重组人白细胞介素8在大肠杆菌的表达、鉴定资料
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重组人白细胞介素8在大肠杆菌的表达、鉴定【摘要】目的：利用PCR技术[1]扩增hIL-8 cDNA，将其与酶切后的原核表达载体pKpL3a（含PL启动子）质粒连接，并在大肠杆菌中进行表达、鉴定。
方法：PCR技术扩增hIL-8 cDNA获取目的基因，大肠杆菌质粒提取，将目的基因连接到大肠杆菌表达载体pKpL3a质粒中，重组DNA分子转化到Pop2136大肠杆菌中，利用其所产生的温度敏感性λ阻遏蛋白来调控外源基因表达，经ELISA反应检测其表达水平。
结果：带hIL-8基因的重组pKpL3a质粒成功转化到Pop2136大肠杆菌中，经诱导，表达了IL-8并经ELISA反应检测了其表达水平。
结论：hIL-8成功在大肠杆菌中表达。
【关键词】hIL-8， PCR ，重组DNA【Summary】Purpose：Connecting the hIL-8 cDNA which is amplificated using PCR technology with the plasmid of prokaryotic expression vector digested pKpL3a (including PL promoter),and detecting the expression and identification of recombinant hIL-8 in E.coli。
Method：Get target gene by amplificating hIL-8 cDNA using PCR technology. Extract the E.coli plasmid. Connect the target gene with E.coli plasmid pKpL3a expression vector. Transform recombination DNA into E.coli Pop2136, and regulate gene expression of exogenous using the temperature-sensitive λ repressor protein, then detect the expression levels by ELISA reaction。
Result：Recombinant plasmid PKpL3a with hIL-8 gene is successfully transformed into E.coli Pop2136 and expresses IL-8.The expression level of the IL-8 is detected by ELISA reaction.Conclusion：hIL-8 is successfully expressed in E. coli.【Keywords】hIL-8， PCR ，Recombination DNA白细胞介素8（Interleukin-8）是一种具有趋化作用的细胞因子，对中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞具有区划作用，并可促进中性粒细胞的活化，在炎症反应中是一种重要的炎症因子。
另外，IL-8还具有促进造血细胞增殖及新生血管生成作用，在伤口愈合和肿瘤生长及转移的过程中发挥重要作用。
天然来源的IL-8含量极低，难以大批量制备，因而只能利用基因工程技术进行表达和生产[2]。
本实验通过PCR获得IL-8的c-DNA，将其连接于原核表达载体pKpL3a（含PL启动子）中，用温度诱导表达技术使外源基因得以表达。
1 材料与方法1.1 材料试剂⑴模板（cDNA文库，CLONTECH公司）；大肠杆菌（含pKpL-3a质粒）；⑵上游hIL-8 5ˊ引物（agt gct aaa gaa ctt aga tgt T m=56℃，由Takara公司合成）；下游hIL-8 3ˊ引物（ccg tct aga tta tga att ata agc cct ct T m=56℃，由Takara公司合成）；⑶酚-氯仿-异戊醇；NaAc；70％乙醇，无水乙醇；⑷缓冲液A（50mM葡萄糖，10mM EDTA，25 mM Tris-HCl，pH8.0）；碱溶液；乙酸缓冲液；TE缓冲液；RNA酶A溶液；⑸ TAE电泳缓冲液；GEBS样本液；溴化乙锭；⑹ LA培养基；LA培养皿；100mM CaCl2；⑺包被抗体（抗IL-8单克隆抗体）；酶标抗体（酶标记IL-8单克隆抗体）；标准品（rHuIL-8，200ng/ml）；包被缓冲液（Ph9.6 0.05M CBS）；抗体稀释液（pH7.2 0.01M PBS）；洗涤液（pH7.2 0.15M PBS）；稀释液（pH7.2 0.15M PBS）；封闭液（牛血清白蛋白）；底物液（A液：TBM，B液：3％H2O2）；终止液（2mol/L H2SO4）⑻工具酶TaqDNA聚合酶及其buffer：北联生物医学工程公司；dNTPmix：Takara公司；Klenow酶：北联生物医学工程公司，1U/μl；内切酶StyⅠ、XbaⅠ：Takara公司，﹣20℃保存；T4 DNA连接酶及其buffer：Takara公司1.2 仪器PCR仪，微量加样器（20μl、200μl、1000μl），台式高速离心机，DYY-10型电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统，37℃孵箱，酶标仪，一次性酶标板1.3 实验方法⑴ PCR技术扩增[3]hIL-8cDNA①在0.2ml反应管中加入下列成份：ddH2O 4μl、10×buffer 5μl、dNTP mix 5μl、模板2μl、5ˊ引物2μl、3ˊ引物2μl、Taq酶10μl，构建总量为20μl的反应体系。
