质粒提取方法
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质粒提取
质粒提取
挑单克隆摇菌过夜，菌液1ml 10000转x 1min 离心2次得沉淀，去尽上清。
1：加solutionⅠ100μl充分混匀。
同时加RNAase
2：加solutionⅡ200μl混匀，静置2—5分钟，至溶液透明
3：加solutionⅢ150μl混匀，出现白色絮状物
4：离心10000转x 10min
5：取上清+0.7倍体积的异丙醇混匀，常温静置15min
6：离心10000转x 10min，弃上清
7：75%乙醇洗沉淀2次，每次10000转x 5min，风干15min
8：加30μl TE/H2O。
粗提质粒可用酶切鉴定，不适于回收片断作克隆
大提质粒菌液体积增加，solutionⅠ、solutionⅡ、solutionⅢ体积也相应成比例增加，小提一般不需要酚抽提，大提质粒一般需要RNase消化和纯化，纯化即酚抽提，具体步骤如下：1：等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提2次
2：添加1/10体积的3M NaOAc
3: 添加2.5倍体积冷乙醇，在-20°C保冷30-60min
4：离心分离回收沉淀，用4倍量70%冷乙醇洗，干燥吹干
5：用适量（1/100—1/30体积）的TE/H2O溶解沉淀。
质粒提取操作步骤
操作步骤：本实验方法适用于从1-10ml过夜培养的大肠杆菌菌液中提取质粒。
提取量受菌株、质粒拷贝数、菌液体积和培养时间、培养基类型等因素的综合影响。
1.收菌：将过夜培养（37℃，12-16小时）的菌液于室温≧10,000g离心1-2分钟，彻底弃除上清。
注意：高拷贝质粒建议使用≦5ml菌液；菌液用量过大不仅不能增加质粒产量，反而会因裂解不完全或杂质封闭硅胶膜而降低产量；培养时间不宜过长，否则会增加开环结构质粒的比例。
2.重悬：加入250µl含RNase A的细胞悬浮液（S1），充分混悬震荡或用枪头反复抽打使细菌彻底分散悬浮。
3.裂解：加入250µl细胞裂解液（S2），轻轻上下颠倒混合5次，室温静置1-5分钟，待细菌充分裂解，溶液变半透明。
注意：避免剧烈震荡导致基因组DNA裂解，裂解时间不能超过5分钟。
4.中和：加入350µl中和缓冲液（S3），轻轻上下颠倒混合5次，充分混匀，避免剧烈震荡。
室温下≧12,000g离心10分钟。
5.DNA结合：小心吸取上清，转移到插入收集管的离心吸附柱内，室温下≧12,000g离心1分钟，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。
6.清洗：加入500µl漂洗液（WB,请确认已加入乙醇！）于离心吸附柱中，室温下≧12,000g离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。
7.再次清洗：加入500µl漂洗液（WB）于离心吸附柱中，室温下≧12,000g离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。
将离心吸附柱开盖再次离心2分钟，彻底除去残余漂洗液。
8.洗脱：小心取出离心吸附柱，将其套入一个新的1.5ml灭菌离心管中。
向硅胶吸附膜的中央加入100µl洗脱缓冲液（EB），室温放置1分钟后，≧12,000g离心1分钟收集质粒DNA。
注意：为提高质粒浓度，最低可使用30µl的EB溶液，离心收集后壳将洗脱的质粒溶液再次加入离心吸附柱中重复洗脱；使用100µlEB溶液则无需二次洗脱；对6kb以上的质粒，可使用预先加热至55℃的EB溶液洗脱以提高产量；EB溶液不含EDTA，故不会影响荧光测序等后续反应；如必须使用无菌去离子水洗脱，需注意其pH值是否接近中性，否则应使用NaOH溶液将pH值调节至7.0-8.5之间。
质粒提取方法
质粒提取：质粒是细胞染色体外弄够自主复制的很小的环状DNA分子。
1、将新鲜单菌落或液体培养物接种到5mL液体培养基中，32℃振荡培养至对数生长后期；（振荡速度250-300rpm）2.将菌液倒入1.5mL离心管中，4℃，10000rpm离心20秒，弃去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使上清液尽可能去尽。
为增加菌体的量，可重复操作2-3次；3.将收集的沉淀重悬于预冷的100μL溶液Ⅰ中，涡旋混匀，使充分悬浮，温室放置5分钟。
4.加入200μL溶液Ⅱ，颠倒混匀，冰浴5分钟。
（1、溶液变成半透明粘液；2、冰浴使染色体DNA片段不至于太小，质粒不容易开环；3、若SDS因温度太低析出，需微热使融）5.加入150μL溶液Ⅲ，混匀，冰浴5分钟，（DNA复性）6.12000rpm离心5分钟，将上清液移至1个新的1.5mL的离心管中，（上清液为复性的质粒，沉淀为缠绕的染色体及少量蛋白质）7.加入2倍体积无水乙醇颠倒混匀，室温放置10分钟，（无需-20℃）8.12000rpm离心10分钟，弃去上清液，将管口打开，倒置于吸水纸上，使所有液体尽可能流出。
9.加入1mL75%乙醇（洗去DNA表面的盐类），12000rpm离心5分钟。
10.弃去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使液体流尽，置通风厨中至液体挥干（乙醇需完全挥发）11.将沉淀溶于40μL含20μg/L（2%的浓度）的RNA酶的TE溶液中，38℃放置于10分钟，-20℃保存。
12.检验（DNA溶于水，不溶于酒精）质粒提取中溶液的配制(准备工作)1. 0.5M EDTA（pH=8.0）(10mL)称取1.8g Na2EDTA•2H2O加入约8mL的去离子水，充分搅拌均匀，用NaOH调节pH至8.0（约0.2gNaOH）pH值为8.0时，EDTA才能完全溶解，加入去离子水将溶液定溶至10mL，高温高压灭菌后室温保存。
2. 1M Tris-HCL(pH=8.0)10mL称量1.211g Tris,加入约8mL去离子水，充分搅拌溶解，加入0.42mL浓盐酸，定容至10mL，高温高压灭菌后，室温保存。
质粒dna提取步骤
质粒dna提取步骤
质粒 DNA 提取是分子生物学实验中的一项基本技术，用于从细菌细胞中分离出质粒DNA。
以下是一般的质粒 DNA 提取步骤：
1. 收集细菌培养物：将含有质粒的细菌培养在适当的培养基上，直到培养物达到合适的密度。
可以使用离心或过滤的方法收集细菌细胞。
2. 细胞裂解：将收集的细菌细胞加入裂解缓冲液中，通过物理方法（如搅拌、超声处理等）或化学方法（如加入裂解酶等）使细胞破裂，释放出质粒 DNA 和其他细胞成分。
