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五种杀菌剂对梨黑斑病的室内毒力测定梁魁景; 侯晓杰; 高小宽; 张志强; 欧阳汝欣【期刊名称】《《北方果树》》【年(卷),期】2019(000)002【总页数】3页(P8-10)【关键词】梨黑斑病; 杀菌剂; 室内毒力测定【作者】梁魁景; 侯晓杰; 高小宽; 张志强; 欧阳汝欣【作者单位】衡水学院生命科学系河北衡水 053000【正文语种】中文【中图分类】S436.612.1+4梨黑斑病又称裂果病，是梨树的三大病害之一，由真菌的链格孢菌（Alternaria alternate（Fr.）Keissl）侵染所引起[1]。
侵染可分为春季分生的新孢子引起的初次侵染和由初次侵染后在田间引起再侵染两部分组成[2]。
梨树花期和幼果期是该病潜伏侵染时期，在果实贮藏期间最易发病并且不易控制和防范[3]。
链格孢菌属半知菌亚门链格胞属。
病斑上的黑霉是病菌的分生孢子梗和分生孢子。
分生孢子梗褐至黄褐色，丛生，基部稍粗，上端略细，有分隔。
孢子脱落后有胞痕。
分生孢子串生，倒棍棒形，有纵横分隔，成熟的孢子褐色。
在20～30 ℃之间病原菌能生长， pH 值限定4～12。
在相对湿度为50%～100%时孢子可萌发，在水滴中萌发率最高，其萌发时最适pH 值为7～8[4]。
当前市场上，防治梨黑斑病的杀菌剂出现不少[5]。
有田瑞等报道的10%世高对梨黑斑病有很好防效[6]。
夏景玉等报道了多福悬浮剂对梨黑斑病有较好的控制作用[7]。
蔺经等经过实验认为嘧霉胺对梨黑斑病的防效理想[8]。
白亚梅等报道80%大生M-45 可湿性粉剂对梨黑斑病有较好的防效，防效达95.5%[9]。
付余波等报道，50%异菌脲悬浮剂对梨黑斑病有较好防治效果[10]。
禹明甫等报道，60%百泰可分散粒剂1 500 倍液的药效表现最好，3 次用药后10 d 的防效达到99.79%[11]。
阳延密等通过试验表明，扑海因1 500 倍液对梨黑斑病防效较理想，达82%[12]。
目前防治梨黑斑病的药品杂乱无章，用药选择是多了，但对很多药品都缺乏药效评价，以至于在田间生产时果农不知如何加以辨别和选择。
㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(７):１４５~１５１ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０７.０２０收稿日期:２０２２－１０－０９基金项目:山东省高校中药质量控制与全产业链建设协同创新中心项目(ＣＹＬＸＴＣＸ２０２１－０６)ꎻ山东省创新公共服务平台计划中药分子鉴定公共服务平台项目(２０１８ＪＧＸ１１１)ꎻ山东省农业科学院齐鲁农科英才工程(创新类)项目作者简介:朱桐杉(１９９７ )ꎬ女ꎬ山东临沂人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向:中药资源与质量控制研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｚｔｓ０１１６＠１６３.ｃｏｍ通信作者:张永清(１９６２ )ꎬ男ꎬ山东平邑人ꎬ教授ꎬ主要从事中药资源与质量控制研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｚｙｑ６２２００３＠１２６.ｃｏｍ张全芳(１９７８ )ꎬ女ꎬ甘肃酒泉人ꎬ副研究员ꎬ主要从事中药资源开发与利用ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｚｈｑｕａｎｆａｎｇ＠１６３.ｃｏｍ３种常见金银花致病菌多重实时荧光定量ＰＣＲ检测方法研究朱桐杉１ꎬ刘艳艳２ꎬ谭晴晴２ꎬ刘国霞２ꎬ陈雪燕２ꎬ步迅２ꎬ王文博３ꎬ于子涵１ꎬ４ꎬ张全芳２ꎬ张永清１(１.山东中医药大学药学院ꎬ山东济南㊀２５０３５５ꎻ２.山东省农业科学院农作物种质资源研究所ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ３.山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ４.山东中医药大学附属医院ꎬ山东济南㊀２５００１３)㊀㊀摘要:为了建立可同时检测炭疽病病原菌(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ)㊁白粉病病原菌(Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ)和褐斑病病原菌(Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ)３种金银花重要叶部病原菌的多重实时荧光定量ＰＣＲ快速检测方法ꎬ本试验基于３种病原菌ＩＴＳ片段序列分别设计特异引物和ＴａｑＭａｎ荧光探针ꎬ并制备重组质粒建立标准曲线ꎻ对建立的多重实时荧光定量ＰＣＲ检测方法进行特异性㊁灵敏度㊁准确性验证ꎮ结果表明ꎬ本研究建立的多重实时荧光定量ＰＣＲ快速检测方法仅针对金银花炭疽病㊁白粉病和褐斑病病原菌有特异性扩增ꎻ最低检测限为２.９４ˑ１０２ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬ比普通ＰＣＲ法高１００倍ꎻ利用本方法检测１５份有叶部病害症状的金银花病叶ꎬ与ＤＮＡ测序结果完全一致ꎮ综之ꎬ本研究建立的多重实时荧光ＰＣＲ检测方法特异性强㊁灵敏度高ꎬ为金银花炭疽病㊁白粉病和褐斑病的早期诊断提供了技术支持ꎮ关键词:金银花ꎻ炭疽病ꎻ白粉病ꎻ褐斑病ꎻ多重实时荧光定量ＰＣＲ中图分类号:Ｓ４３５.１２１.４㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０７－０１４５－０７ＳｔｕｄｙｏｎＭｕｌｔｉｐｌｅｘＲｅａｌ￣ＴｉｍｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲＤｅｔｅｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｆｏｒＴｈｒｅｅＣｏｍｍｏｎＬｏｎｉｃｅｒａｊａｐｏｎｉｃａＰａｔｈｏｇｅｎｓＺｈｕＴｏｎｇｓｈａｎ１ꎬＬｉｕＹａｎｙａｎ２ꎬＴａｎＱｉｎｇｑｉｎｇ２ꎬＬｉｕＧｕｏｘｉａ２ꎬＣｈｅｎＸｕｅｙａｎ２ꎬＢｕＸｕｎ２ꎬＷａｎｇＷｅｎｂｏ３ꎬＹｕＺｉｈａｎ１ꎬ４ꎬＺｈａｎｇＱｕａｎｆａｎｇ２ꎬＺｈａｎｇＹｏｎｇｑｉｎｇ１(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙꎬＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＪｉｎａｎ２５０３５５ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｒｏｐＧｅｒｍｐｌａｓｍＲｅｓｏｕｒｃｅｓꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＱｕａｌｉｔｙＳｔａｎｄａｒｄｓａｎｄＴｅｓｔｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ４.ＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＪｉｎａｎ２５００１３ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰＣＲｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｎ￣ｔｈｒａｃｎｏｓｅ(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ)ꎬｐｏｗｄｅｒｙｍｉｌｄｅｗ(Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ)ａｎｄｂｒｏｗｎｓｐｏｔ(Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ)ｏｆＬｏｎｉｃｅｒａｊａｐｏｎｉｃａＴｈｕｎｂ.ꎬｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓａｎｄＴａｑＭａｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｂｅｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｂａｓｅｄｏｎｔｈｅＩＴＳｆｒａｇｍｅｎｔｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｒｅｅｐａｔｈｏｇｅｎｓꎬａｎｄｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｐｒｅ￣ｐａｒｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓ.Ｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙꎬｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄａｃｃｕｒａｃｙｏｆｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｔｈｒｅｅｐａｔｈｏｇｅｎｓｗｅｒｅｖｅｒｉｆｉｅｄ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰＣＲｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｏｎｌｙｈａｄｓｐｅｃｉｆｉｃａｍ￣ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｓｏｆＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓꎬＥｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａａｎｄＣｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ.Ｔｈｅｌｏｗｅｓｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｗａｓ２.９４ˑ１０２ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬｗｈｉｃｈｗａｓ１００ｔｉｍｅｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｏｒｄｉｎａｒｙＰＣＲｍｅｔｈｏｄ.ＦｉｆｔｅｅｎＬｏｎｉｃｅｒａｊａｐｏｎｉｃａｓａｍｐｌｅｓｗｉｔｈｓｙｍｐｔｏｍｓｏｆｌｅａｆｄｉｓｅａｓｅｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄꎬｗｈｉｃｈｗａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ.Ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎꎬｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｄｅ￣ｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｈａｄｈｉｇｈｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙꎬｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｄｔｅｃｈｎｉｃａｌｓｕｐｐｏｒｔｓｆｏｒｔｈｅｅａｒｌｙｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅꎬｐｏｗｄｅｒｙｍｉｌｄｅｗａｎｄｂｒｏｗｎｓｐｏｔｏｆＬｏｎｉｃｅｒａｊａｐｏｎｉｃａ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＬｏｎｉｃｅｒａｊａｐｏｎｉｃａＴｈｕｎｂ.ꎻＡｎｔｈｒａｃｎｏｓｅꎻＰｏｗｄｅｒｙｍｉｌｄｅｗꎻＢｒｏｗｎｓｐｏｔꎻＭｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ㊀㊀金银花又名忍冬花ꎬ是忍冬科植物忍冬(Ｌｏｎ￣ｉｃｅｒａｊａｐｏｎｉｃａＴｈｕｎｂ.)的干燥花蕾或带初开的花[１]ꎬ在我国分布广泛ꎮ主要有效成分为黄酮类[２]㊁环烯醚萜类[３]㊁挥发油类[４]㊁酚酸类等[５]ꎮ其在医药领域中的应用非常广泛ꎬ具有清热解毒㊁通经活络㊁消炎消肿之功效[６]ꎮ随着金银花种植年限的增长ꎬ病虫害也逐渐加重ꎬ以叶部病害和根部病害为主ꎮ其中炭疽病㊁褐斑病和白粉病是最常发生的叶部病害ꎬ褐斑病可导致叶片枯萎脱落ꎻ金银花植株感染白粉病会导致花蕾发育畸形ꎬ严重时会大量落花ꎻ炭疽病侵染茎枝时会使枝条倒伏㊁枯死ꎬ影响植株生长发育ꎬ降低花蕾的产量与品质[７]ꎮ目前对于金银花病害的检测手段较少ꎮ传统的病原菌鉴定方法通常为病原菌分离后经过柯赫氏法则结合分子生物学进行鉴定[８]ꎬ该过程耗时长ꎬ容易延误病害防治时机ꎮ做好金银花病害的早期检测㊁及时开展防治工作ꎬ有效降低化学农药施用量ꎬ对于保证金银花药材产量和质量具有重要意义ꎮ因此建立一种快速㊁准确检测金银花炭疽病㊁褐斑病及白粉病病原菌的方法ꎬ并应用于３种病害的早期防治是当务之急ꎮ前期在山东省临沂市平邑县金银花主产区发现并分离出炭疽病病原菌胶胞杆菌(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉ￣ｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ)ꎬ并验证了病原菌的致病性[９]ꎬ结合已报道的金银花主要叶部病害褐斑病病原菌鼠李尾孢(Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ)和白粉病病原菌(Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ)ꎬ基于ＩＴＳ序列分别设计了特异引物和ＴａｑＭａｎ探针ꎬ通过优化ＰＣＲ体系和反应条件建立了多重实时荧光ＰＣＲ检测体系ꎬ实现了金银花炭疽病㊁褐斑病和白粉病病原菌的快速㊁准确和高通量检测ꎬ以期为及时有效地防治金银花叶部病害提供技术支持ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料与试剂白粉病病原菌(Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ)㊁炭疽病病原菌胶孢炭疽菌(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ)㊁褐斑病病原菌鼠李尾孢(Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ)㊁白绢病病原菌(Ｓｅｌｅｒｏｔｉｕｍｒｏｌｆｓｉｉ)㊁黑曲霉(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ)㊁禾谷镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ)㊁金银花叶斑病病原菌(Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍｓｐ.)㊁木霉菌(Ｔｒｉ￣ｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ.)ꎬ保存于山东省农业科学院农作物种质资源研究所ꎻ用于验证试验的金银花病害样本采集于山东中医药大学药用植物园和山东省临沂市平邑县金银花产区ꎮ高效植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒[ＤＰ３５０ꎬ天根生化科技(北京)有限公司]ꎬＤＮＡ分子量ＭａｋｅｒＤＬ２０００[天根生化科技(北京)有限公司]ꎬ真菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒(Ａｘｙｇｅｎ)ꎬ电泳上样缓冲液[宝生物工程(大连)有限公司]ꎮ１.２㊀仪器与设备ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７Ｆｌｅｘ荧光定量ＰＣＲ仪(美国ＡＢＩ)ꎻＴａｋａｒａＰＣＲ仪[宝生物工程(大连)有限公司]ꎻＮａｎｏＤｒｏｐＬｉｔｅ超微量核酸检测仪(赛默飞世尔)ꎻ５４２４Ｄ型高速离心机(Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司)ꎻ凝胶成像仪(Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司)ꎻＵＶ３６００紫外可见分光光度计(日本岛津公司)ꎮ引物和探针序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成ꎮ使用ＱｕａｎｔＳｔｕ￣ｄｉｏＴＭＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲＳｏｆｔｗａｒｅ软件进行绘图ꎮ使用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ软件进行表格制作ꎮ６４１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀１.３㊀试验方法１.３.１㊀３种病原菌特异引物及ＴａｑＭａｎ探针设计㊀根据ＧｅｎＢａｎｋ上的鼠李尾孢菌(Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈ￣ａｍｎｉꎬＧｅｎＢａｎｋ登录号ＭＴ３３８０４２.１)㊁胶孢炭疽菌(ＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓꎬＧｅｎＢａｎｋ登录号ＭＮ８３３３３５.１)及白粉病病原菌(ＥｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａꎬＧｅｎＢａｎｋ登录号ＬＣ００９９９２.１)序列ꎬ使用Ｐｒｉｍｅｒｐｒｅｍｉｅｒ５.