实验四细菌的生理生化及肠杆菌科的鉴别教学教材

1 目的1.1 了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理1.2 掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法2 原理各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。

由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种差异就表现的更加明显。

不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。

即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。

3 材料3.1 菌种大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种3.2 培养基葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）3.3 试剂40％NaOH溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。

3.4 器具超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。

4 流程糖发酵试验→V-P试验→甲基红试验→吲哚试验5 步骤(一) 糖类发酵试验1 目的了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法．2 原理可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。

是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。

是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。

3 材料3.2菌种大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）的斜面菌种3.３培养基葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管４流程发酵液试管→标记→接种→培养→观察→记录5 步骤5.1 试管标记图9-1 糖发酵产气取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管各Ａ不产气；Ｂ产气4支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。

一、实验目的1. 掌握肠道杆菌的生理生化特性。

2. 熟悉并掌握肠杆菌科细菌的鉴定方法，如IMViC试验等。

3. 通过实验，提高对微生物学实验技能的运用和操作能力。

二、实验原理肠杆菌科细菌是一类革兰氏阴性、无芽孢、无荚膜的杆菌，广泛分布于自然界、人和动物的肠道中。

本实验通过对肠杆菌进行一系列生理生化试验，包括吲哚试验（I）、甲基红试验（M）、V.P试验（V）、柠檬酸盐利用试验（C）等，以鉴定和区分不同肠杆菌科细菌。

三、实验材料1. 菌株：大肠杆菌、产气肠杆菌、变形杆菌等。

2. 培养基：蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨培养基、柠檬酸盐培养基、双糖铁培养基等。

3. 试剂：吲哚试剂、甲基红试剂、V.P试剂、40%KOH、-茶酚、溴麝香草酚蓝、苯酚红等。

4. 仪器：酒精灯、试管、试管架、烧杯、量筒、接种环、接种针、无菌玻片、显微镜等。

四、实验方法1. 吲哚试验（I）（1）将试验菌接种于蛋白胨水培养基，37℃培养24小时。

（2）取1 mL培养液，加入1 mL乙醚，充分振荡，使乙醚层浮于培养液表面。

（3）沿管壁加入吲哚试剂10滴，静置片刻。

（4）观察培养液颜色变化，呈玫瑰红色为阳性，不变色为阴性。

2. 甲基红试验（M）（1）将试验菌接种于葡萄糖蛋白胨培养基，37℃培养24小时。

（2）沿管壁加入甲基红试剂3-4滴。

（3）观察培养液颜色变化，呈红色为阳性，黄色为阴性。

3. V.P试验（V）（1）将试验菌接种于葡萄糖蛋白胨培养基，37℃培养24小时。

（2）加入40%KOH 10-20滴，再加入等量-茶酚，用力振荡。

（3）37℃培养4小时后观察，仍无色产生为阴性。

4. 柠檬酸盐利用试验（C）（1）将试验菌接种于柠檬酸盐培养基斜面上，37℃培养24-28小时。

（2）观察培养基颜色变化，若含有溴麝香草酚蓝的斜面呈现蓝色为阳性，呈绿色为阴性；含苯酚红的斜面呈现红色为阳性，呈黄色为阴性。

五、实验结果1. 吲哚试验：大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。

方法2.3。

5 细菌的生理生化鉴定１、形态学观察采用插片法、埋片法, 对该拮抗细菌的菌落形态特征作镜检观察。

用革兰氏染色进行油镜观察。

① 革兰氏染色溶液和试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式碘液，95％乙醇，番红复染液等.试验步骤：（1) 涂片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不易过厚）、干燥和固定。

(2) 初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位1～２min，用水冲洗至流出水无色。

（3）媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖１min，倾去碘液，水洗至流出水无色。

(4）脱色：在上述涂片上流加95％乙醇溶液（一般20~30s）,当脱色至流出液无色时立即用水洗去乙醇。

（5）复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min,水洗,用吸水纸吸去残水晾干。

(6）镜检：用油镜观察。

②芽孢染色（1）制片:按常规方法涂片、干燥及固定。

（2）加热染色：向载玻片滴加数滴5％孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持５min,加热时应注意补充染液，切勿让涂片干涸.脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色.(3）复染：用0.5％番红水溶液复染2min。

(4) 水洗:用缓流自来水冲洗至无色。

(5) 镜检：晾干载玻片后油镜镜检。

③鞭毛染色(硝酸银染色法）(1) 载玻片准备:将载玻片置于含洗衣粉或洗涤剂的水中煮沸 20min，然后用清水充分洗净,再置于 95%乙醇中浸泡，使用时取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。

(2) 菌液制备：用接种环挑取菌落边缘菌体，悬浮于1～2mL无菌水中制成菌悬液，不能剧烈震荡。

（3) 制片:取一滴菌悬液滴到载玻片一侧，倾斜玻片,使菌悬液流向另一边,用吸水纸吸取多余的菌悬液,自然干燥。

（4）染色：滴加硝酸银染色A液覆盖3～5min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1 min，期间可用微火加热，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。

1、氧化酶巴氏杆菌1、原理：氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。

2、试剂盐酸二甲基对苯撑二胺(或四甲基对苯撑二胺)1%水溶液于茶色瓶中在冰箱中贮存。

3、方法在干净培养皿里放一张滤纸，滴上二甲基对苯撑二胺的1%水溶液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿，用金丝接种环(不可用镍铬丝)取18~24 h的菌苔，涂沫在湿润的滤纸上，在10 s内涂抹的菌苔现红色者为阳性，（四甲基对苯撑二胺为蓝色）10~60 s现红色者为延迟反应，60 s以上现红色者不计，按阴性处理。