3. 去除细胞碎片：将裂解后的混合液通过离心或过滤的方法去除细胞碎片和其他杂质。
4. 沉淀 DNA：向裂解液中加入乙醇或异丙醇等沉淀剂，使质粒 DNA 沉淀。
通过离心将沉淀收集。
5. 洗涤沉淀：用 70%的乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐分和杂质。
6. 干燥沉淀：将洗涤后的沉淀离心，并去除上清液。
然后将沉淀在室温下干燥，以去除残留的乙醇。
7. 溶解 DNA：将干燥的沉淀加入适当的缓冲液中，使质粒 DNA 溶解。
可以在缓冲液中加入 RNA 酶以去除 RNA 杂质。
8. 纯化和浓缩 DNA：可以使用柱层析、电泳或其他方法对提取的质粒 DNA 进行进一步的纯化和浓缩。
9. 质量检测：使用琼脂糖凝胶电泳或其他适当的方法检测提取的质粒 DNA 的质量和完整性。
需要注意的是，具体的质粒 DNA 提取步骤可能因使用的试剂盒或实验条件而有所不同。
在进行质粒 DNA 提取之前，应仔细阅读所使用的试剂盒说明书或相关实验方案，并根据实际情况进行适当的调整和优化。
质粒提取步骤及原理
质粒提取是分子生物学中常用的实验技术，其目的是从细菌中提取出质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。
下面是质粒提取的主要步骤和原理的详细解释。
一、质粒提取原理
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。
作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。
在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。
二、质粒提取步骤
培养细菌使质粒扩增：将含有目标质粒的细菌接种在适当的培养基上，提供适当的条件（如温度、湿度和营养）使细菌生长和繁殖，从而使质粒得到扩增。
收集和裂解细菌：通过离心等方法收集培养好的细菌，然后使用适当的裂解液裂解细菌，使细菌的细胞壁和细胞膜破裂，释放出内部的质粒DNA。
分离和纯化质粒DNA：通过离心、过滤或层析等方法，将裂解液中的蛋白质、细胞碎片等杂质去除，得到相对纯净的质粒DNA。
这个过程中可能需要使用一些特殊的试剂或柱子来提高分离和纯化的效率。
通过以上步骤，我们可以从细菌中提取出高质量的质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。
质-粒-提-取-原理及步骤
质-粒-提-取-原理及步骤概述质粒提取，又称DNA提取，是一种分离和提取所需DNA的过程。
质粒提取在许多实验中都是非常重要的步骤，例如基因工程、分子生物学、遗传学和其他DNA相关实验。
本文将介绍质粒提取的原理及步骤。
原理DNA提取的过程通常包括细胞破碎、DNA纯化、DNA溶解和复性等步骤。
对于质粒提取，主要步骤通常包括以下内容：1.细菌培养：在质粒提取之前，需要将细菌培养在含有适当抗生素的培养基中，用于扩增质粒数量。
2.细胞破碎：使细胞破裂以释放出含有质粒的细胞内物质，此步骤需要进行严格的抗污染措施，以避免污染质粒样本。
3.除去污染物：除去细胞壁、蛋白质、核酸和其他污染物。
4.离心分离：将上述步骤中提取出的样本进行离心分离，使DNA沉淀，以便进一步纯化。
5.溶解：通过加入一定的缓冲液或去离子水，使DNA重新溶解。
步骤以下是一种常见的质粒提取步骤：1.处理样本：将含有所需质粒的细胞收集，并进行初始处理，包括细胞壁破裂、核酸纤维溶解等。
2.傅里叶纯化：通过傅里叶变换纯化，将细胞内杂质和有机污染物清除。
3.离心分离：将细胞样本离心，使DNA沉淀到底部，并且将上层样本移除。
4.乙醇沉淀：加入乙醇沉淀，将DNA纯化到上清液。
5.重振溶解：最后使用适当缓冲液重振重振溶解DNA，也可以使用去离子水重振。
以上就是质粒提取的原理和步骤，这是一个非常重要的操作，在DNA研究和实验中有着广泛的应用。
我们需要注意的是，在操作过程中需要进行高标准的质量控制，以确保实验结果的准确性。
质粒提取原理和方法
质粒提取原理和方法质粒提取是从细菌基因组中提取出质粒DNA的一种方法。
它是分子生物学和遗传工程中常用的技术，可用于质粒的纯化和制备。
质粒提取的原理主要基于以下几个步骤：1.细菌培养：首先，我们需要将含有目标质粒的细菌培养在适当的培养基上，通过高速离心将细菌收集起来。
2.细菌溶解：将培养物进行离心，分离菌落。
然后采用一定的细胞破碎方法，如超声波震荡、冻融等，将细菌细胞壁破坏，使质粒DNA释放到溶液中。
3.质粒分离：通过离心将细菌碎片、蛋白质等杂质与质粒DNA分离。
一般是通过两次离心来完成，第一次较低速离心用于去除细菌碎片和细胞蛋白质，第二次较高速离心用于沉淀质粒DNA。
4.DNA纯化：将质粒DNA从上一步得到的沉淀物中提取出来。
可以使用酚/氯仿法、硅胶柱法、商用试剂盒等方法进行纯化。
其中酚/氯仿法是较为常用的方法，它可以将DNA溶于水相，而蛋白质和其他的污染物则溶于有机相。
5.DNA沉淀：将纯化得到的DNA溶液加入适量的酒精沉淀剂（如乙醇或异丙醇），再次进行高速离心，使DNA沉淀到离心管底部。
6.DNA洗涤：将离心管底部形成的DNA沉淀用70%乙醇洗涤，去除酒精沉淀剂和其他杂质。
然后用空气吹干，最后用一定体积的纯水或缓冲液溶解。
质粒提取的方法根据实验需求不同和实验室条件的不同可以有所差异，常用的方法有以下几种：1.酚/氯仿法：这是一种经典的DNA提取方法，它将质粒DNA溶于三氯甲烷和酚的混合物中，蛋白质和其他污染物则溶于酚相。
离心去除酚相，再用异丙醇沉淀DNA，最后用70%乙醇洗涤。
2.硅胶柱法：这是一种基于硅胶柱的离心柱技术，可用于高通量的质粒提取。
DNA样品在硅胶柱中被结合，杂质被洗掉，最后用纯水或缓冲液洗提质粒DNA。
3.磁珠法：这是一种基于磁性珠子的质粒提取方法，通过在磁性珠子表面修饰DNA结合物，使质粒DNA与磁性珠子结合。
通过外加磁场将磁性珠子与DNA一起沉淀，然后去除上清液，最后用纯水洗提DNA。
三种提取质粒的方法及原理
三种提取质粒的方法及原理《三种提取质粒的方法及原理》一、离心法离心法是最常用的一种提取质粒的方法，它通过离心力的作用，使细胞或质粒（例如DNA、RNA等）从悬浮液中分离出来，从而得到提取的质粒。
分离过程如下：1.从对象（例如细胞）上提取纯化的质粒，使其形成悬浮液。
2.将所得悬浮液置于微量离心机中，加入适当的离心剂，并配置合适的离心条件（如离心速度，离心时间）。
3.根据离心力，细胞及其他悬浮液的组分会在离心机的内壁及底部形成层，质粒则聚集在中心处，形成离心质粒。
4.把离心质粒从中心处取出，即可得到纯化的质粒。