②在设定好的PCR仪上进行反应（95℃，3分钟；95℃，30秒；52℃，30秒；72摄氏度，30秒），反应35轮，72℃，6分钟。
③反应结束后取出8μl进行琼脂糖凝胶电泳，向管中余下的12μl反应体系中加入Klenow酶1μl，室温30分钟，以修平扩增片段的3ˊ末端。
④转至1.5ml离心管中，加入50μl酚-氯仿-异戊醇，混匀，离心10000rpm，30秒。
⑤吸取上层清液，转至另一已加入5μl 3M NaAc的1.5ml离心管中，加入150μl无水乙醇，-20℃放置30min。
⑥离心10000rpm，5分钟，弃上清，加入0.5ml 70%乙醇，10000rpm离心，5分钟，弃上清，空气中干燥，溶于20μl TE。
⑵质粒提取①从转化平皿上接种一单菌落到LA培液体养基中，37℃震荡培养，待细菌浓度增至OD600=1.5时，收获细菌。
取菌液1ml转至Eppendorf管中，离心8000rpm，2分钟，弃上清。
②加入200μl缓冲液A，充分混悬细菌。
③加200μl碱溶液，裂解细菌，反复倒转管5次至溶液清亮，开盖后能拉出丝状粘稠液体。
④加200μl乙酸缓冲液，反复倒转管5次，混匀，冰浴10分钟。
⑤离心10000rpm，2分钟，上清转至另一Eppendorf管中。
⑥加2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置1小时。
⑦离心10000rpm， 5分钟，弃上清，加入70%乙醇0.5ml。
勿混匀，离心10000rpm， 5分钟，弃上清，干燥。
⑧加入50μl TE，使质粒溶解，酶切备用。
⑶限制性内切酶消化①取两个Eppendorf管分别标记A、B后加入以下试剂，A管：ddH2O 14μl、10×M buffer 2μl、0.1%BSA 2μl、PCR产物1μl、XbaⅠ1μl；B管：ddH2O 16μl、10×H buffer 2μl、质粒DNA 1μl、StyⅠ1μl。
②37℃水浴45分钟。
③A管中加50μl酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm离心2分钟，取上层液，转至另一Eppendorf管中，加2.5倍体积无水乙醇，1/10体积的乙酸钠，混匀，-20℃沉底30min，10000rpm 离心5分钟，弃上清，500μl 70%乙醇洗一次，10000rpm 离心2分钟，弃上清，干燥，加20μl TE进一步用于连接反应。
④B管中加入1μl Klenow酶、2μl dNTPmix，室温放置30分钟。
加50μl酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm 离心 5分钟，取上层液，转至另一Eppendorf管中，加2.5倍体积无水乙醇，1/10体积的乙酸钠，混匀，-20℃沉底1小时，10000rpm 离心5分钟，弃上清，500μl 70%乙醇洗涤一次，干燥。
将沉淀溶于15μl水中，加入2μl 10×M buffer、2μl 0.1%BSA、1μl XbaⅠ，37℃水浴30分钟。
⑤B管加50μl酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm 离心5min，取上层液，转至另一Eppendorf管中，加2.5倍体积的无水乙醇，1/10体积的乙酸钠，混匀，-20℃沉底30min，10000rpm 离心5min，弃上清，500μl 70%乙醇洗涤一次，干燥，加20μl TE，进一步用于连接反应。
⑷ DNA琼脂糖凝胶电泳①0.8%琼脂糖凝胶板的：取0.6g琼脂糖加80mlTAE（1×），20ml水，微波炉加热融化3min，将其冷却至55℃-65℃，倒入制胶槽中。
②充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入TAE（1×），使其液面略高于琼脂糖板，拔出样品梳。
③DNA样品10μl加5μlGEBS 样本液，在蜡面纸上混匀，全部加样于琼脂糖的样品孔中。
④稳压电泳80v约2小时，使溴酚蓝指示剂泳动到适当位置，1-5V/cm。
⑤取出凝胶板置溴化乙锭溶液中染色20分钟。
⑥在凝胶成像仪观察结果。
⑸ DNA连接[4]①在Eppendorf管中加入下列物质进行连接反应：H2O 9.5μl、10×T4 DNA连接酶buffer 2.5μl、pKpL3αDNA7μl、IL-8 PCR产物5μl、T4 DNA连接酶1μl。
②置16℃水浴反应过夜。
③65℃水浴15分钟，灭活T4 DNA连接酶，用于转化。
⑹转化①将无质粒大肠杆菌pop2136接种于1ml LB培养基，37℃培养3-5小时。
②待OD600=0.4时，转移至Eppendorf管中，离心8000rpm ，2min，弃上清。
③加200μl 100mM Cacl2，混匀，置冰浴30分钟。
④加10μl连接好的质粒DNA，混匀，置冰浴30分钟。
⑸37℃水浴2分钟，冰浴2分钟。
⑥加入1ml LB培养基，37℃培养20min。
⑦取出100μl涂于LA培养皿上，37℃倒置培养过夜。
⑧检查转化菌是否生成(只有转化的细菌才能在平皿上生长)。
⑺细胞因子的测定—ELISA双抗体夹心法①包被：将稀释好的包被抗体加入ELISA板，100μl/孔，放置湿盒中，4℃，过夜。