０软件分别设计引物对和ＴａｑＭａｎ探针ꎮ引物及探针序列见表１ꎮ㊀㊀表１㊀引物和探针序列菌株引物㊁探针名称引物㊁探针序列(５ᶄ－３ᶄ)目的片段长度(ｂｐ)胶孢炭疽菌白粉病病原菌鼠李尾孢菌Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ－ＦＡＧＴＴＴＡＣＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＣＣＴＴＴＧＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ－ＲＴＴＡＴＴＴＧＣＴＴＧＴＡＣＣＡＣＴＣＡＧＡＡＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ－ＰＲＯＸ－ＴＡＡＣＴＧＴＴＧＣＴＴＣＧＧＣＧＧＧＴＡＧＧ－ＢＨＱ２Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ－ＦＣＧＡＴＴＴＧＴＡＴＣＴＴＧＴＴＧＣＴＴＴＧＥｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ－ＲＡＡＣＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＧＴＴＡＧＧＴＣＴＥｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ－ＰＦＡＭ－ＡＴＧＴＣＧＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＣＡＡＧ－ＢＨＱ２Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ－ＦＧＡＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＧＣＡＣＡＴＴＧＣｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ－ＲＡＴＧＡＡＡＴＣＡＣＡＡＣＧＣＴＴＡＧＡＧＡＣｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ－ＰＪＯＥ－ＴＣＡＴＴＴＣＡＣＣＡＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＧ－ＢＨＱ２１６５１２４１６０㊀㊀注:探针中ＲＯＸ㊁ＦＡＭ及ＪＯＥ为３种不同荧光染料ꎻＢＨＱ２为荧光淬灭基团ꎮ１.３.２㊀多重实时荧光ＰＣＲ体系构建㊀多重实时荧光ＰＣＲ反应体系(２０μＬ):２ˑＴａｑＭａｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０μＬꎬ炭疽病病原菌上㊁下游引物和探针各１μＬꎬ白粉病病原菌上㊁下游引物和探针各１μＬꎬ褐斑病病原菌上㊁下游引物和探针各１μＬꎬＤＮＡ模板１μＬꎮ褐斑病引物和探针的终浓度分别为０.５０μｍｏｌ/Ｌ和０.４０μｍｏｌ/Ｌꎬ白粉病引物和探针的终浓度为０.５０μｍｏｌ/Ｌ和０.４０μｍｏｌ/Ｌꎬ炭疽病病原菌引物和探针的终浓度为０.２５μｍｏｌ/Ｌ和０.１０μｍｏｌ/Ｌꎮ多重实时荧光ＰＣＲ扩增条件:９５ħ２ｍｉｎꎻ９５ħ１０ｓꎬ６０ħ３５ｓ(在此阶段收集荧光信号)ꎬ４０个循环ꎮ１.３.３㊀重组质粒的构建㊀使用１.３.１中金银花褐斑病㊁白粉病及炭疽病病原菌特异引物进行基因扩增ꎬ参考李敏[１０]的方法进行重组质粒构建ꎬ对重组质粒ＰＣＲ产物进行测序ꎬ验证是否正确插入目的片段ꎮＤＮＡ测序在山东省农业科学院农作物种质资源研究所进行ꎮ１.３.４㊀实时荧光ＰＣＲ标准曲线建立㊀使用ＵＶ３６００紫外分光光度计测定３种病原菌阳性重组质粒ＤＮＡ浓度ꎬ将重组质粒ＤＮＡ定量至２.９４ˑ１０８ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬ按照１０倍梯度稀释成６个浓度ꎬ每个梯度３次重复ꎮ反应体系与程序按照１.３.２进行ꎮ根据重组质粒拷贝数初始量值和阈值循环数(Ｃｔ)进行多重实时荧光ＰＣＲ体系标准曲线的构建ꎮ１.３.５㊀引物和探针特异性检测㊀分别以胶孢炭疽菌㊁鼠李尾孢菌㊁白粉病病原菌㊁白绢病病原菌㊁木霉菌㊁禾谷镰刀菌㊁金银花叶斑病病原菌㊁黑曲霉的基因组ＤＮＡ为模板ꎬ按１.３.２中多重实时荧光ＰＣＲ反应条件及反应体系进行检测ꎬ每个样本３次重复ꎬ验证引物和探针的特异性ꎮ１.３.６㊀多重实时荧光ＰＣＲ方法灵敏度验证㊀将重组质粒ＤＮＡ定量至２.９４ˑ１０８ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬ按照１０倍梯度依次稀释８个浓度ꎬ每个浓度重复３次ꎬ根据荧光信号值大小ꎬ评价相应引物和探针对３种病原菌的检测灵敏度ꎮ同时以此ＤＮＡ模板和表１中特异引物进行普通ＰＣＲ扩增ꎬ每个浓度重复２次ꎮ普通ＰＣＲ扩增体系:１０ˑｂｕｆｆｅｒ２.５μＬ㊁ｄＮＴＰ(２.５ｍｍｏｌ/Ｌ)２.０μＬ㊁Ｔａｑ酶(５Ｕ)０.２μＬ㊁上下游引物(１０μｍｏｌ/Ｌ)各１.０μＬ㊁ＤＮＡ模板(１~１０ｎｇ/μＬ)２.０μＬꎬｄｄＨ２Ｏ１６.３μＬꎻ扩增程序:９５ħ３ｍｉｎꎻ９５ħ３０ｓꎬ５６ħ３０ｓꎬ７２ħ３０ｓꎬ３０个循环ꎻ７２ħ１０ｍｉｎꎮ１.３.７㊀验证试验㊀利用本研究建立的３种病原菌多重实时荧光ＰＣＲ检测方法对从临沂市平邑县金银花产区㊁山东中医药大学药用植物园采集的１５份叶部病害样本进行检测ꎬ同时提取样本ＤＮＡ㊁使用真菌通用引物ＩＴＳ１:５ᶄ－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴ￣ＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３ᶄꎬＩＴＳ４:５ᶄ－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴ￣ＧＡＴＡＴＧＣ－３ᶄ进行ＰＣＲ扩增ꎬ切胶回收并测序ꎮ将两种检测方法的结果进行比较ꎬ以验证本研究所建立的多重实时荧光ＰＣＲ方法的准确性与可行性ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀实时荧光ＰＣＲ标准曲线建立以重组质粒拷贝数初始量值为横坐标ꎬＣｔ值为纵坐标ꎬ得到褐斑病线性回归方程为ｙ＝－３.２９６ｘ＋４０.２３４ꎬＲ２＝０.９９８ꎻ白粉病线性回归方程为ｙ＝－３.３７４ｘ＋４０.３７４ꎬＲ２＝０.９９６ꎻ炭疽病线性回７４１㊀第７期㊀㊀㊀㊀朱桐杉ꎬ等:３种常见金银花致病菌多重实时荧光定量ＰＣＲ检测方法研究归方程为ｙ＝－３.４７０ｘ＋４３.０９２ꎬＲ２＝０.９９６(图１)ꎮ３种病原菌实时荧光ＰＣＲ标准曲线相关系数均大于０.９９ꎬ扩增效率均接近１００％ꎬ标准曲线横纵坐标间形成良好线性关系ꎬ表明该方法具有效性ꎮＡ:褐斑病病原菌标准曲线图ꎻＢ:白粉病病原菌标准曲线图ꎻＣ:炭疽病病原菌标准曲线图ꎮ图１㊀３种病原菌实时荧光ＰＣＲ标准曲线图２.２㊀引物和探针特异性验证按照１.３.５方法进行特异性验证ꎬ当ＲＯＸ荧光修饰探针有扩增曲线且满足Ｃｔɤ３５时ꎬ说明待检样本检出炭疽病病原菌ꎻ当ＦＡＭ荧光修饰探针有扩增曲线且满足Ｃｔɤ３５时ꎬ说明待检样本检出白粉病病原菌ꎻ当ＪＯＥ荧光修饰探针有扩增曲线且满足Ｃｔɤ３５时ꎬ说明待检样本检出褐斑病病原菌ꎻ当ＦＡＭ㊁ＪＯＥ和ＲＯＸ荧光修饰探针均无扩增曲线时ꎬ表明该检测样品为阴性ꎮ由表２可知ꎬ本试验建立的多重实时荧光定量ＰＣＲ方法只能特异扩增目的病原菌ꎬ对其他病原菌均无扩增ꎬ说明本研究建立的多重实时荧光定量ＰＣＲ体系的引物及探针的特异性良好ꎮ㊀㊀表２㊀引物及探针特异性验证试验病原名称炭疽病病原探针(ＲＯＸ)Ｃｔ值白粉病病原探针(ＦＡＭ)Ｃｔ值褐斑病病原探针(ＪＯＥ)Ｃｔ值结果判定炭疽病病原菌１６.２５ʃ０.１４ＮＮ炭疽病病原菌阳性白绢病病原菌ＮＮＮＮ褐斑病病原菌ＮＮ１５.８７ʃ０.４５褐斑病病原菌阳性木霉菌ＮＮＮＮ禾谷镰刀菌ＮＮＮＮ金银花叶斑病病原菌ＮＮＮＮ白粉病病原菌Ｎ１４.２５ʃ０.０４Ｎ白粉病病原菌阳性黑曲霉ＮＮＮＮ㊀㊀注: Ｎ 表示阴性ꎮ２.３㊀检测灵敏度多重实时荧光定量ＰＣＲ检测方法和普通ＰＣＲ法对金银花褐斑病㊁白粉病和炭疽病３种病原菌灵敏度验证结果见图２Ａ㊁Ｂ㊁Ｃꎮ３组重组质粒在浓度２９.４ｃｏｐｉｅｓ/μＬ时ꎬＣｔ值>３５ꎬ因此多重实时荧光定量ＰＣＲ法对３种病原菌检测最低检８４１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀测限为２.９４ˑ１０２ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎻ在普通ＰＣＲ扩增中ꎬ当模板ＤＮＡ浓度为２.９４ˑ１０４ｃｏｐｉｅｓ/μＬ时有明显扩增条带ꎬ低于此浓度则无扩增条带ꎬ因此普通ＰＣＲ法检测灵敏度为２.９４ˑ１０４ｃｏｐｉｅｓ/μＬ(图２Ｄ)ꎮ结果表明ꎬ本试验建立的多重实时荧光ＰＣＲ检测方法的灵敏度比普通ＰＣＲ法高１００倍ꎮ２.