二、丙酮离心法丙酮离心法是一种以丙酮、乙醇和水作为分离剂的提取质粒方法，它可用于提取活性质粒，如抗体、RNA和DNA等，这是因为丙酮和乙醇可以良好地维持质粒的活性，并可以使悬浮液以柱状分离，有利于质粒的提取。
丙酮离心法的分离过程如下：1.将所要提取的对象加入适当的提取液（如200 ml丙酮），形成悬浮液。
2.将悬浮液置于微量离心机中，并配置合适的离心条件。
3.由于丙酮和乙醇的作用，悬浮液以柱状分离，并形成梁状质粒在柱峰中。
4.把梁状质粒从柱峰中取出，即可得到纯化的质粒。
三、超滤法超滤法是一种用于提取质粒的物理分离方法，它通过扩散作用及滤膜孔径的大小，可以有效地将非蛋白质物质等从悬浮液中分离出来，而不改变其本身的结构和性质。
超滤法的分离过程如下：1.将所要提取的对象加入适当的提取液（如水），形成悬浮液。
2.将所得悬浮液置于微量超滤器中，并配置合适的超滤条件（如超滤压力、超滤温度）。
3.根据超滤的原理，液体及其他悬浮物质会被超滤滤膜过滤，而质粒则不会被过滤，从而被滤过的液体中提取出质粒。
4.把质粒从超滤液中取出，即可得到纯化的质粒。
质粒提取原理
质粒提取原理质粒提取是分子生物学实验中常见的操作，其原理主要是利用离心、溶解、沉淀等方法将目标质粒从细菌中提取出来，为后续的实验操作提供必要的材料基础。
下面将详细介绍质粒提取的原理及相关操作步骤。
一、离心法。
离心法是质粒提取的基础步骤之一，其原理是通过高速离心使得细菌细胞和质粒分离。
首先，将含有目标质粒的培养基液体培养物进行离心，使得细菌细胞被沉淀到离心管底部，上清液中则含有目标质粒。
接着，将上清液转移至新的离心管中，再次进行离心操作，将残余的细菌细胞去除，得到含有目标质粒的上清液。
二、溶解法。
溶解法是质粒提取的另一关键步骤，其原理是通过特定的溶解液将目标质粒从细菌细胞中释放出来。
一般情况下，利用含有EDTA和蛋白酶K的溶解液对细菌细胞进行裂解，使得细菌细胞壁和膜被破坏，质粒得以释放。
此时，目标质粒已经被释放到溶解液中，为后续的纯化操作做好准备。
三、沉淀法。
沉淀法是质粒提取的最后一步，其原理是通过加入盐类或醇类使得目标质粒沉淀到溶液底部，从而实现质粒的分离和纯化。
一般情况下，将加入盐类或醇类的溶液与目标质粒混合后，通过离心将质粒沉淀到离心管底部，上清液中则含有杂质和其他不需要的物质。
最后，将上清液倒掉，得到沉淀的质粒，即可用于后续的实验操作。
综上所述，质粒提取的原理主要包括离心、溶解和沉淀三个步骤。
通过这些操作，可以有效地将目标质粒从细菌中提取出来，并得到相对纯净的质粒样品，为分子生物学实验提供了重要的基础材料。
在实际操作中，需要严格按照操作步骤进行操作，并注意操作中的细节，以确保提取到高质量的质粒样品。
希望本文介绍的质粒提取原理能够对相关实验工作有所帮助。
6分钟提取质粒
6分钟提取质粒
"6分钟提取质粒" 通常指的是在分子生物学实验中，从细菌中提取质粒的过程，该过程可以在相对较短的时间内完成。
提取质粒是为了获取质粒中的目标基因、DNA片段或其他重要的遗传物质。
以下是一般的质粒提取步骤，这个过程可以在大约6分钟内完成：
1. 培养菌株：
- 开始前，先在培养基中培养含有目标质粒的大肠杆菌（E. coli）菌株。
2. 离心：
- 将培养好的菌液进行离心，将菌体沉淀。
3. 去除培养基：
- 弃去上清液，保留含有大肠杆菌的菌体沉淀。
4. 溶解：
- 使用缓冲液溶解菌体，使DNA释放。
5. 加入溶解剂：
- 加入一些溶解剂，如碱性SDS（十二烷基硫酸钠），破坏膜脂，释放DNA。
6. 快速离心：
- 进行瞬时离心，将膜脂等杂质快速沉淀。
7. 取上清：
- 取上清液中含有的质粒DNA。
8. 沉淀：
- 加入醋酸等溶液，使DNA沉淀。
9. 洗涤：
- 对DNA沉淀进行洗涤，去除残余的盐和其他污染物。
10. 溶解：
- 最后，用适当的缓冲液溶解沉淀的质粒DNA。
这样的质粒提取方法通常使用快速、高效的离心和溶解步骤，使得整个过程可以在相对较短的时间内完成。
实际提取时间可能因具体实验方案和使用的提取试剂盒而有所不同。
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二、 质粒DNA少量快速提取
质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化 的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同 时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳 分析的需要。
（一）、煮沸法
试验步骤：
• 将振荡过夜培养的细菌1.5ml ，于8 000r/min离心1min， 弃上清液。 • 将沉淀回溶于350μL STET (0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton X-100。)中。 • 加入25μL溶菌酶(10mg/mL)，放入沸水中40s，立即于 10 000r/min离心10min。 • 吸出上清移至另一个Eppendolf 管中或用已灭菌的牙签 小心地将沉淀去除，加入 40μL2.5mol/LNaAc（PH5.2） 和420μL冰冻的异丙醇，振荡混匀，室温放置5 min。 • 12000g，离心5min，弃上清液，用70%乙醇洗涤两次， 然后将离心管倒扣在吸水纸上，使尽量干燥。 • 用20μL无菌水溶解沉淀，于－20℃冻存
小量一步提取法：
由于细菌染色体DNA比质粒大得多,受机械力后细 菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕 附着在细胞碎片上，并发生变性。同样受机械力质粒 DNA会变性，机械力后复性。但质粒DNA的复性要快 于细菌染色体DNA。
从细菌中分离质粒DNA的方法都包括 3个基本步骤:
1、培养细菌使质粒扩增 2、收集和裂解细胞 3、分离和纯化质粒DNA
13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton X-100。
14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。
10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及 导致RNA和DNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基 喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/L Tris·Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下 DNA会分配于有机相。
