知并严格遵守本SOP，室负责人监督落实。

2.2本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：室负责人、科主任。

3.【样本类型及实验前准备】3.1样本类型：静脉血2ml（标本应新鲜，注意避免污染，避免溶血，注意有无血凝块）。

3.2患者准备：要求患者处于安静状态精神、体力、情绪等因素的影响较小。

3.3容器添加剂类型：EDTA-2K3.4实验试剂：煌焦油蓝或新亚甲蓝染液4.【测定原理】网织红细胞是晚幼红细胞到完全成熟红细胞之间的过渡型细胞，由于其细胞浆中尚存在嗜碱性的RNA物质，用煌焦油蓝或新亚甲蓝进行活体染色后，RNA中的负电荷基团与带正电荷的有色基团结合，胞浆中镜检可见有浅蓝色或深蓝色的点状.丝状或网状结构。

5.【操作步骤】5.1样本要求新鲜全血或EDTA抗凝全血。

5.2将网织红细胞染色液与病人全血1：1比例混匀，静置室温20分钟或更久。

制成血涂片，于显微镜下观察，判读。

5.3先在低倍镜下浏览，了解染色好坏和细胞分布情况。

选择涂片体尾交界处染色良好的区域，在油镜下观察1000个红细胞，算出网织红细胞的百分率。

6.【生物参考区间】儿童成人：0.05—0.15%新生儿：0.3—0.6%7.【临床意义】网织红细胞增加见于各种增生性贫血，溶贫尤为显著，巨幼贫和缺铁贫在治疗后显著曾生，表示有治疗效果;减少常见于再生障碍性贫血。

7.1增高提示骨髓造血功能旺盛，见于各种增生性贫血（溶血性、缺铁性、巨幼细胞性、急性失血性贫血）及经相应药物治疗有效时；急性溶血时可高达0.6～0.8；急性失血后5～10d网织红细胞达高峰，2周后恢复正常；恶性贫血或缺铁性贫血使用维生素B12或供铁质后显著增多，表示有疗效。

7.2减低提示骨髓造血功能低下，见于再生障碍性贫血、溶血性贫血再生危象时。

网织红细胞计数一、检验目的：了解骨髓红细胞增殖增加或减低等情况二、原理网织红细胞是尚未完全成熟的红细胞，其胞浆内尚存在有嗜碱性的RNA物质，经煌焦油蓝或亚甲蓝活体染色后呈浅蓝色或深蓝色的网状结构一、标本要求取末梢外周血或抗凝静脉血二、试剂10g/L新亚甲蓝（或煌焦油蓝）生理盐水溶液：新亚甲蓝1g枸橼酸钠0.4g氯化钠0.85g溶于双蒸馏水100ml中，混匀，过滤后备用。

三、仪器设备普通光学显微镜和Miller窥盘四、操作步骤1.于小试管中滴加2滴网织红细胞染液。

2.加入末梢血2滴于上述试管中，混匀。

3.静置15--20分钟后，取用1滴制成薄片。

4.油镜下检查1000个红细胞中网织红细胞数，以百分率或绝对值报告。

七、质量控制：1、95%的可信限法：（1）Sp=√R（1—R）/NSp为标准差，R为网织红细胞百分数，N为所数红细胞数。

网织红细胞计数95%可信限范围为0.028—0.0522、两差比值法：r=IR1-R2I/√R1（1--R1）+R2（1—R2）/N。

R1、R2分别为两次计数结果N为所数红细胞数，r＜2时结果可靠。

八、计算方法：九、生物参考区间0.5%~1.5%十、操作性能十一、超出可报告范围的处理：十二、危急值：十三、干扰因素：1、工作人员的责任心。

2、推血片的质量。

3、染色时间。

十四、临床意义：1、网织红细胞增多：表示骨髓红细胞系统的增生旺盛。

多见于各种增生性贫血，如溶血性贫血，特别是急性溶血性贫血，急性大出血引起的失血性贫血。

当缺铁性贫血和巨幼细胞性贫血治疗有效时，可出现短时间的网织红细胞大量增加，以后即降至正常或稍高于正常。

2、网织红细胞减少：多见于骨髓增生低下，如再生障碍性贫血和某些溶血性贫血有再障危象时。

阵发性睡眠性血红蛋白尿症网织红细胞有所减少，但有些慢性再生障碍性贫血患者的网织红细胞并不明显减低。

3、可以作为贫血治疗疗效的判断监察指标，用于观察治疗效果和判断病情变化。

十五|参考文献：1、《全国临床检验操作规程》2、罗春丽主编《临床检验基础》3、刘成玉主编《临床检验基础实验指导》。

网织红细胞计数及临床意义一、概述1、网织红细胞（reticulocyte，Ret，RET）是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间的过渡细胞略大于成熟红细胞(直径8.0～9.5μm)，其胞质中残存的嗜碱性物质RNA经碱性染料（如煌焦油蓝、新亚甲蓝等）活体染色后，形成蓝色或紫色的点粒状或丝网状沉淀物。

2、网织红细胞自骨髓释放到外周血液后仍具有合成血红蛋白的能力，约1～2天后，过渡为成熟红细胞ICSH将网织红细胞分为4型（网织红细胞分型及特征）。

二、检测方法与原理1、普通显微镜法：网织红细胞是尚未完全成熟的红细胞，其胞质内尚有嗜碱性的RNA物质，经新亚甲蓝或煌焦油蓝活体染色后呈浅蓝或深蓝色网状结构。

2、血液分析仪法：特殊染料与网织红细胞中RNA结合后进行RNA定量，可精确计数网织红细胞占红细胞的百分数(Ret%)，并可根据RNA含量将网织红细胞分类及计算网织红细胞其他参数。

（一）普通显微镜法1、染色液①新亚甲蓝枸橼酸氯化钠染色液：新亚甲蓝0.1g溶于100ml枸橼酸氯化钠溶液内(1体积30g/L枸橼酸钠溶液与4 体积9.0g/L氯化钠溶液混合)，充分混匀，待染料溶解后过滤。

②煌焦油蓝生理盐水染色液：煌焦油蓝1.0g、枸橼酸钠0.4g、氯化钠0.85g，溶于双蒸馏水100ml中，过滤后备用。

2、操作①在小试管中加入染色液2滴；再加人静脉血（或末梢血)2滴，混后放置37℃恒温水箱中。

②10分钟后取1滴混悬液制成涂片③在油镜下直接观察1000个红细胞中Ret数。

或以Miller 窥盘计数法计数：Miler窥盘为一个厚为1mm、直径为19mm 的圆形玻片，玻片上用微细刻线画出两个正方形格子，大方格B面积为小方格A的9倍。

置于目镜内，计数小方格内红细胞数(将小方格内数得红细胞数乘以9，折算成一个大方格内的红细胞数)和大方格内的Ret数。

（窥盘结构）3、结果计算①直接观察法：网织红细胞比例=计数1000个红细胞中的网织红细胞数/1000②窥盘计数法：网织红细胞比例=大方格内网织红细胞数/（小方格内红细胞数×9）③网织红细胞绝对数(个/L)=网织红细胞百分数x红细胞数/L④网织红细胞生成指数(RPI)：RPI=（网织红细胞百分数/2）×(患者血细胞比容/0.45)三、参考区间1、网织红细胞比例：成年人：0.005～0.015新生儿：0.03～0.06；儿童：0.005～0.0152、网织红细胞绝对数成年人：（24～84）×10%/L四、注意事项1、标本应在4小时内进行处理。

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在进行网织红细胞计数之前，需要做好充分的准备工作。