４㊀验证试验分别使用本试验建立的检测方法和ＤＮＡ测序法对实际样本进行检测ꎬ多重实时荧光定量ＰＣＲ结果检测出炭疽病病原菌阳性样本４份㊁白粉病阳性样本５份㊁褐斑病阳性样本６份ꎬ检出率为１００％ꎬ与ＤＮＡ测序结果完全一致(表３)ꎮ㊀㊀表３㊀实际样本检测结果样品编号ＤＮＡ测序结果中文名称多重实时荧光ＰＣＲ结果１Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ胶孢炭疽菌炭疽病病原菌阳性２Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ胶孢炭疽菌炭疽病病原菌阳性３Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ胶孢炭疽菌炭疽病病原菌阳性４Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ胶孢炭疽菌炭疽病病原菌阳性５Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ白粉病病原菌白粉病病原菌阳性６Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ白粉病病原菌白粉病病原菌阳性７Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ鼠李尾孢褐斑病病原菌阳性８Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ白粉病病原菌白粉病病原菌阳性９Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ鼠李尾孢褐斑病病原菌阳性１０Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ鼠李尾孢褐斑病病原菌阳性１１Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ鼠李尾孢褐斑病病原菌阳性１２Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ白粉病病原菌白粉病病原菌阳性１３Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ白粉病病原菌白粉病病原菌阳性１４Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ鼠李尾孢褐斑病病原菌阳性１５Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ鼠李尾孢褐斑病病原菌阳性９４１㊀第７期㊀㊀㊀㊀朱桐杉ꎬ等:３种常见金银花致病菌多重实时荧光定量ＰＣＲ检测方法研究Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ分别为褐斑病㊁白粉病㊁炭疽病灵敏度检测图ꎻ图Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ中１~８质粒浓度分别为２.９４ˑ１０８㊁２.９４ˑ１０７㊁２.９４ˑ１０６㊁２.９４ˑ１０５㊁２.９４ˑ１０４㊁２.９４ˑ１０３㊁２.９４ˑ１０２㊁２９.４ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎻ图Ｄ中孔１~６所用质粒浓度分别为２.９４ˑ１０８㊁２.９４ˑ１０７㊁２.９４ˑ１０６㊁２.９４ˑ１０５㊁２.９４ˑ１０４㊁２.９４ˑ１０３ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬ７为阴性对照ꎬＭ为ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒꎮ图２㊀３种病原菌多重实时荧光定量ＰＣＲ(Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ)和常规ＰＣＲ(Ｄ)扩增体系灵敏度３㊀讨论与结论金银花为山东道地药材之首ꎬ主产于山东省临沂市平邑县ꎮ以花入药ꎬ药用历史悠久ꎮ性味甘寒ꎬ气味芳香ꎬ有清透疏表㊁清热解毒之效ꎮ亦可食用ꎬ具有一定的保健功能ꎬ老少皆宜ꎮ传统植物病原菌通常使用组织分离法结合ＤＮＡ测序法进行鉴定ꎬ如紫薯腐败菌的分离和鉴定[１１]㊁马铃薯赤霉病病原菌的分离和鉴定[１２]等ꎬ耗费时间较长ꎮ实时荧光定量ＰＣＲ法可实现数个样品的自动化检测ꎬ成本低ꎬ较普通ＰＣＲ技术所用时间短ꎬ能在病害初期进行快速检测[１３]ꎮ目前已经建立了柑橘枯萎病病毒[１４]㊁橄榄果实中敏感炭疽菌[１５]等实时荧光定量ＰＣＲ检测方法ꎮ褐斑病㊁白粉病及炭疽病是常见的３种金银花叶部病害ꎬ也是导致金银花减产㊁降质的重要原因ꎮ感染白粉病时ꎬ叶部绿原酸含量降低[１６]ꎻ褐斑病㊁炭疽病发病后期ꎬ斑点融合导致叶片呈现圆形或不规则病斑ꎬ严重时会导致全株叶片脱落㊁植株枯死[１７ꎬ１８]ꎬ且病害后期致病菌可停留在土壤及病残体中越冬ꎮ李志红等[１９]对封丘金银花炭疽病染病植株叶片进行分离和检测ꎬ得到炭疽病病原菌为胶孢炭疽菌(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉ￣ｏｉｄｅｓ)ꎻ研究表明金银花褐斑病病原菌为半知菌亚门鼠李尾孢(Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｒｈａｍｎｉ)㊁金银花白粉病病原菌为Ｅｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａ[２０ꎬ２１]ꎮ目前对３种金银花病害的研究还停留在发病症状调查和病原菌分离鉴定阶段ꎬ防治措施是在叶部出现明显症状后进行喷洒农药或剪去带病枝条[２２ꎬ２３]ꎬ而针对３种病害的分子检测方法还未见报道ꎮ实时荧光定量ＰＣＲ技术具有操作简便㊁快速高效㊁高通量㊁高敏感性等特点ꎬ在分子诊断㊁动植物检疫以及食品安全检测等方面有广泛应用ꎬ提高了检测时效性和灵敏度ꎮ多重实时荧光定量ＰＣＲ方法可在同一个检测体系中对多个目标序列同时进行检测ꎬ且能精确定量ꎮ如利用实时荧光逆转录定量ＰＣＲ技术快速检测香蕉的枯萎芽孢杆菌[２４]㊁菊花的花叶白锈菌及褐锈菌[２５]㊁马铃薯中常见疮痂病及病原菌[２６]以及检测羊奶中牛奶和大豆源性成分[２７]ꎮ本研究基于ＩＴＳ序列设计引物与ＴａｑＭａｎ探针ꎬ建立了可同时检测金银花褐斑病㊁白粉病及炭０５１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀疽病３种病害病原菌的多重实时荧光ＰＣＲ检测体系ꎬ该方法最低检测限度为２.９４ˑ１０２ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬ比普通ＰＣＲ方法提高１００倍ꎬ特异性强ꎬ可为金银花叶部病害早诊断㊁早防治提供技术支持ꎬ弥补了金银花炭疽病㊁褐斑病及白粉病病害检测方法的缺失ꎮ但本试验未曾对多种病害同时检测进行实际样本验证ꎬ对于病原菌的鉴定停留在定性层面而未进行定量计算ꎬ因此关于多种病原菌的同时检测及其定量分析是下一步研究重点ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀国家药典委员会.中华人民共和国药典[Ｍ].北京:中药医药科技出版社ꎬ２０２０.[２]㊀ＷｕＪꎬＷａｎｇＸＣꎬＬｉｕＹꎬｅｔａｌ.ＦｌａｖｏｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｓｆｒｏｍＬｏｎｉｃｅ￣ｒａｊａｐｏｎｉｃａａｎｄＬ.ｍａｃｒａｎｔｈｏｉｄｅｓｒｅｖｅａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｆｌａｖｏｎｅａｃ￣ｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｓｃｉ.Ｒｅｐ.ꎬ２０１６ꎬ６:１９２４５.[３]㊀ＧｏłｂａＭꎬＳｏｋół￣ŁęｔｏｗｓｋａＡꎬＫｕｃｈａｒｓｋａＡＺ.Ｈｅａｌｔｈｐｒｏｐｅｒ￣ｔｉｅｓａｎｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｈｏｎｅｙｓｕｃｋｌｅｂｅｒｒｙＬｏｎｉｃｅｒａｃａｅｒｕｌｅａＬ.ａｎｕｐｄａｔｅｏｎｒｅｃｅｎｔｓｔｕｄｉｅｓ[Ｊ].Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２０２０ꎬ２５(３):７４９. [４]㊀ＴａｎｇＸＰꎬＬｉｕＸＧꎬＺｈｏｎｇＪＦꎬｅｔａｌ.ＰｏｔｅｎｔｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＬｏｎｉｃｅｒａｊａｐｏｎｉｃａｅｘｔｒａｃｔｓｉｎａｎｉｍａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ:ｆｒｏｍｔｈｅｐｅｒ￣ｓｐｅｃｔｉｖｅｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｈｅａｌｔｈ[Ｊ].Ｆｒｏｎｔ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.ꎬ２０２１ꎬ１２:７１９８７７.[５]㊀ＢｉＺＨꎬＺｈａｏＹꎬＨｕＪＨꎬｅｔａｌ.ＡｎｏｖｅｌｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＬｏｎｉｃｅｒａｅｊａｐｏｎｉｃａｅＣａｕｌｉｓ:ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ￣ｌｉｋｅｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ[Ｊ].ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＰｏｌｙ￣ｍｅｒｓꎬ２０２２ꎬ２９２:１１９６７４.[６]㊀熊乐文ꎬ金莹ꎬ黄玮慕ꎬ等.金银花色泽与酚酸类成分含量相关性研究[Ｊ].中成药ꎬ２０２２ꎬ４４(８):２７３６－２７３９. [７]㊀杨帆ꎬ刘玉霞ꎬ李炯ꎬ等.忍冬枝枯病对忍冬药材产量和质量的影响[Ｊ].中国实验方剂学杂志ꎬ２０１８ꎬ２４(２０):３２－３７. [８]㊀ＺｈａｎｇＬꎬＬｉＸＨꎬＺｈｏｕＹＹꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃ￣ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｓｐｅｃｉｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＣａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅｉｎＡｎｈｕｉＰｒｏｖｉｎｃｅꎬＣｈｉｎａ[Ｊ].