11、 氯仿:按氯仿:异戊醇＝24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有 助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。 按体积 /体积＝1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性， 操作时应戴手套。
12、 TE缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压 灭菌后储存于4℃冰箱中。
7、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (临用前用5-10mol/L NaOH母液稀释)，1 ％ SDS。
8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至 100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。
9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用 1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20℃。
基因工程原理与技 术实验部分：
质粒三种提 取方法的比 较
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子, 大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并 以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现 于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制 和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并 表达所携带的遗传信息。
实验目的：
1、学会小量制备质粒DNA的碱裂解方 法、 煮沸法、小量一步提取法这三种质 粒DNA的提取方法。 2、三种方法的比较，能够根据不同的 实验目的选择合适的方法。
实验原理：
碱变性原理 ： 根据共价闭合环状质粒DNA与线性 DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5 这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而 被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒 DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍 会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐 缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒 DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经 过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。
（三）小量一步提取法
1.取0.5ml细菌过夜培养物，置1.5ml的Eppendolf管中 2.加入0.5ml的氯仿：异戊醇，用振荡器最大速度振荡1min， 充分混匀。 3.12000g，离心5min，取上清移至另一个Eppendolf管中， 加入500µl异丙醇混匀，立即12000g，离心5min。 4.弃上清，加入500µl70%乙醇漂洗沉淀，短暂离心。 5.弃上清，室温干燥沉淀2min，然后加入20μl无菌水溶解 DNA。
三、试剂 1、 LB液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母
提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调 pH至7.5, 加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。
2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。 3、 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, -20℃保 存备用。 4、 溶菌酶溶液： 用10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分 装成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。 5、 3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml水中溶解40.81g NaAc·3H2 O,用冰醋 酸调pH至5.2, 加水定容至100ml, 分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。 6、 溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟, 储存于4℃冰箱。
思考题
1、碱裂解法提取质粒DNA时应注意哪 些问题？溶液Ｉ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的 作用？ 2、描述质粒DNA的电泳图谱，并解释 产生的现象及可能的原因？
材料、设备及试剂
一、材料
含卡那酶素的E. coli DH5α，1.5ml塑料离心管(又称 eppendorf管), 离心管架。
二、设备
微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒 温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器， 电 泳仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。
[注意]
