实验七液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的各种模式探索一、实验目的1、了解LC-MS的主要构造和基本原理；2、学习LC-MS的基本操作方法；3、掌握LC-MS的六种操作模式的特点及应用。
二、实验原理1、液质基本原理及模式介绍液相色谱-质谱法（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry，LC-MS）将应用范围极广的分离方法——液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。
但是，LC是液相分离技术，而MS是在真空条件下工作的方法，因而难以相互匹配。
LC-MS经过了约30年的发展，直至采用了大气压离子化技术（Atmospheric pressure ionization，API）之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。
现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中，LC-MS已经成为最重要研究方法之一。
质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。
（一）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是化合物的全谱，可以用来进行谱库检索，一般用于未知化合物的定性分析。
实例：（Q1 = 100-259m/z）（二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：不是连续扫描某一质量范围，而是跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。
主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。
实例：（Q1 = 259m/z）本实验采用三重四极杆质谱仪（Q1：质量分析器；Q2：碰撞活化室；Q3：质量分析器），由于多了Q2、Q3的存在，在分析测试的模式上又多了四种选择：（三）子离子扫描模式（Product Scan）：第一个质量分析器固定扫描电压，选择某一质量离子（母离子）进入碰撞室，发生碰撞解离产生碎片离子，第二个质量分析器进行全扫描，得到的所有碎片离子都是由选定的母离子产生的子离子，没有其它的干扰。
主要用于化合物结构分析。
实例：（Q1 = 259m/z；Q3 = 100-259m/z）（四）母离子扫描模式（Precursor Scan）：第一个质量分析器扫描电压选择母离子（如分子离子），进入碰撞室碰裂后，第二个质量分析器固定扫描电压，只选择某一特征离子质量，该特征离子是由所选择的母离子产生的，由此得到所有能产生该子离子的母离子谱。
主要用于同系物的分析。
实例：（Q1 = 100-300m/z；Q3 = 259m/z）（五）中性丢失扫描模式（Neutral Loss）：第一个质量分析器扫描所有离子，所有离子进入碰撞室碎裂后，第二个质量分析器以与第一个质量分析器相差固定质量联动扫描，检测丢失该固定质量中性碎片（如质量数15、18、45）的离子对，得到中性碎片谱。
主要用于中性碎片的分析。
实例：（Q1 = 100-300m/z；Q3 = 82-282m/z）（六）多反应监测模式（MRM）：第一个质量分析器选择一个（或多个）特征离子，经过碰撞解离，到达第二个质量分析器再进行选择离子检测，只有符合特定条件的离子才能被检测到，因为是两次选择，比单四极质量分析器的SIM 方式选择性、排除干扰能力、专属性更强，信噪比更高。
主要用于定量分析。
实例：（Q1 = 259m/z；Q3 = 138m/z）2、实验内容简介邻苯二甲酸酯(简称PAEs)是一类重要的环境内分泌干扰物，常被用作塑料的增塑剂，也可用作农药载体。
近年来，随着工业生产和塑料制品的广泛使用，邻苯二甲酸酯不断进入环境，普遍存在于土壤、底泥、大气、水体和生物体等环境样品中，成为环境中无所不在的污染物。
据报道，邻苯二甲酸酯类具有较弱的环境雌激素成分，具有影响生物体内分泌和导致癌细胞增殖的作用。
环境内分泌干扰物是指能改变机体内分泌功能，并对机体、后代或（亚）种群产生有害效应的环境物质。
由于环境内分泌干扰物对人和动物有种种不良影响，对环境内分泌干扰物的研究已成为国际关注的焦点。
我国也正在逐渐重视有关环境内分泌干扰物的研究。
三、仪器与试剂1、仪器液相系统：Varian Pro Star；自动进样器：Varian 410自动进样器；质谱仪：Varian 310 LC-MS/MS三重四极杆质谱仪（ESI离子源）；色谱柱：Varian Inertsil 3 ODS-3（150mm×2mm，3μm）。
2、试剂甲醇：HPLC色谱纯；超纯水：Millipore Express超纯水系统制备；标准溶液：用甲醇配制邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)混合标准溶液（0.1ppm）。