ＰｌａｎｔＤｉｓ.ꎬ２０２１ꎬ１０５(９):２６４９－２６５７.[９]㊀朱桐杉ꎬ谭晴晴ꎬ刘国霞ꎬ等.金银花炭疽病病原菌的分离鉴定和ｑＰＣＲ检测[Ｊ].中药材ꎬ２０２２ꎬ４５(１１):２５５６－２５６１. [１０]李敏.北柴胡成花基因克隆及时空表达模式分析[Ｄ].济南:山东中医药大学ꎬ２０２１.[１１]刘绪ꎬ郑运ꎬ黄潇漪ꎬ等.紫薯腐败菌的分离与鉴定[Ｊ].食品安全质量检测学报ꎬ２０２２ꎬ１３(１６):５２９７－５３０４. [１２]ＤｕａｎＹＨꎬＱｕＷＷꎬＣｈａｎｇＳＸꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐａｔｈ￣ｏｇｅｎｉｃｉｔｙｇｒｏｕｐｓａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.ｓｅｓａｍｉｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏ￣ｇｙꎬ２０２０ꎬ１１０(５):１０９３－１１０４.[１３]ＭｃＣａｒｔｎｅｙＨＡꎬＦｏｓｔｅｒＳＪꎬＦｒａａｉｊｅＢＡꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｉ￣ａｇｎｏｓｔｉｃｓｆｏｒｆｕｎｇａｌｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｓ[Ｊ].ＰｅｓｔＭａｎａｇ.Ｓｃｉ.ꎬ２００３ꎬ５９(２):１２９－１４２.[１４]ＳａｐｏｎａｒｉＭꎬＺｉｃｃａＳꎬＬｏｃｏｎｓｏｌｅＧꎬｅｔａｌ.ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣｉｔｒｕｓｔｒｉｓｔｅｚａｖｉｒｕｓａｎｄｃｏｉｎｆｅｃｔｉｎｇｖｉｒｏｉｄｓ[Ｊ].ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ.Ｂｉｏｌ.ꎬ２０１９ꎬ２０１５:６７－７８.[１５]Ａｚｅｖｅｄｏ￣ＮｏｇｕｅｉｒａＦꎬＧｏｍｅｓＳꎬＬｉｎｏＡꎬｅｔａｌ.Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍａｃｕｔａｔｕｍｓｅｎｓｕｓｔｒｉｃｔｏｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｏｌｉｖｅｆｒｕｉｔｓａｍｐｌｅｓ[Ｊ].ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０２１ꎬ３３９:１２７８５８. [１６]陈美兰ꎬ刘红彦ꎬ李琴ꎬ等.白粉病发生程度对金银花药材中绿原酸含量的影响[Ｊ].中国中药杂志ꎬ２００６(１０):８４６－８４７.[１７]赵健飞ꎬ樊博.药用植物金银花病虫害的发生及综合防治技术[Ｊ].河南农业ꎬ２０１０(１６):４９－５０.[１８]付嵘.金银花炭疽病的初步研究[Ｄ].雅安:四川农业大学ꎬ２０１２.[１９]李志红ꎬ翟凤艳ꎬ张永霞ꎬ等.封丘金银花炭疽病病原的分离和鉴定[Ｊ].河南科技学院学报(自然科学版)ꎬ２０１９ꎬ４７(２):２０－２３.[２０]ＢｒａｄｓｈａｗＭꎬＢｒａｕｎＵꎬＧöｔｚＭꎬｅｔａｌ.Ｔａｘｏｎｏｍｙａｎｄｐｈｙｌｏｇｅ￣ｎｙｏｆｔｈｅＥｒｙｓｉｐｈｅｌｏｎｉｃｅｒａｅｃｏｍｐｌｅｘ(ＨｅｌｏｔｉａｌｅｓꎬＥｒｙｓｉｐｈａｃｅ￣ａｅ)ｏｎＬｏｎｉｃｅｒａｓｐｐ.[Ｊ].ＦｕｎｇａｌＳｙｓｔ.Ｅｖｏｌ.ꎬ２０２１ꎬ７:４９－６５. [２１]王馨.药用植物金银花常见病虫种类及防治方法[Ｊ].农技服务ꎬ２０１４ꎬ３１(２):７７.[２２]王瑞娟ꎬ张立秋.金银花的主要病虫害及其防治[Ｊ].河北林业科技ꎬ２００６(５):６６－６７.[２３]欧善生ꎬ苏桂花ꎬ谢恩倍ꎬ等.金银花主要病虫害综合防治研究[Ｊ].广东农业科学ꎬ２０１１ꎬ３８(５):９０－９４.[２４]ＬｉＳꎬＨｅＰꎬＦａｎＨＣꎬｅｔａｌ.Ａｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｇｅ￣ｎｅｔｉｃｍａｒｋｅｒｓᶄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＦｕｓａｒｉｕｍｗｉｌｔｏｆｂａ￣ｎａｎａｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎＢａｃｉｌｌｕｓ[Ｊ].Ｊ.Ｆｕｎｇｉ(Ｂａｓｅｌ)ꎬ２０２１ꎬ７(５):３５３.[２５]ＤｅｍｅｒｓＪＥꎬＣｒｏｕｃｈＪＡꎬＣａｓｔｌｅｂｕｒｙＬＡ.Ａｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＰｕｃｃｉｎｉａｈｏｒｉａｎａａｎｄＰ.ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉｏｎｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ[Ｊ].ＰｌａｎｔＤｉｓ.ꎬ２０１５ꎬ９９(２):１９５－２００.[２６]ＱｕＸＳꎬＷａｎｎｅｒＬＡꎬＣｈｒｉｓｔＢＪ.Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ(ＴａｑＭａｎ)ａｓｓａｙｆｏｒｔｈｅｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｓｃｒｉｍｉｎａ￣ｔｉｏｎｏｆｐｏｔａｔｏｐｏｗｄｅｒｙａｎｄｃｏｍｍｏｎｓｃａｂｄｉｓｅａｓｅｓａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｓ[Ｊ].Ｊ.Ａｐｐｌ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.ꎬ２０１１ꎬ１１０(３):７６９－７７７. [２７]范阳阳ꎬ张荦嘉ꎬ刘艳艳ꎬ等.一种从羊奶中检测牛奶和大豆成分多重实时荧光定量ＰＣＲ方法的建立[Ｊ].山东农业科学ꎬ２０１６ꎬ４８(６):１１８－１２３.１５１㊀第７期㊀㊀㊀㊀朱桐杉ꎬ等:３种常见金银花致病菌多重实时荧光定量ＰＣＲ检测方法研究。
5种化学药剂对梨黑斑病菌的室内防治研究作者：李洪坤王芳芳于占晶侯晓杰梁魁景来源：《果树资源学报》2023年第06期收稿日期：2023-07-10中文收稿日期基金项目：衡水市科技计划资助项目（2022014026Z）；河北省现代农业产业技术体系梨产业创新团队建设衡水综合试验推广站（HBCT2021210402）;河北省高等学校科学技术研究项目（ZC2023143）。
第一作者简介：李洪坤（1986-），男，本科，助理实验师，主要从事园林植物病虫害防治等研究工作。
*通信作者：于占晶（1984-），女，农学硕士，讲师，主要从事植物病虫害研究工作。
E-mail：*******************摘要：【目的】梨树的病虫害严重影响着梨产业的发展，由链格孢真菌侵染引起的梨黑斑病是侵染梨树的主要病害之一，为筛选出预防和治疗梨黑斑病的高效化学药剂，开展了5种化学药剂对梨黑斑病菌的室内防效试验。
【方法】从常用的药剂中挑选10%中生·寡糖素、1.26%辛菌胺醋酸盐、15%络氨铜、20%吡唑醚菌酯和60%多菌灵5种化学药剂，采用体外接种法对梨黑斑病进行室内防治效果研究。
【结果】5种化学药剂对梨黑斑病的生长都有一定的防治作用，但预防和治疗的效果不同。
其中预防效果最好的是20%吡唑醚菌酯，在浓度为1 000 mg/L时，其病斑平均直径为0.12 mm，防效达到94.8%，EC50为3.312 01 mg/L；其次为1.26%辛菌胺醋酸盐、15%络氨铜和60%多菌灵，在浓度1 000 mg/L時，防效分别为90.1%、69.1%和60.1%；预防作用最差的是10%中生·寡糖素，在浓度62.5 mg/L时，其病斑平均直径为1.67 mm，防效仅为28.3%，EC50为334.470 mg/L。
治疗效果最好的为20%吡唑醚菌酯，在浓度1 000 mg/L时，其菌落生长量平均直径为0.27 mm，抑制率达到了77.5%；最差的是60%多菌灵，在浓度62.5 mg/L时，抑制率为-6.7%。