1. 提取过程应尽量保持低温。 2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/ 氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量 除干净需多次抽提。 3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时 间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA 可用异丙醇(一 般使用等体积), 无水乙醇（2-2.5倍体积），区别？。
DNA双链
变性 强碱
DNA单链 中性
复性
闭合环状的质粒DNA，在变性后不会 分离，复性快；
染色体线性DNA和或有缺口的质粒 DNA变性后双链分离，难以复性而形成 缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结 合在一起，在离心的时候沉淀下去。
变性
煮沸法：
将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁 的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100℃使其裂 解。加热除了破坏细胞壁外，还有助于解开 DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体 DNA变性。但是，闭环质粒DNA彼此不会分 离，这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相 缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA 的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心 除去变性的染色体核蛋白质，就可从上清中 回收质粒DNA
15、 电泳所用试剂： （1） TBE 缓冲液 (5×)：称取 Tris 54g，硼酸27.5g， 并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。 （2）上样缓冲液 (6×)： 0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。Fra bibliotek操作步骤
一、 细菌的培养和收集
将含有质粒菌种接种在LB固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Kan)中,37℃振荡培养约12小时至对 数生长后期。
（二）、碱裂解法
1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下10000rpm离心 5min。
2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于150μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分 钟。 4、加入新配制的溶液Ⅱ300μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管 数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。 5、加入227μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒, 使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。 6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),颠倒混 匀, 4℃下12000g离心5分钟，重复一次。 7、将水相移入干净eppendorf管中,加入0.6-1倍体积的异丙醇,颠倒混 匀静置10分钟，然后12000g离心10分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入100ul 70％ 乙醇洗沉淀两次。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽, 室温干燥。 10、将沉淀溶于20-50μl 无菌水中，储于-20℃冰箱中。
在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提 取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的 质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多 处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状 分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如 果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状 DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒 DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动 速度快。
质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化 的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同 时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳 分析的需要。
（一）、煮沸法
试验步骤：
• 将振荡过夜培养的细菌1.5ml ，于8 000r/min离心1min， 弃上清液。 • 将沉淀回溶于350μL STET (0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton X-100。)中。 • 加入25μL溶菌酶(10mg/mL)，放入沸水中40s，立即于 10 000r/min离心10min。 • 吸出上清移至另一个Eppendolf 管中或用已灭菌的牙签 小心地将沉淀去除，加入 40μL2.5mol/LNaAc（PH5.2） 和420μL冰冻的异丙醇，振荡混匀，室温放置5 min。 • 12000g，离心5min，弃上清液，用70%乙醇洗涤两次， 然后将离心管倒扣在吸水纸上，使尽量干燥。 • 用20μL无菌水溶解沉淀，于－20℃冻存
