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大量提取质粒DNA（CsCl密度梯度离心法）李渊越1.预约摇床、超速离心机。
2.配TB培养基（1L锥形瓶中装250 ml培养液），并灭菌。
质粒做好转化，并涂板。
、。
17.超离后，取样品，用5 ml注射器加上12#针头，抽取EB带，（离心完可见两条EB带，上面一条细浅的带为断裂的质粒DNA,应抽取下面一条粗浓的EB带）放入50ml管中。
18.以灭菌水饱和正丁醇溶液萃取EB，直到溶液澄清无色。
19.加入等体积TE（一定要加。
若不加，在无水乙醇沉淀时，会沉淀下部分CsCl）。
20.加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀（如果不充分混匀，可能会导致离下的DNA是透明的，容易随上清一起倒掉）。
6,000rpm，20min，（注意方向）去上清（注意沉淀不会贴壁，不要倒掉）。
21.加入450 µl (~900ul)水，把50mL离心管平放（注意方向），溶解，直到溶解完全（约需室温过夜）。
22.用枪小心将液体吸入1.5mL离心管中（如>450ul，可分成两管），加入十分之一体积的3 M NaAc (pH5.2)，再加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，置于4C或-20C 15-30min。
13,000 rpm 离心10min。
23.用1mL 70%预冷的乙醇洗沉淀一次，13,000rpm 离心10min。
24.去上清，以1mL TE溶解完全，测定浓度。
lysozyme-EDTA-RNase溶液溶菌酶0.4 g0.5M EDTA (pH=8.0) 25mLRNase A (100mg/mL) 120uLH2O 25mL25％蔗糖:蔗糖25 g1 M Tris-HCl（pH 8.0） 5 ml过滤，加纯水定容至100 ml，置于4 ℃保存。
0.5 M EDTA（pH 8.0）:EDTA·Na·2H2O 186.1gNaOH 约20 g加800 ml纯水溶解完全后，调pH至8.0，定容至1 L，湿热灭菌，常温保存。
提取质粒的原理质粒是一种环状的DNA分子，存在于细菌、酵母等微生物细胞中，具有自主复制和传递的能力。
质粒在基因工程中扮演着重要的角色，可以被用来携带外源基因并在宿主细胞中表达。
因此，提取质粒是基因工程实验中必不可少的步骤之一。
本文将介绍提取质粒的原理及其相关技术。
提取质粒的原理提取质粒的原理基于细胞裂解和质粒分离的过程。
一般来说，提取质粒的步骤包括以下几个方面：1. 细胞裂解首先需要将含有质粒的细胞进行裂解，使质粒从细胞内部释放出来。
细胞裂解的方法有多种，包括机械破碎、超声波破碎、化学裂解等。
其中，化学裂解是最常用的方法之一，其原理是利用化学试剂破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内部的物质释放出来。
常用的化学试剂包括SDS、EDTA、蛋白酶K等。
2. 分离质粒细胞裂解后，需要将质粒从其他细胞组分中分离出来。
质粒的分离方法有多种，包括离心、柱层析、电泳等。
其中，离心是最常用的方法之一，其原理是利用离心力将不同密度的物质分离开来。
在离心过程中，质粒会沉积到离心管底部形成沉淀，其他细胞组分则会在上层形成上清液。
此时，可以将上清液倒掉，留下质粒沉淀。
3. 纯化质粒分离出的质粒可能会受到其他杂质的污染，因此需要进行纯化。
质粒的纯化方法有多种，包括酚-氯仿法、硅胶柱层析法、离子交换柱层析法等。
其中，酚-氯仿法是最常用的方法之一，其原理是利用酚和氯仿的不同溶解度将DNA、RNA和蛋白质分离开来。
在酚-氯仿法中，质粒会在上层形成一个白色的粘稠物质，其他杂质则会在下层形成。
提取质粒的技术提取质粒的技术有多种，包括常规提取法、快速提取法、自动提取法等。
其中，常规提取法是最常用的方法之一，其步骤如下：1. 细胞裂解将含有质粒的细胞进行裂解，使质粒从细胞内部释放出来。
常用的化学试剂包括SDS、EDTA、蛋白酶K等。
2. 分离质粒将裂解后的细胞进行离心，分离出质粒沉淀。
3. 纯化质粒将分离出的质粒进行酚-氯仿法纯化。
4. 洗涤质粒将纯化后的质粒进行洗涤，去除残留的酚和氯仿。
质粒DNA的提取一、原理采用碱变性发抽提取质粒DNA。
该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。
在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。
而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、方法1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。
2.将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。
反复数次，收集全部菌体。
3.倾去上清，滤纸吸干。
4.加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。