实时荧光定量PCR快速检测四种蛀果性害虫王凤军;刘莎莎;冯俊丽【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2015(000)002【摘要】Laspeyresia pomonella, Euzophera pyriella Yang, Grapholitha molesta and Blank cutworm are important pets of fragrant pears and other fruits in Xinjiang, and they are also internationally important pests on inspection and quarantine. However, the identification relies mainly on morphological characters up to date. The lack of molecular detection methods greatly limits the international export trading of fragrant pears and related products. The 16S rDNA COI fragments from the four pests were cloned and sequenced. Then, specific primers and probes were designed according to the sequencing data, and the fluorescence Real-time quantification PCR detection system was established. The results demonstrates the limits of detection concentration of Laspeyresia pomonella, Euzophera pyriella Yang, Grapholitha molesta and Blank cutworm in this system are respectively 1.605×10-2,0.729×10-2,0.475×10-2 and 0.818×10-2 ng/μL, meeting the deman d of inspection and quarantine routine testing. To overcome the residual bodies of some insects and some pieces mixed samples, or several insects together mixed samples appeared in actual testing process, DNA extracted from single, multiple and mixed pest samples were detected and evaluated, furtherverifying the specificity of this method, the reliability and applicability.%苹果蠹蛾、香梨优斑螟、梨小食心虫及地老虎是危害新疆香梨等产品的重要害虫，前3种也属于国际上检验检疫重要虫害。
梨园气溶胶中梨火疫病菌的定量检测作者：荆琚王杰花韩丽丽陈卫民吴品珊雷荣来源：《植物保护》2023年第06期关键词：梨园；气溶胶；梨火疫病菌；定量检测解淀粉欧文氏菌Erwinia arnylouora被列为我国重大检疫性细菌，其引起的梨火疫病于2015年6月首次在新疆伊犁地区霍城县发现并暴发流行，现已蔓延至新疆14个地州（市），严重危害梨、苹果、山楂、海棠、榀椁等果树，尤其在库尔勒香梨上传播极为迅速，给新疆乃至全国林果产业带来严重威胁。
2017年，苹果在中国的种植面积约222万hm2，产量382万t；梨种植面积约107万hm2，产量1289万t，种植面积和产量均为世界第一。
我国梨每年的出口值超过2亿美元，是世界上最大的梨出口国之一，也是我国农业重要的经济来源之一。
因此，梨火疫病害一旦传播至国内其他省份，将造成巨大损失。
细菌、真菌、病毒、噬菌体等微生物可附着在气溶胶包含的固体或液体颗粒上，以独立个体或聚集体的形式在空气中扩散，造成病原微生物的长距离传播和入侵。
迄今，大部分研究认为梨火疫病菌主要通过伤口、自然孔口和花侵入寄主，进而侵染韧皮部组织、花丝及柱头，引起组织发病，而通过在种植苹果的模拟苗圃中研究风雨形成的气溶胶在梨火疫病传播流行中的作用，发现大多数疫情都与流行之前发生的风暴有关。
梨火疫病菌在相对湿度为40%～90%的空气粒子中可存活较长时间。
目前自然条件下国内梨园气溶胶携带梨火疫病菌情况未见报道。
因此，本研究于2019年-2021年收集了新疆库尔勒市人和农场‘香梨’园中的气溶胶，对其中可能携带的梨火疫病菌进行检测，为掌握梨火疫病的传播途径提供技术依据，对库尔勒香梨产业的可持续发展具有理论和实践意义。
1材料与方法1.1试验材料1.1.1梨园基本概况试验地位于新疆巴州库尔勒人和农场，共12个梨园，经纬度：41°40'N～41°49'N，85°59'E～85°47'E，海拔：907.5～928m，株行距：3m×5m，每个梨园面积0.67hm2，共计8.04 hm2。
3种常见金银花致病菌多重实时荧光定量PCR检测方法研究
作者：朱桐杉刘艳艳谭晴晴刘国霞陈雪燕步讯王文博于子涵张全芳张永清
来源：《山东农业科学》2023年第07期
摘要：為了建立可同时检测炭疽病病原菌、白粉病病原菌和褐斑病病原菌3种金银花重要叶部病原菌的多重实时荧光定量PCR快速检测方法，本试验基于3种病原菌ITS片段序列分别设计特异引物和Taq Man荧光探针，并制备重组质粒建立标准曲线；对建立的多重实时荧光定量PCR检测方法进行特异性、灵敏度、准确性验证。
结果表明，本研究建立的多重实时荧光定量PCR快速检测方法仅针对金银花炭疽病、白粉病和褐斑病病原菌有特异性扩增；最低检测限为2.94x102 copies/uL，比普通PCR法高100倍；利用本方法检测15份有叶部病害症状
的金银花病叶，与DNA测序结果完全一致。
综之，本研究建立的多重实时荧光PCR检测方法特异性强、灵敏度高，为金银花炭疽病、白粉病和褐斑病的早期诊断提供了技术支持。
关键词：金银花；炭疽病；白粉病；褐斑病；多重实时荧光定量PCR
中图分类号：S435.121.4 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2023）07-0145-07。
第46卷第6期2023年11月河北农业大学学报JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITYVol.46 No.6Nov.2023基于TaqMan探针的实时荧光LAMP 检测肉制品中鸭源性成分研究柳梦思1，时国强1，高娜婷1，焦义然1，孙旭飞2，孟亚南3，董振国1（1．河北三狮生物科技有限公司，河北 石家庄 050035；2．河北农业大学 食品科技学院，河北 保定 071000；3．河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071000）摘要：本研究建立1种基于TaqMan探针的实时荧光环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）（TaqMan—LAMP）检测方法，用于肉制品中鸭源性成分的快速鉴别。
以鸭线粒体cytb基因的保守序列设计特异性引物，优化并建立基于TaqMan探针的实时荧光LAMP检测方法，对该方法进行特异性、灵敏度试验；同时与《GB/T38164—2019常见畜禽动物源成分检测方法实时荧光PCR法》作比较，对市售肉制品进行检测，验证本方法的准确性。
所建立的TaqMan-LAMP检测方法特异性强，仅鸭肉基因组DNA呈现特异性扩增曲线，30 min内完成检测，灵敏度为0.001%（w/w），重复性好，批次内变异系数CV为1.99%，对47份肉制品进行检测，检测结果与国标法相比，相对敏感性、特异性和符合率均为100%。
本研究建立的鸭源性成分TaqMan-LAMP检测方法检测快速、特异性强、灵敏度高、重复性好，适用于肉制品中鸭源性成分的快速检测。
关 键 词：环介导等温扩增；TaqMan-LAMP；鸭源性成分；检测中图分类号：S152开放科学（资源服务）标识码（OSID）：文献标志码：AStudy on detection of duck-derived ingredients in meat products by real-time fluorescent LAMP based on TaqMan probeLIU Mengsi1, SHI Guoqiang1, GAO Nating1, JIAO Yiran1, SUN Xufei2, MENG Yanan3, DONG Zhenguo1(1. Hebei sanshibio-tech co.,ltd, Shijiazhuang 050035, China;2. College of Food Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071000, China;3. College of Life Sciences, Hebei Agricultural University, Baoding 071000, China)Abstract: In this study, a real-time Loop-mediated isothermal amplification assay based on TaqMan probe(TaqMan-LAMP) was developed for the rapid identification of duck-derived components in meat products.Cytbwas used as the target gene to design specific primers followed by establishment and optimization of a real-timefluorescent LAMP detection method whose specificity and sensitivity was then tested and compared with GB/T38164-2019 real-time fluorescence PCR method on the commercial meat products. Only the genomic DNA ofduck meat showed a specific amplification curve within 30 min with a sensitivity of 0.001% (w/w), suggesting thehigh specificity of the TagMan-LAMP repeatability of the method was high, and the coefficient of variation (CV )收稿日期：2023-09-23基金项目： 国家自然科学基金项目（32172288）；石家庄市科技孵化计划项目（211510109A）.