4、注意事项：a.盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化，溶液应装在棕色瓶中，并在冰箱内保存，如溶液变为红褐色，即不宜使用。

b.铁、镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反应，若用它来挑取菌苔，会出现假阳性，故必须用白金丝或玻璃棒（或牙签）来挑取菌苔。

c.在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸为宜，如滤纸过湿，会防碍空气与菌苔接触，从而延长了反应时间，造成假阴性。

2、苯丙氨酸脱氨酶变形杆菌1、原理：某些细菌（如变形杆菌）具有苯丙氨酸脱氨酶，能将苯丙氨酸氧化脱氨，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸遇到三氯化铁呈蓝绿色。

本试验用于肠肝菌科和某些芽孢杆菌属的鉴定。

2、培养基酵母膏3gNaCl 5gNa2HPO4 1gDL-苯丙氨酸2g(或L-苯丙氨酸) 1g蒸馏水1000 mlpH为7.0，分装试管，121℃蒸气灭菌10min,摆成长斜面。

3、试剂10%(W/V)的FeCl3溶液4、方法适当浓度接种，37℃培养4h或8~24h测定。

将试剂4~5滴滴到生长菌的斜面上，当斜面上和冷凝水中产生绿色时为阳性反应，即表明己形成了苯丙酮酸，不变则为阴性。

3、H2S(TSI) 变形杆菌鸡白痢沙门氏1、原理：有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。

方法2.3.5 细菌的生理生化鉴定１、形态学观察采用插片法、埋片法, 对该拮抗细菌的菌落形态特征作镜检观察。

用革兰氏染色进行油镜观察。

①革兰氏染色溶液和试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式碘液，95%乙醇，番红复染液等。

试验步骤：(1) 涂片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不易过厚）、干燥和固定。

(2) 初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位1～２min，用水冲洗至流出水无色。

(3) 媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖１min，倾去碘液，水洗至流出水无色。

(4) 脱色：在上述涂片上流加95%乙醇溶液（一般20～30s），当脱色至流出液无色时立即用水洗去乙醇。

(5) 复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，用吸水纸吸去残水晾干。

(6) 镜检：用油镜观察。

②芽孢染色(1) 制片：按常规方法涂片、干燥及固定。

(2) 加热染色：向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持５min，加热时应注意补充染液，切勿让涂片干涸。

脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色。

(3) 复染：用0.5%番红水溶液复染2min。

(4) 水洗：用缓流自来水冲洗至无色。

(5) 镜检：晾干载玻片后油镜镜检。

③鞭毛染色（硝酸银染色法）(1) 载玻片准备：将载玻片置于含洗衣粉或洗涤剂的水中煮沸20min，然后用清水充分洗净，再置于95%乙醇中浸泡，使用时取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。

(2) 菌液制备：用接种环挑取菌落边缘菌体，悬浮于1～2mL无菌水中制成菌悬液，不能剧烈震荡。

(3) 制片：取一滴菌悬液滴到载玻片一侧，倾斜玻片，使菌悬液流向另一边，用吸水纸吸取多余的菌悬液，自然干燥。

(4) 染色：滴加硝酸银染色A液覆盖3～5min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1 min，期间可用微火加热，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。

实验四大肠菌群的生理生化特性试验一、实验目的和要求学习测定大肠杆菌培养基的制备，掌握大肠杆菌生理生化特性的测定方法，掌握大肠杆菌计数的方法。

实验学时4小时。

二、实验设备与仪器水样瓶、吸管、试管、锥形瓶、稀释瓶、培养皿(平皿)、发酵管和发酵瓶。

发酵管有大小之别，小发酵管可用15mm×150mm的试管，大发酵管须有200mL以上的容量、显微镜、电冰箱、普通放大镜，pH，接种环、高压蒸汽灭菌器、恒温箱(培养箱)、电冰箱、镜油(香柏油)、二甲苯、擦镜纸等。

乳糖蛋白胨培养基、浓乳糖蛋白胨培养基、品红亚硫酸纳培养基（甲）、伊红美蓝培养基、革兰氏染色剂、待测水样。

上述各种培养基及染色剂的成分与配制方法如下：(一)乳糖蛋白胨培养基1．成分蛋白胨10 g牛肉膏 3 g乳糖 5 g氯化钠 5 g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1 mL蒸馏水1000 mL2．制法将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1000 mL蒸馏水中，调整pH为7.2~7.4。

加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1 mL，充分混匀，分装于小发酵管（内有倒管）中，每管装10mL。

(3)置高压蒸汽灭菌115℃（0.7 kg/cm2）灭菌20 min。

(4)贮存于冷暗处备用。

(二) 浓乳糖蛋白胨培养基按上述“乳糖蛋白胨培养基”浓缩3倍配制。

分装于发酵瓶或发酵管（内有倒管）中，每个发酵瓶或大发酵管装50mL，每个小发酵管装5mL。

(三) 品红亚硫酸钠培养基(甲)1．成分蛋白胨10 g乳糖10 g磷酸氢二钾 3.5 g琼脂20-30 g蒸馏水1000 mL无水亚硫酸钠 5 g左右5%碱性品红乙醇溶液20 mL2．储备培养基的制备(1)先将琼脂加至900 mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使溶解，再以蒸馏水补足至1000 mL，调整pH为7.2~7.4。

(2)趁热用脱脂棉或纱布过滤(最好用保温漏斗)，再加入乳糖，混匀后定量分装于锥形瓶内，置高压蒸汽灭菌器中以115℃（0.7 kg/cm2）灭菌20 min，贮存于冷暗处备用。