5.加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/LNaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。
6.加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染色体DNA。
7.上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。
8.上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。
9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。
10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。
lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。
12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。
碱裂解时间的延长而降低，随着粘稠度的增加而减低这个现象，完全可以使用碱裂解法来抽提大质粒的：增加试剂的使用量，使加入NaOH/SDS液后，溶液在1分钟内就能变得很清澈；立即加入中和试剂。
这个实验我们没有做过，但QIAGEN抽提大质粒用的就是碱裂解法。
【质粒抽提的8大窍门】1：摇菌时间-过夜培养是一个普遍接受的概念，而且适合大部分情况。
如果出现了问题，调整培养时间会有帮助：Nick多，则增加培养时间；酶切出现问题，则减少培养时间。
2：起始菌体量-大家习惯说“从多少ml菌液中抽提质粒”，但一定要养成每次都观察菌体量的习惯，因为质粒毕竟是在菌体中，而且，抽提质粒所用的试剂量，都只与菌体量有关。
3：菌体的彻底悬浮-如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液II加入后，变成一个外围几乎彻底裂解，往里不完全裂解，中间没有裂解的团块。
这个团块在溶液III加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。
4：使用相对过量的试剂-这是适合所有核酸抽提的建议。
试剂相对过量的好处是：稳定性好，纯度高，操作更简单。
如果认为这样不经济，就少用一点菌体。
5：裂解时间-加入溶液II后，混匀，体系最好能立即变得清澈。
体系如果变得清澈了，马上加入溶液III中和。
如果体系不马上变清澈，下次少用一点菌液，或者多用一点溶液。
如今的质粒设计得越来越复杂了，奇怪的现象也越来越多，而所有的奇怪现象，多与裂解时间有关。
6：中和的操作-在 1.5ml离心管中加入溶液III后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。
效果非常好。
7：中和后的离心去蛋白-一定要将蛋白质彻底离心下去。
如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面，继续离心的效果并不好；而将上清倒入另外一个离心管中，再离心，效果要好许多。
【降低RNA残留的方法】RNA的去除，首先是使用RNase消化。
在溶液I中加入高浓度的RNase A(100ug/ml)，或者用含25ug RNase A/ml TE溶解抽提好的质粒，都可以降低RNA残留，但都不能彻底去除。
PEG8000沉淀法大量制备和纯化质粒1质粒提取纯化步骤1.1 质粒提取步骤1) 在超净工作台上，将甘油管保种的质粒菌自然解冻后接种到含200 mL 液体LB（含100 μg/mL Kan）培养基的三角瓶中；2) 置于恒温摇床中，37℃、180 rpm条件下振荡培养16个小时；3) 用50 mL离心管在12,000 rpm、2 min条件下离心菌液，弃上清；4）重复步骤3，将200 mL菌体合并到2个50 mL离心管中；5) 菌泥重悬于3.6 mL 溶液I，加入400 μL新配的溶菌酶（10 mg/mL），涡旋震荡混匀，室温放置15-20 min，中间晃动2-3次；6) 加入8 mL现配的溶液II，盖紧管盖后轻柔颠倒10次混匀至溶液呈透明粘稠状；7) 加入4 mL预冷的溶液III，盖紧管盖后颠倒10次混匀至白色絮状沉淀呈均匀分散状；8) 12,000 rpm离心10 min，用尼龙滤膜过滤将上清液转移至新的50 mL离心管中；9) 加入0.6倍体积的异丙醇（9.6 mL），充分混匀后室温放置30 min；10) 12,000 rpm离心5 min，弃上清，加入5 mL 70%乙醇洗涤沉淀，12,000 rpm 离心2 min；11) 弃乙醇，晾干后加400 μL TE（pH 8.0）溶解核酸，转入10 mL离心管中，再加200 μL TE洗管，合并后共600 μL于4℃保存。