小量一步提取法：
由于细菌染色体DNA比质粒大得多,受机械力后细 菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕 附着在细胞碎片上，并发生变性。同样受机械力质粒 DNA会变性，机械力后复性。但质粒DNA的复性要快 于细菌染色体DNA。
从细菌中分离质粒DNA的方法都包括 3个基本步骤:
1、培养细菌使质粒扩增 2、收集和裂解细胞 3、分离和纯化质粒DNA
13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton X-100。
14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。
10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及 导致RNA和DNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基 喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/L Tris·Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下 DNA会分配于有机相。
11、 氯仿:按氯仿:异戊醇＝24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有 助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。 按体积 /体积＝1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性， 操作时应戴手套。
12、 TE缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压 灭菌后储存于4℃冰箱中。
7、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (临用前用5-10mol/L NaOH母液稀释)，1 ％ SDS。
8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至 100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。
9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用 1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20℃。
基因工程原理与技 术实验部分：
质粒三种提 取方法的比 较
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子, 大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并 以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现 于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制 和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并 表达所携带的遗传信息。
实验目的：
1、学会小量制备质粒DNA的碱裂解方 法、 煮沸法、小量一步提取法这三种质 粒DNA的提取方法。 2、三种方法的比较，能够根据不同的 实验目的选择合适的方法。
实验原理：
碱变性原理 ： 根据共价闭合环状质粒DNA与线性 DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5 这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而 被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒 DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍 会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐 缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒 DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经 过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。
（三）小量一步提取法
1.取0.5ml细菌过夜培养物，置1.5ml的Eppendolf管中 2.加入0.5ml的氯仿：异戊醇，用振荡器最大速度振荡1min， 充分混匀。 3.12000g，离心5min，取上清移至另一个Eppendolf管中， 加入500µl异丙醇混匀，立即12000g，离心5min。 4.弃上清，加入500µl70%乙醇漂洗沉淀，短暂离心。 5.弃上清，室温干燥沉淀2min，然后加入20μl无菌水溶解 DNA。
三、试剂 1、 LB液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母
提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调 pH至7.5, 加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。
2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。 3、 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, -20℃保 存备用。 4、 溶菌酶溶液： 用10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分 装成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。 5、 3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml水中溶解40.81g NaAc·3H2 O,用冰醋 酸调pH至5.2, 加水定容至100ml, 分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。 6、 溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟, 储存于4℃冰箱。