四、实验步骤1、条件设置色谱条件：流动相（90%甲醇+10%水）；流速（0.2ml/min）；扫描时间（7min）；离子源模式：电喷雾电离（ESI），正离子模式；扫描条件：Detector：1000V；Needle：5000V；Shield：600V；Spray Chamber Temperature：50℃；Nebulizing Gas Pressure：55psi；Drying Gas Pressure：18psi，Drying Gas Temperature (℃)：250℃，Capilary Voltage 30(V)，Coll.Energy 30(v)；质量分析器：三重四极杆；进样体积：10ul。
2、实验测定按实验操作规程完成仪器开机、参数设置及测定。
根据表1中的数据，设置m/z，选择各种扫描模式（全扫描、选择离子扫描、子离子扫描、母离子扫描、多反应监测模式）进行测定。
表1 待测物质的母离子和主要子离子DMP DEP DBP母离子（m/z）195.1 223.1 279.1子离子（m/z）163.1 149.1 149.1五、数据处理SCAN模式：从图中可以看出，各峰没有很好的分开，峰形也过宽。
一方面是由于色谱柱坏掉了，另一方面色谱流动相为100%甲醇，是等度洗脱，极性变小，峰流出时间变快，导致没有很好的分开。
在图中，我们可以看到有别于DMP，DEP,DBP的分子离子峰，它们的来源是：DMP DEP加H+（m/z）195 223加Na+（m/z）217 245SIM模式：在上面试验中，我们看到，有DEP的离子峰为223，于是我们就设定了223这个离子来进行SIM扫描。
我们也可以看到它的信噪比为690，比较高！母离子扫描模式（Precursor Scan）：由上面两图中，我们可以看到，能产生m/z=149离子的分子有m/z=194,223,279,339,这些离子。
其机理为：OO C OOm/z=223HOO C OOHm/z=195OH Cm/z=149OOOO COOm/z=279H子离子扫描模式（Product Scan ）：我们选定了m/z=223的离子，得到由其产生的离子有m/z=149和177的离子。
其机理为：O OC O Om/z=223HOOHCm/z=149Om/z=177OOCOO多反应监测式（MRM）：实验时Q1先选择质荷比223的特征离子，然后Q2选择质荷比177的特征离子，这样经过两次选择，比单四极质量分析器的SIM方式选择性、排除干扰能力、专属性更强，信噪比更高,相比于SIM的信噪比（690），本次多反应监测模式的信噪比高达2734.所以其用于定量分析特别准。
六、思考题1、各扫描模式中m/z分别如何设定？1.全扫描模式方式（Scan）全扫描的m/z时Q1设定一个范围，Q2，Q3关闭，扫描这个范围内的离子。
2.选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）而SIM中m/z的设定，就是如同单重四级杆一样，Q1设定一个值，Q2，Q3关闭只检测你想要的离子。
3.子离子扫描模式（Product Scan）Q1采用SIM扫描模式，设定想要分析的母离子，而Q3采用SCAN模式，扫描Q1所产生的碎片。
4.母离子扫描模式（Precursor Scan）Q1采用SCAN模式，而Q3采用SIM模式，它能获得能产生特定子离子的母离子5.中性丢失扫描模式（Neutral Loss）Q1与Q3设定的值相差一个范围，如A何B的核质比相差18，那我们就可以设定 Q1和Q3之差为18，来检测母离子丢失了哪些中性分子。
6.多反应监测模式（MRM）Q1和Q3都采用SIM模式，设定的值不一定要相等。
这样经过两次SIM 模式选择，这样准确性就非常高。
常用于定量分析。
2、较各模式的测定结果，讨论各模式在测定中的作用。
比全扫描模式方式一般用于未知化合物的定性分析选择离子监测模式主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析子离子扫描模式主要用于化合物结构分析母离子扫描模式主要用于同系物的分析中性丢失扫描模式主要用于中性碎片的分析多反应监测模式主要用于定量分析3、结合HPLC等其它色谱分析技术及实验，讨论LC-MS的优势及在社会中所能起到的作用。
LC-MS把液相色谱和质谱法的优势合二为一，具有灵敏度高，分析速度快，图谱解析简单等优势。
现在LC-MS主要是在生物大分子的分析中起到了强大的作用，为药物分析与生物制品的检测的发展到了很大的作用。
4、若作为开放实验，你认为本实验方法还有哪些方面可以补充或提高的？如果作为开放实验，我想还应当增加梯度洗脱这一程序，由于等度洗脱对于混合物的分离的效果太差，所以在开放实验中必然要用到等梯度洗脱，然后还可以加适当的缓冲溶剂，这样出来的峰会更细。
5,LC-MS的七大禁止：一，禁止高浓度待测样品浓度过高，首先会脏色谱柱和四级杆，导致下次实验时出现“鬼峰”，况且质谱的灵敏度已经很高了，没必要进高浓度样品！二，禁止用洗涤剂清洗玻璃容器表面活性剂容易离子化，在电离时和待测样品产生竞争效应。
三，禁止无机样品进样主要是无法离子化，难溶物易沉寂阻塞喷雾针四，禁止用塑料容器装样品塑料瓶中的塑化剂邻苯二甲酸酯在ESI条件下可以产生很强的信号，造成很高的背景。
目前市场上无论是国产还是进口的试剂都经常会发现有很强的增塑剂信号，需要自己纯化。
五，禁止用不挥发性缓冲盐不挥发的缓冲盐在HPLC中经常使用，但是在LC-MS却是噩梦，由于他不挥发，所以在接口去溶剂过程中，他将严重干扰待测物的出峰。
六，禁止高浓度有机缓冲盐缓冲液一般选择甲酸铵和乙酸铵等，这是由于他们具有：1、显著地质子自递作用，有利于离子在流动相中预先形成，2、适中的介电常数，避免喷口放电，3、强挥发性，易脱去，不易形成溶剂加成物。