（如果提取量较多，合并后TE应少于2.5 mL）1.2 大提质粒的纯化1) 在上述保存的每管中加等体积（600 μL）预冷的5 M LiCl，充分混匀后冰浴10 min，12,000 rpm离心10 min；2) 取上清加等体积（1.2 mL）异丙醇，充分混匀后放置20 min，12,000 rpm 离心10 min，弃上清；3) 70%乙醇洗涤，12,000 rpm离心2 min弃上清，晾干后加700 μL TE 溶解于1.5 mL离心管中，加10 μL RNaseA（10 mg/mL），37 ℃消化30 min；4) 加入0.5体积（350 μL）的含30 mM MgCl2的40% PEG8000，倒置混匀数次可观察到蛋清色絮状沉淀，静置20 min，12,000 rpm离心20 min，弃上清；5) 70%乙醇洗涤，12000 rpm离心2 min弃上清，晾干后加700 μL TE 溶解于1.5 mL离心管中；6) 加等体积（酚350 μL，氯仿/异戊醇350 μL）的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混匀5 min，12,000 rpm离心10 min，取上清再次用酚/氯仿/异戊醇抽提一次；7) 取上清，加入等体积（650 μL）氯仿/异戊醇（24：1）混匀5 min，12,000rpm离心10 min；8) 取上清600 μL于2 mL离心管中，加约1/10体积（60 μL）NaAc（3 M，pH 5.2），加2倍体积（1.2 mL）无水乙醇混匀，室温放置20 min。
质粒提取原理和方法质粒提取是从细菌基因组中提取出质粒DNA的一种方法。
它是分子生物学和遗传工程中常用的技术，可用于质粒的纯化和制备。
质粒提取的原理主要基于以下几个步骤：1.细菌培养：首先，我们需要将含有目标质粒的细菌培养在适当的培养基上，通过高速离心将细菌收集起来。
2.细菌溶解：将培养物进行离心，分离菌落。
然后采用一定的细胞破碎方法，如超声波震荡、冻融等，将细菌细胞壁破坏，使质粒DNA释放到溶液中。
3.质粒分离：通过离心将细菌碎片、蛋白质等杂质与质粒DNA分离。
一般是通过两次离心来完成，第一次较低速离心用于去除细菌碎片和细胞蛋白质，第二次较高速离心用于沉淀质粒DNA。
4.DNA纯化：将质粒DNA从上一步得到的沉淀物中提取出来。
可以使用酚/氯仿法、硅胶柱法、商用试剂盒等方法进行纯化。
其中酚/氯仿法是较为常用的方法，它可以将DNA溶于水相，而蛋白质和其他的污染物则溶于有机相。
5.DNA沉淀：将纯化得到的DNA溶液加入适量的酒精沉淀剂（如乙醇或异丙醇），再次进行高速离心，使DNA沉淀到离心管底部。
6.DNA洗涤：将离心管底部形成的DNA沉淀用70%乙醇洗涤，去除酒精沉淀剂和其他杂质。
然后用空气吹干，最后用一定体积的纯水或缓冲液溶解。
质粒提取的方法根据实验需求不同和实验室条件的不同可以有所差异，常用的方法有以下几种：1.酚/氯仿法：这是一种经典的DNA提取方法，它将质粒DNA溶于三氯甲烷和酚的混合物中，蛋白质和其他污染物则溶于酚相。
离心去除酚相，再用异丙醇沉淀DNA，最后用70%乙醇洗涤。
2.硅胶柱法：这是一种基于硅胶柱的离心柱技术，可用于高通量的质粒提取。
DNA样品在硅胶柱中被结合，杂质被洗掉，最后用纯水或缓冲液洗提质粒DNA。
3.磁珠法：这是一种基于磁性珠子的质粒提取方法，通过在磁性珠子表面修饰DNA结合物，使质粒DNA与磁性珠子结合。
通过外加磁场将磁性珠子与DNA一起沉淀，然后去除上清液，最后用纯水洗提DNA。
提取质粒的方法提取质粒是分子生物学实验中的常见步骤之一，其目的是将细菌中的质粒分离出来，以进行后续的实验操作。
提取质粒有多种方法，本文将介绍其中的几种常用方法及其优缺点。
一、CACl2热激转化法CACl2热激转化法是经典的提取质粒方法之一。
其过程如下：1. 将含有目的质粒的细菌培养物进行扩增，使细菌数达到一定程度。
2. 离心将细菌沉淀下来，将培养液中的菌落去除。
3. 用无菌水洗涤细菌沉淀，用CACl2溶液缓慢重悬细菌，使CACl2浓度达到0.1M。
4. 加入pH 6.5的冷缓冲液，浸泡在冰上15分钟。
5. 在热水浴中40-45℃，热激转化。
6. 加入含有抗生素的琼脂糖平板上进行筛选。
该方法的优点是操作简单，不需要特殊设备，且质粒提取量较大。
但其缺点也显而易见，即有毒化学物质CACl2使用，对质粒构建的影响较大，在序列克隆等需要高质量的质粒时不适用。
二、碱裂解法碱裂解法是一种有效的质粒提取方法，是利用质粒DNA与蛋白质的不同耐碱性，将质粒分离出来的方法。
其操作流程如下：1. 将细菌沉淀用含50mM Tris-HCl（pH 8.0）的盐水洗涤。
2. 加入含50mM Tris-HCl（pH 8.0）、25mM EDTA和1%SDS的Lysis Buffer（血浆蛋白）溶液，充分振荡混合，放在65℃水浴中加热，使细胞破裂并释放DNA和蛋白质。
3. 加入冷异丙醇，低温离心，使DNA和蛋白质分开。
注意此步骤中异丙醇的体积比例对DNA的提取量有较大影响，需根据实验需要酌情设置。
4. 倒出上清液，将沉淀用50%异丙醇洗涤。
5. 将洗涤后的沉淀用无菌水重悬，进行后续实验操作。
碱裂解法优点较多，其操作简单、快捷，可以得到较纯的质粒DNA，适用于后续实验需要高质量的DNA。
三、亲水性亲油性法亲水性亲油性法又称酚-氯仿法，其原理是利用亲油性有机溶剂和亲水性酚盐在酚-氯仿-异丙醇三相体系中分离质粒和其它细胞成分。