第一作者：柳梦思（1989—），硕士，从事合成化学在分子生物学中的应用等研究.E-mail：********************通信作者：孟亚南（1992—），博士，副教授，从事微生物核酸快速检测等研究.E-mail：*******************文章编号：1000-1573(2023)06-0089-06DOI：10.13320/ki.jauh.2023.009790第46卷河北农业大学学报in batches was 1.99%. The detection results of 47 meat products were compared with the national standard method, and the relative sensitivity, specificity and coincidence rate were 100%.The TaqMan-LAMP detection method established in this study is rapid with strong specificity, high sensitivity and good reproducibility. Thus, the Tag-LAMP method is is suitable for rapid detection of duck-derived components in meat products.Keywords: Loop-mediated isothermal amplification, TaqMan -LAMP, duck-derived ingredients, detection法GB/T 38164-2019［25］进行验证。
欧阳辉ꎬ张伟达ꎬ程少波ꎬ等.库尔勒香梨黑头病病原菌的分离鉴定[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０１９ꎬ４７(１４):１１６－１１９.ｄｏｉ:１０.１５８８９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００２－１３０２.２０１９.１４.０２６库尔勒香梨黑头病病原菌的分离鉴定欧阳辉ꎬ张伟达ꎬ程少波ꎬ陈国刚ꎬ江㊀英(石河子大学食品学院ꎬ新疆石河子８３２０００)㊀㊀摘要:为了分离㊁鉴定库尔勒香梨黑头病病原菌ꎬ并结合形态学和分子生物学等手段对致病菌进行鉴定ꎬ采用马铃薯葡萄糖琼脂平板法对致病菌株进行分离纯化ꎬ观察病原菌株的菌落特征ꎬ通过显微镜观察病原孢子形态特征ꎬ并根据回接试验确定其致病性能ꎮ结果表明ꎬ从病梨萼端表面及香梨生长环境中共分离出１１株菌株ꎬ综合病原菌菌落形态㊁孢子显微结构及回接试验ꎬ筛选出２株候选菌株(ＳＹ－６㊁ＸＬ－６)ꎬ其回接香梨的病症与正常发病的香梨较相似ꎮ通过十六烷基三甲基溴化铵(ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅꎬ简称ＣＴＡＢ)法提取病原菌ＤＮＡꎬ经ｒＤＮＡ内转录间隔区(ＩＴＳ－ｒＤＮＡ)基因片段测序及美国国立生物技术信息中心(ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎꎬ简称ＮＣＢＩ)网站的同源性比对ꎬ鉴定得出ＳＹ－６㊁ＸＬ－６均属于链格孢属ꎮ结果共分离出２株链格孢属病原菌ꎬ致病症状与自然发病的香梨较相似ꎬ结果与笔者所在课题组的前期研究结果相吻合ꎬ从而为研究病原菌致病机制提供了参考ꎮ㊀㊀关键词:库尔勒香梨ꎻ黑头病ꎻ致病菌ꎻ鉴定㊀㊀中图分类号:Ｓ４３６.６１２.１＋９㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀文章编号:１００２－１３０２(２０１９)１４－０１１６－０４收稿日期:２０１８－０３－２０基金项目:国家自然科学基金(编号:３１５６０４６８)ꎮ作者简介:欧阳辉(１９９２ )ꎬ男ꎬ安徽六安人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事农产品加工贮藏方面的研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:２９６３９９９０３＠ｑｑ.ｃｏｍꎮ通信作者:陈国刚ꎬ博士ꎬ教授ꎬ主要从事农产品加工贮藏方面的研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:Ｃｇｇ６１１＠１６３.ｃｏｍꎮ㊀㊀库尔勒香梨是新疆地区最主要的特色果品之一ꎬ由于其皮薄汁丰㊁品质优良而享誉全国ꎮ新疆得天独厚的地理优势和气候条件造就了库尔勒香梨独特的口感和品质ꎬ库尔勒香梨果实大小适中ꎬ形如纺锤ꎬ果皮黄绿ꎬ果味浓芬ꎬ果肉酥脆爽口ꎬ清甜多汁ꎬ其含糖量约为１０％ꎬ含水量约为８６％ꎬ同时富含多种维生素[１]ꎮ库尔勒香梨不但具有很高的食用价值ꎬ还有润肺㊁凉心㊁消疾㊁驱毒㊁切片贴烫火伤止痛不烂等药用功效ꎬ深受广大消费者青睐ꎮ近年来ꎬ新疆香梨的种植面积及贮藏容量在逐年增加ꎮ据统计ꎬ截至２０１６年ꎬ新疆香梨种植面积达７万ｈｍ２ꎬ产量为１１４万ｔ[２]ꎬ２０１６年仅出口产值便达４０７.６２万美元ꎮ由于经济价值高㊁种植面积不断扩增㊁产量高ꎬ香梨的贮藏保鲜成为一个关键问题ꎬ经过多年技术攻关ꎬ贮藏冷库成为目前果农的一项选择ꎬ但是香梨在贮藏过程中容易受到病害影响ꎬ例如冻害㊁病虫害㊁褐斑病㊁轮纹病㊁炭疽病㊁青霉病㊁褐腐病及黑头病等[３]ꎬ这些病害严重降低了商品价值ꎬ尤其是库尔勒香梨黑头病ꎬ其发病率高达１０％ꎬ已经成为制约香梨鲜果品质提升的主要问题ꎮ２０１１年ꎬ唐文娟等通过对黑头病病原菌致病性的研究发现ꎬ其主要侵染特征[４]表现为果实萼端深绿色ꎬ且硬度较高ꎻ发病初期萼端果皮变黑色ꎬ表皮切开后可发现果肉有浅褐色蜂窝状坏死现象ꎬ且表观呈现未病变状态的果肉组织略有苦味ꎻ发病后期黑头部位稍有塌陷ꎬ萼端产生黑色霉层ꎬ病斑边缘处果皮变为黑色ꎬ病斑与内部好果肉的交界非常明显ꎬ呈蜂窝状的黑头病部位在伴随黏稠黑汁状物质产生的同时ꎬ存在侵染性腐烂由果皮向果肉逐渐扩散的现象ꎮ由于该疾病在香梨贮藏期间高发ꎬ同时又严重影响香梨的贮藏品质ꎬ所以为了降低香梨发病造成的经济损失ꎬ同时避免这种病害长期存在ꎬ对黑头病致病菌的研究是非常必要的ꎮ本研究采用分子生物学和形态学相结合的方法对病原菌进行鉴定ꎬ以期为香梨黑头病抗病机制的研究及防治提供理论依据ꎬ从而降低黑头病发病率ꎬ延长香梨贮藏时间ꎬ提高香梨品质并促进其产业发展ꎮ１ 材料与方法１.１㊀材料与仪器本研究所用库尔勒香梨(健康果及病果)均于２０１６年采自库尔勒市冷藏库及气调库ꎻ库尔勒香梨树叶及土壤样本采自新疆生产建设兵团第二师２８团香梨果园ꎮ马铃薯葡萄糖琼脂(ＰＤＡ)培养基[５]ꎬ购自青岛海博生物技术有限公司ꎻ十六烷基三甲基溴化铵(ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅꎬ简称ＣＴＡＢ)提取液(２００ｍＬ)[６]ꎬ购自生工生物工程(上海)股份有限公司ꎻＤＮＡ纯化试剂盒ꎬ购自北京全式金生物技术有限公司ꎻ十二烷基硫酸钠(ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅꎬ简称ＳＤＳ)ꎬ购自北京博奥拓达科技有限公司ꎻ酚－三氯甲烷－异戊醇混合液ꎬ购自北京索莱宝科技有限公司ꎻＧｏｌｄＶｉｅｗꎬ购自北京博奥拓达科技有限公司ꎮＬａｂＣｙｃｌｅｒ－ＰＣＲ扩增仪ꎬ赛默飞世尔科技(中国)有限公司(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)ꎻＱＵＡＮＴＵＭＳＴ４全自动凝胶成像仪ꎬ北京五洲东方科技发展有限公司ꎻ１６４５０５６高压电泳仪ꎬ北京六一生物科技有限公司ꎻＦＲＥＳＣＯ２１离心机ꎬ赛默飞世尔科技(中国)有限公司(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)ꎮ１.２㊀菌株的分离纯化及保存１.２.１㊀环境中病原菌的筛选㊀准确称取１０.０ｇ土壤样品ꎬ于ＰＤＡ液体培养基中富集ꎬ在摇床上于２８ħ㊁１２０ｒ/ｍｉｎ培养４８ｈꎬ吸取２００μＬ培养液至ＰＤＡ固体培养基上ꎬ涂布均６１１ 江苏农业科学㊀２０１９年第４７卷第１４期匀ꎬ于２８ħ倒置培养ꎮ从梨树枝条上摘取大小形态完整㊁无明显病态的叶片ꎬ用７５％乙醇棉球擦拭表面ꎬ再用无菌水冲洗３次后自然晾干ꎮ用灭菌的打孔器取直径为０.５ｃｍ的叶片切片ꎬ放置于ＰＤＡ固体培养基中ꎬ于２８ħ倒置培养ꎮ待长出菌落后ꎬ将所有菌落采用划线法或点植法转接纯化ꎬ直至出现单一稳定的菌落ꎮ菌落每次转接均设３组重复ꎮ将最终分离的菌落回接未染病香梨进行致病性能的确定ꎮ１.２.２㊀发病香梨表面病原菌的分离筛选㊀依据柯赫氏法则[７]从库尔勒香梨的病健相接处切下３处病变组织ꎬ在ＰＤＡ固体培养基上ꎬ于２８ħ培养ꎮ待长出菌落后ꎬ将所有菌落采用划线法或点植法转接纯化５次ꎬ直至分离出菌落大小㊁形状㊁颜色㊁表面光滑湿润程度㊁菌丝生长速度㊁菌丝形状㊁产孢情况㊁孢子颜色㊁形状等一致的若干菌株[８]ꎮ病变香梨样品有１５个ꎬ每个香梨设３组平行ꎬ菌落每次转接均设３组重复ꎮ最终将初分离得到的菌落回接到未致病香梨果实上得到致病香梨ꎬ进而与未致病香梨比较ꎬ进行致病性能的确定ꎮ１.