思考题
1、碱裂解法提取质粒DNA时应注意哪 些问题？溶液Ｉ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的 作用？ 2、描述质粒DNA的电泳图谱，并解释 产生的现象及可能的原因？
材料、设备及试剂
一、材料
含卡那酶素的E. coli DH5α，1.5ml塑料离心管(又称 eppendorf管), 离心管架。
二、设备
微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒 温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器， 电 泳仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。
[注意]
1. 提取过程应尽量保持低温。 2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/ 氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量 除干净需多次抽提。 3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时 间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA 可用异丙醇(一 般使用等体积), 无水乙醇（2-2.5倍体积），区别？。
DNA双链
变性 强碱
DNA单链 中性
复性
闭合环状的质粒DNA，在变性后不会 分离，复性快；
染色体线性DNA和或有缺口的质粒 DNA变性后双链分离，难以复性而形成 缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结 合在一起，在离心的时候沉淀下去。
变性
煮沸法：
将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁 的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100℃使其裂 解。加热除了破坏细胞壁外，还有助于解开 DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体 DNA变性。但是，闭环质粒DNA彼此不会分 离，这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相 缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA 的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心 除去变性的染色体核蛋白质，就可从上清中 回收质粒DNA
15、 电泳所用试剂： （1） TBE 缓冲液 (5×)：称取 Tris 54g，硼酸27.5g， 并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。 （2）上样缓冲液 (6×)： 0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。Fra bibliotek操作步骤
一、 细菌的培养和收集
将含有质粒菌种接种在LB固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Kan)中,37℃振荡培养约12小时至对 数生长后期。
（二）、碱裂解法
1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下10000rpm离心 5min。
2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于150μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分 钟。 4、加入新配制的溶液Ⅱ300μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管 数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。 5、加入227μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒, 使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。 6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),颠倒混 匀, 4℃下12000g离心5分钟，重复一次。 7、将水相移入干净eppendorf管中,加入0.6-1倍体积的异丙醇,颠倒混 匀静置10分钟，然后12000g离心10分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入100ul 70％ 乙醇洗沉淀两次。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽, 室温干燥。 10、将沉淀溶于20-50μl 无菌水中，储于-20℃冰箱中。
在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提 取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的 质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多 处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状 分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如 果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状 DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒 DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动 速度快。