其操作流程如下：1. 培养含有质粒的细菌，并进行扩增。
三种提取质粒的方法及原理《三种提取质粒的方法及原理》一、离心法离心法是最常用的一种提取质粒的方法，它通过离心力的作用，使细胞或质粒（例如DNA、RNA等）从悬浮液中分离出来，从而得到提取的质粒。
分离过程如下：1.从对象（例如细胞）上提取纯化的质粒，使其形成悬浮液。
2.将所得悬浮液置于微量离心机中，加入适当的离心剂，并配置合适的离心条件（如离心速度，离心时间）。
3.根据离心力，细胞及其他悬浮液的组分会在离心机的内壁及底部形成层，质粒则聚集在中心处，形成离心质粒。
4.把离心质粒从中心处取出，即可得到纯化的质粒。
二、丙酮离心法丙酮离心法是一种以丙酮、乙醇和水作为分离剂的提取质粒方法，它可用于提取活性质粒，如抗体、RNA和DNA等，这是因为丙酮和乙醇可以良好地维持质粒的活性，并可以使悬浮液以柱状分离，有利于质粒的提取。
丙酮离心法的分离过程如下：1.将所要提取的对象加入适当的提取液（如200 ml丙酮），形成悬浮液。
2.将悬浮液置于微量离心机中，并配置合适的离心条件。
3.由于丙酮和乙醇的作用，悬浮液以柱状分离，并形成梁状质粒在柱峰中。
4.把梁状质粒从柱峰中取出，即可得到纯化的质粒。
三、超滤法超滤法是一种用于提取质粒的物理分离方法，它通过扩散作用及滤膜孔径的大小，可以有效地将非蛋白质物质等从悬浮液中分离出来，而不改变其本身的结构和性质。
超滤法的分离过程如下：1.将所要提取的对象加入适当的提取液（如水），形成悬浮液。
2.将所得悬浮液置于微量超滤器中，并配置合适的超滤条件（如超滤压力、超滤温度）。
3.根据超滤的原理，液体及其他悬浮物质会被超滤滤膜过滤，而质粒则不会被过滤，从而被滤过的液体中提取出质粒。
4.把质粒从超滤液中取出，即可得到纯化的质粒。
从细菌中分离质粒 DNA 的具体操作材料、设备及试剂一、材料含PBS的E.coliDH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料离心管（又称eppendorf管），离心管架。
二、设备微量取液器（20μl，200μl，1000μl），台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器（灭菌锅），涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。
三、试剂1、LB液体培养基（Luria-Bertani）：称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH 调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。
2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。
3、氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存备用。
4、溶菌酶溶液：用10mmol/LTris•Cl（pH8.0）溶液配制成10mg/ml，并分装成小份（如1.5ml）保存于-20℃，每一小份一经使用后便予丢弃。
5、3mol/lNaAc（pH5.2）：50ml水中溶解40.81gNaAc•3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。
6、溶液1:50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。
溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。
7、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1％SDS。
8、溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。
溶液终浓度为：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。
9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/LTris•Cl（pH7.5），15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。
冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20℃。
10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联，应在160℃用冷凝管进行重蒸。
重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉（作为抗氧化剂），并用等体积的0.5mol/LTris•Cl （pH8.0）和0.1mol/LTris•Cl（pH8.0）缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上，因为酸性条件下DNA会分配于有机相。