２.３㊀病原菌的保存㊀用液体培养法将分离纯化后的致病菌培养至对数期ꎬ保存于５０％灭菌甘油(用蒸馏水配制)中ꎬ于－８０ħ保存ꎮ与此同时ꎬ将病原菌接种在斜面固体ＰＤＡ培养基中ꎬ培养３ｄ后ꎬ于４ħ保存备用ꎮ１.３㊀菌株的形态学鉴定将已分离纯化的菌种接种在ＰＤＡ固体培养基平板上ꎬ于２８ħ培养ꎬ自第４天开始观察菌落的生长状况ꎮ病原菌菌落形态:观察分离培养基上病原菌的菌落形态(包括形状㊁大小㊁菌落色泽㊁菌落表面结构㊁菌落渗出物及菌落边缘特征)ꎮ菌落形态特征的描述参照«真菌鉴定手册»[９]«中国真菌志»[１０]«植物病原真菌学»[１１]及«真菌的形态和分类»[１２]ꎮ１.４㊀回接试验从气调贮藏库选取健康的库尔勒香梨果实ꎬ于室温放置６ｈ后ꎬ在无菌条件下ꎬ用７５％乙醇棉球表面擦拭消毒ꎬ后用无菌水冲洗５次ꎬ自然晾干ꎬ进行接种ꎮ用无菌打孔器在库尔勒香梨萼部分别打３个直径为０.５ｃｍ㊁深度为０.２ｃｍ的孔用于接种ꎬ取相同直径的病原菌饼接种于打孔处ꎬ将单果实独立分装于无菌密封袋中ꎬ室温存放ꎮ用分离出的每个病原菌分别接种香梨果实ꎬ每个菌种为１个处理ꎬ每个处理重复３次ꎮ在２５ħ㊁相对湿度(ＲＨ)保持在９０％以上培养５~１５ｄ后对其进行观察ꎬ若症状与致病香梨症状一样ꎬ则初步确定该菌株为病原菌ꎮ１.５㊀病原菌分子生物学鉴定１.５.１㊀病原菌的ＤＮＡ提取㊀采用ＣＴＡＢ法对病原菌ＤＮＡ进行提取ꎮ１.５.２㊀ＰＣＲ扩增病原菌内转录间隔区(ＩＴＳ区)㊀ＩＴＳ－ｒＤＮＡ基因片段扩增采用通用引物ꎬ上引物为ＩＴＳＦ(５ᶄ－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３ᶄ)ꎬ下引物为ＩＴＳＲ(５ᶄ－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３ᶄ)ꎮ２０μＬＰＣＲ扩增体系如下:１μＬＤＮＡ模板ꎬ０.５μＬ上游引物ꎬ０.５μＬ下游引物ꎬ１０μＬ预混液Ｍｉｘꎬ８μＬｄｄＨ２ＯꎮＰＣＲ反应程序如下:９５ħ５ｍｉｎꎻ９５ħ３０ｓꎬ５４ħ３０ｓꎬ７２ħ１ｍｉｎꎬ３０个循环ꎻ７２ħ７ｍｉｎꎮ反应完成后ꎬ取３μＬＰＣＲ产物ꎬ加１μＬ６ˑｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒꎬ混匀后点样于０.８％琼脂糖凝胶ꎬ电泳后在紫外光下观察特异性条带ꎮ１.５.３㊀ＰＣＲ扩增产物的纯化回收㊀ＰＣＲ扩增产物经全式金琼脂糖回收试剂盒回收纯化ꎮ１.５.４㊀ＩＴＳ区基因的克隆转化㊀将回收纯化产物与Ｔ载体(ＰＭＤ１９－Ｔ)连接(载体与目的片段摩尔比为１ʒ３)ꎬ然后转化Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ感受态ꎬ筛选阳性克隆[１３]ꎬ进行测序ꎮ１.５.５㊀质粒提取及测序㊀筛选阳性克隆ꎬ于３７ħ摇床培养１２ｈꎬ提取大肠杆菌质粒ꎬ送相关公司测序ꎮ质粒提取步骤参考温建新等的大肠杆菌质粒提取方法[１４]ꎮＩＴＳ－ｒＤＮＡ测序由北京华大基因研究中心完成ꎮ将测序结果在美国国立生物技术信息中心(ＮＣＢＩ)数据库中进行同源序列比对(ＢＬＡＳＴ)ꎬ获得重复率最高的相关属及相关种的基因序列ꎬ并根据遗传距离计算结果绘制系统发育树ꎮ２ 结果与分析２.１㊀病原菌的分离筛选以贮藏于冷库的自然发病香梨及生长环境中采集的土壤㊁树叶为材料ꎬ经分离筛选㊁纯化ꎬ得到１１株病原菌ꎬ其中从土壤中分离出１株(命名为ＴＲ－１)ꎬ从树叶中分离出５株(分别命名为ＳＹ－２㊁ＳＹ－３㊁ＳＹ－４㊁ＳＹ－５㊁ＳＹ－６)ꎬ从病梨中分离出５株(分别命名为ＸＬ－２㊁ＸＬ－３㊁ＸＬ－４㊁ＸＬ－５㊁ＸＬ－６)ꎮ通过观察病原菌菌落形态ꎬ发现２株菌ＳＹ－６㊁ＸＬ－６在生长初期为灰白色ꎬ气生菌丝薄层絮状ꎬ随着生长时间的延长及孢子的产生ꎬ逐渐表现为浅绿色直至褐色ꎬ菌落有明显的同心轮纹ꎬ中心突起且泛白ꎬ质地紧致ꎬ呈毡状ꎬ表面呈现沟纹状ꎬ基底为墨绿色ꎬ生长后期培养基呈黑色ꎬ菌落边缘处有１道宽约０.２~０.４ｃｍ的白色菌丝体ꎮ这与笔者所在课题组前期研究结果ꎬ即黑头病病原菌链格孢属的菌落形态较接近ꎬ初步判定菌株ＳＹ－６㊁ＸＬ－６为链格孢属ꎮ２.２㊀病原菌的显微观察通过对菌株进行显微观察ꎬ在高倍镜下观察孢子形态ꎬ由图１可以看出ꎬＳＹ－６㊁ＸＬ－６病原菌孢子串生㊁有横隔且孢子呈长卵形ꎬ与链格孢属较为相似ꎮ２.３㊀回接试验将分离纯化得到的致病菌菌株(ＳＹ－６㊁ＸＬ－６)采用有伤回接(菌饼)法进行试验ꎬ由图２可知ꎬ接种后香梨的发病症状与自然发病香梨相似ꎮ２株致病菌于库尔勒香梨上在生长初期为灰白色ꎬ气生菌丝薄层絮状ꎬ随着生长时间的延长ꎬ逐渐变为浅绿色直至褐色ꎬ菌落有明显的同心轮纹ꎬ中心突起且泛白ꎬ质地紧致㊁毡状ꎬ表面呈现沟纹状ꎬ基底为墨绿色ꎬ生长后期培养基呈黑色ꎬ菌落边缘处有１道宽约０.２~０.４ｃｍ的白色菌丝体ꎮ初步判定病原菌株ＳＹ－６㊁ＸＬ－６为链格孢属ꎮ２.４㊀黑头病致病菌的分子生物学鉴定２.４.１㊀致病菌的ＤＮＡ提取及扩增㊀采用ＣＴＡＢ法提取菌株(ＳＹ－６㊁ＸＬ－６)的基因组ＤＮＡꎬ并进行ＰＣＲ扩增ꎬ以ＩＴＳＦ㊁ＩＴＳＲ通用引物扩增致病菌的ＩＴＳ－ｒＤＮＡꎬ对ＰＣＲ扩增产物进行０.８％琼脂糖凝胶电泳检测ꎮ结果表明ꎬＰＣＲ扩增产物均有条带ꎬ且条带单一ꎬ无其他杂带出现ꎬ电泳结果见图３ꎬ根据电泳图中ｍａｒｋｅｒⅡ分子量大小的比对可知ꎬ致病菌的ＩＴＳ－ｒＤＮＡ基因序列片段大约为６００ｂｐꎮ２.４.２㊀ＰＣＲ产物回收纯化㊀将ＰＣＲ扩增产物经全式金琼脂糖回收试剂盒回收纯化ꎬ并进行电泳检测ꎮ由图４可以看出ꎬ７１１江苏农业科学㊀２０１９年第４７卷第１４期回收结果均有条带ꎬ且条带单一ꎬ回收效果良好ꎮ２.４.３㊀克隆转化及质粒提取㊀将纯化后的ＤＮＡ由Ｔ载体转入大肠杆菌感受态细胞ꎬ进行抗生素蓝白选择性培养ꎬ成功挑选白色单菌落ꎬ于３７ħ摇床培养１０~１２ｈ后ꎬ提取质粒ꎬ质粒提取结果表明ꎬＳＹ－６㊁ＸＬ－６条带清晰明亮ꎬ质粒提取较成功ꎬ电泳检测结果见图５ꎮ２.４.４㊀测序及建树㊀对于同一致病菌ꎬ选取２支最清晰的条带进行测序ꎮ结果表明ꎬ菌株ＳＹ－６㊁ＸＬ－６的核苷酸序列得到了有效扩增ꎮ将基因序列结果提交至ＮＣＢＩ数据库中进行检索ꎬ将致病菌基因序列通过ＢＬＡＳＴ工具进行同源性比对ꎮ选取同源性高于９５％的１０株菌ꎬ使用ＭＥＧＡｖ.６.０软件系统进行发育树的构建ꎬ详见图６ꎮ由系统发育树可知ꎬ黑头病致病菌ＳＹ－６㊁ＸＬ－６与链格孢属(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｓｐ.)基因序列的同源性相近ꎬ即亲缘关系近ꎬ说明与该种群的系统发育关系最为相近ꎬ结合ＳＹ－６㊁ＸＬ－６菌株的形态学特性和ＩＴＳ－ｒＤＮＡ基因组序列分析ꎬ判定菌株ＳＹ－６㊁ＸＬ－６为链格孢属ꎮ３ 讨论黑头病 是库尔勒香梨贮藏过程中一种新型㊁高发性病８１１ 江苏农业科学㊀２０１９年第４７卷第１４期症ꎬ是致病性极强的病害ꎬ它的致病性给果农带来了较大的经济损失ꎮ为了改善这一病害症状ꎬ关于病原菌个体属性及后期对库尔勒香梨侵染机制的研究至关重要ꎮ传统形态学特性会由于致病菌生长环境因素的变化ꎬ而可能对致病菌的鉴定作出错误的判断ꎬ因此ꎬ应结合分子生物学鉴定方法ꎮ通过对库尔勒香梨 黑头病 致病菌进行分离纯化ꎬ使用传统形态学㊁分子生物学ＩＴＳ－ｒＤＮＡ序列的比对方法ꎬ可以有效鉴定致病菌ꎮ目前ꎬＩＴＳ－ｒＤＮＡ序列分析方法已经被广泛应用于真菌鉴定中ꎬ但是某些真菌采用ＩＴＳ－ｒＤＮＡ序列区间的分析鉴定很难将致病菌鉴定到种ꎬ在本研究中ꎬ病原菌经鉴定为链格孢属ꎮ植物受到病原菌侵染后ꎬ自身也有其相应的反应机制ꎬ会产生一系列防卫作用来抵御病原菌的侵染[１５]ꎮ这些反应包括一系列寄主植物组织和细胞结构的变化㊁生理生化反应的变化㊁病程相关蛋白的诱导产生和细胞的坏死等[１６]ꎮＰｅｒｅｉｒａ等研究西洋梨群对黄花菜匍柄霉(Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍｖｅｓｉｃａｒｉｕｍ)进行防御反应背后的分子机制ꎬ建立了ｃＤＮＡ文库用于识别耐药品种(Ｅｒｃｏｌｉｎｉ)和易感品种(Ｒｏｃｈａ)之间差异表达的基因ꎬ分析揭示了一些与胁迫和防御有关的转录本[１７]ꎮＳｗａｒｕｐａ等构建了抑制消减杂交(ＳＳＨ)文库ꎬ研究了香蕉对枯萎病的抗性基因ꎬ通过香蕉中感染尖孢镰孢芝麻专化型(Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.)的对比基因型ꎬ鉴定出在枯萎病期间上调的基因[１５]ꎮ可以看出ꎬ研究寄主植物对病原菌侵染的抗性防卫机制对于提高植物自身的抗病性极为重要ꎮ因此ꎬ后期对库尔勒香梨 黑头病 致病菌分子侵染机制以及相关抗性基因的研究将会为防治库尔勒香梨黑头病提供理论参考ꎮ４ 结论通过对库尔勒香梨黑头病病原菌的筛选㊁纯化和鉴定ꎬ得出以下结论:从生长环境和病梨表面共分离出１１株致病菌ꎬ通过观察菌落形态特征及孢子显微结构ꎬ发现ＸＬ－６㊁ＳＹ－６与笔者前期研究发现的引发库尔勒香梨黑头病的链格孢属较为相似ꎬ最终通过ＩＴＳ－ｒＤＮＡ基因序列同源性比对ꎬ确定ＸＬ－６㊁ＳＹ－６致病菌为链格孢属ꎮ参考文献:[１]唐文娟.香梨贮藏期间黑头病病原菌的分离鉴定及发病规律研究[Ｄ].石河子:石河子大学ꎬ２０１１:１－２.[２]张旭升.库尔勒香梨种植户施肥用药行为与认知研究[Ｄ].阿拉尔:塔里木大学ꎬ２０１７:１５－１７.[３]李自芹.ＳＡ㊁紫外线和苯甲酸钠对库尔勒香梨采后黑头病的抗病性及贮藏品质的影响研究[Ｄ].石河子:石河子大学ꎬ２０１３:２－４. 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