11、氯仿：按氯仿：异戊醇＝24：1体积比加入异戊醇。
氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。
按体积/体积＝1：1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿（1:1）。
酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。
12、TE缓冲液：10mmo/LTris•Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。
高压灭菌后储存于4℃冰箱中。
13、STET：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris•Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA （pH8.0），5%TritonX-100。
14、STE：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris•Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA （pH8.0）。
15、电泳所用试剂：（1）TBE缓冲液（5×）：称取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA（pH8.0）20ml，定溶至1000ml。
（2）上样缓冲液（6×）：0.25%溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液。
操作步骤一、细菌的培养和收集将含有质粒pBS的DH5α菌种接种在LB固体培养基（含50μg/mlAmp）中，37℃培养12-24小时。
用无菌牙签挑取单菌落接种到5mlLB液体培养基（含50μg/mlAmp）中，37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。
二、质粒DNA少量快速提取质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。
这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样，所得DNA有一定纯度，可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
（一）、煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中，4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120mlSTET溶液中，涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml），涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
[注意]1.对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，浓度高时，细菌裂解效果反而不好。
有时不同溶菌酶也能溶菌。
3.提取的质粒DNA中会含有RNA，但RNA并不干扰进一步实验，如限制性内切酶消化，亚克隆及连接反应等。
（二）、碱法1、取1.5ml培养液倒入1.5mleppendorf管中，4℃下12000g离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。
3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中（需剧烈振荡），室温下放置5-10分钟。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf 管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴5分钟。
5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4℃下12000g离心5-10分钟。
6、上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4℃下12000g离心5分钟。
7、将水相移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。
8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5-10分钟。
9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。
10、将沉淀溶于20μlTE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，储于-20℃冰箱中。
[注意]1.提取过程应尽量保持低温。
2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。
3.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。
沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。
（三）、Wizard少量DNA纯化系统Promega公司的Wizard少量DNA纯化系统可快速有效的抽提质粒DNA，整个过程只需15分钟。
提取的质粒可直接用于DNA测序、酶切分析和体外转录等。
该系统中所含试剂和柱子可以用于50次1-3ml质粒培养液的分离和纯化，试剂包括10ml细胞悬浮液，10ml细胞裂解液；10ml中和液，50mlWizard少量DNA纯化树脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml）和50支Wizard微型柱。
1、1-3ml过夜培养细胞液4℃下12000g离心1-2分钟。
2、去除上清液，菌体细胞悬浮于200μl细胞悬浮液中，充分混合，并移入eppendorf管中。
3、加200μl细胞裂解液，颠倒离心管数次，直到溶液变清亮。
4、加200μl中和液，颠倒离心管数次。
5、4℃下12000g离心5分钟，取上清液于新的eppendorf管中。
6、加1mlWizard少量DNA纯化树脂，颠倒离心管数次以充分混匀。
7、取一次性注射器，取出注塞，并使注射筒与Wizard微型柱连接，用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推，使混合物进入微型柱。
8、将注射器与微型柱分开，取出注塞，再将注射筒与微型柱相连，加入2ml柱洗液，并用注塞轻推，使柱洗液进入微型柱。
9、取出微型柱置于eppendorf管中，离心2分钟以除去微型柱中的柱洗液。
10、将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50μlTE（或水）于微型柱中，静止1分钟后，4℃下12000g离心20秒。
11、丢弃微型柱，将eppendorf管中的质粒DNA贮于4℃或-20℃冰箱。
[注意]树脂使用前应充分混匀，如有结晶，可将树脂用25-37℃水浴处理10分钟。
三、质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA，为此需要大量提取质粒DNA。
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化，常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
（一）、碱法1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟，弃上清，将离心管倒置使上清液全部流尽。
2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。
3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。
4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中，充分悬浮菌体细胞。
5、加入12ml新配制的溶液II，盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，冰浴10分钟。
6、加9ml用冰预冷的溶液III，摇动离心管数次以混匀内容物，冰上放置15分钟，此时应形成白色絮状沉淀。
7、4℃下5000g离心15分钟。
8、取上清液，加入50mlRNA酶A（10mg/ml），37℃水浴20分钟。
9、加入等体积的饱和酚/氯仿，振荡混匀，4℃下12000g离心10分钟。
10、取上层水相，加入等体积氯仿，振荡混匀，4℃下12000g离心10分钟。
11、取上层水相，加入1/5体积的4mol/LNaCl和10%PEG（分子量6000），冰上放置60分钟。
12、4℃下12000g离心15分钟，沉淀用数ml70%冰冷乙醇洗涤，4℃下12000g离心5分钟。
13、真空抽干沉淀，溶于500mlTE或水中。
[注意]1.提取过程中应尽量保持低温。
2.加入溶液II和溶液III后操作应混和，切忌剧烈振荡。
3.由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐热的特性，使用时应先对该酶液进行热处理（80℃1小时），使DNA酶失活。
（二）、Wazard大量DNA纯化系统碱法大量提取DNA往往需要很长的时间.Promega公司的Wiazrd大量DNA纯化系统既简单又快速，只需要离心和真空抽干，这个系统可以从500ml 培养液中在3小时以内获得1mg以上的高质量的质粒DNA（200-20000bp）。
该系统不需要酚和氯仿抽提，纯化后的DNA溶于水或TE缓冲液中，不含任何盐份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反应，也可以用于在核酸酶抑制剂（如RNasin）存在的条件下进行体外转录反应等。
