磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶检测试剂盒(PEP比色法)

2. 实验试剂：50mM ATP溶液，50mM磷酸肌酸溶液，0.2mM NaHCO3溶液，160U/ml 磷酸肌酸激酶溶液，160U/ml磷酸甘油酸激酶溶液，160U/ml磷酸甘油醛脱氢酶溶液（U为酶活力单位），25mM RuBP溶液，5mM NADH，Rubisco提取介质（40mM Tris-HCl缓冲液，pH7.6，内含10mM MgCl2溶液，0.25mM EDTA，5mM谷胱甘肽），反应介质（0.1M Tris-HCl缓冲液，pH7.8，内含12mM MgCl2溶液，0.4mM EDTA）。

3实验步骤3.1 酶粗提液的准备取新鲜洗干净的条斑紫菜的丝状体和条斑紫菜的叶状体各1克，加入预冷的提取介质1ml，冰浴研磨10min，将样品在40C，10,000×g离心10min，弃沉淀；上清夜即是酶粗提液，置于00C备用（王维光，1985；张志良等，2003）。

3.3.2 Rubisco酶活力的测定按下表配制反应体系：试剂加入量ml5mM NADH 0.250mM ATP 0.2酶提取液0.150mM磷酸肌酸0.20.2mM NaHCO30.2反应介质1.4160U/ml磷酸肌酸激酶0.1160U/ml磷酸甘油酸激酶0.1160U/ml磷酸甘油醛脱氢酶0.1双蒸水0.3将配制好的反应体系混匀，倒入比色杯内，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计计上测量340nm处反应体系的OD值，作为零点值。

将0.1mlRuBp加入比色杯内，立即计时，每隔20s测一次OD值，共测3min。

以零点到第1min 的OD值下降的绝对值计算酶活力。

由于酶提取液中可能存在3-磷酸甘油酸（PGA），会使酶活力的测定产生误差，因此除上述测定外还需做一个不加RuBp的对照。

对照的反应体系与上述酶的反应体系完全一样，所不同的仅仅是把酶提取液放在最后加，加入后马上测定此反应体系340nm处的OD值，并记录前1min内OD值的变化量。

磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）是一种重要的酶类，参与碳的代谢过程，在许多生物体中起着关键的作用。

该酶催化磷酸烯醇化合物和二氧化碳在碳代谢途径中的转化，将磷酸烯醇化合物转化为草酰乙酸（oxaloacetate）。

本文将对磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶的结构、功能和调节机制进行探讨。

磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶是一种转运酶（transcarboxylase），催化的反应是将磷酸烯醇化合物和碳酸转化为草酰乙酸。

该酶广泛存在于植物、细菌和真核生物的细胞质中，并且在植物中存在多个亚型。

PEPC在植物中起着重要的作用，特别是在光合作用的碳固定和二氧化碳浓缩中。

在一些C4植物（如玉米、甘蔗和高粱）中，PEPC被发现在叶肉细胞的细胞质中大量表达，它们参与光合作用的初始碳固定步骤。

因此，PEPC在植物的生长和发育中起着重要的调控作用。

磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶的结构是多样的，不同来源的酶具有不同的亚型和结构特征。

然而，这些结构中的酶都具有共同的特点，包括高度保守的活性位点和催化中心。

PEPC通常是由四个相同的亚基组成，每个亚基包含一个催化中心。

这些亚基通过非共价相互作用力（如离子键、氢键和疏水相互作用）相互结合形成四聚体结构。

在催化中心中，PEPC通过与金属离子（如锰、镁或钙）结合来促进催化反应。

磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶的功能主要体现在其对碳代谢途径的调控。

PEPC在光合作用过程中起到关键的作用。

在C4植物中，PEPC催化的反应是光合作用的第一步，将二氧化碳固定为草酰乙酸，然后将其转运到细胞鞘细胞中进行光合作用。

这种C4途径有效地减少了光呼吸对植物光合作用效率的影响。

另外，在某些条件下，PEPC还可参与细胞的呼吸过程，将草酰乙酸转化为磷酸烯醇化合物，从而提供能量。

磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶的活性受到多种因素的调节。

首先，PEPC的活性可通过调节其基因表达水平来实现。

丙酮酸检测试剂盒(二硝基苯肼比色法)简介：丙酮酸(Pyruvic acid)又称2-氧代丙酸，是参与整个生物体基本代谢的中间产物之一，可通过乙酰CoA 和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化，丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用。

丙酮酸检测试剂盒(二硝基苯肼比色法)检测原理是在酸性条件下，丙酮酸与二硝基苯肼反应，生成丙酮酸丙酮酸-二硝基苯腙复合物，后者经氧化呈樱桃红色，通过分光光度比色法测定520nm 处吸光度，据此通过与标准曲线对比可以计算出PA 水平。

该试剂盒可用于检测植物、细胞或组织、血浆、血清等样品中内源性的丙酮酸含量，尤其适用植物样品丙酮酸含量的检测。

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：操作步骤(仅供参考)：1、 准备样品：① 血浆、血清、尿液及其他体液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-20℃冻存。

② 细胞或组织样品：取2g 组织样品，加入组织匀浆液，仔细研磨，转移至新的离心中，清洗研磨器一并倒入离心管中，补组织匀浆液至，充分混匀，离心取上清，-20℃冻存，用于PA 的检测。

③ 高浓度样品：如果样品中含有较高浓度的PA ，可以使用原有的裂解液或PBS 等进行稀释，如鸡血清、血浆可稀释5～10倍后检测。

2、 配制标准品工作液：如果检测血清、血浆、尿液等样品，取丙酮酸标准(6mg/ml)，按取丙酮酸标准(6mg/ml)：蒸馏水=1:99的比例配制，使浓度达到60μg/ml 3、 检测血清、血浆、尿液等样品时，按下表操作：试管号/ml 0 1 2 3 4 5 丙酮酸标准(60μg/ml)0.30.60.91.21.5编号 名称TC0751 50T Storage试剂(A): 丙酮酸标准(6mg/ml) 1ml 4℃ 避光 试剂(B): 组织匀浆液 250ml RT 试剂(C): 苯肼显色液 30ml RT 试剂(D): PA assay buffer 150mlRT 使用说明书1份蒸馏水 1.5 1.2 0.9 0.6 0.3 0 丙酮酸浓度(μg/ml) 0 12 24 36 48 60检测组织样品时，按下表操作：试管号/ml 0 1 2 3 4 5 丙酮酸标准(60μg/m,匀浆液配制) 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5组织匀浆液(检测组织样本时用) 1.5 1.2 0.9 0.6 0.3 0 丙酮酸浓度(μg/ml) 0 12 24 36 48 604、加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。

文献综述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶综述[摘要]磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶( PEPC)广泛存在于高等植物、藻类及大多数细菌中, 催化C4光合作用固定CO2的第一步反应。

在过去的10年中关于 PEPC分子的一级结构研究已取得显著的进展, 最近, 通过X- 射线衍射分析阐明了大肠杆菌和米C4型PEPC分子的三维结构, 就这些研究进展进行总结。

关键词: 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶大肠杆菌 PEPC 玉米 C4型 PEPC 分子结构一、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的分子结构[1]PEPC (EC4.1.1.31)以 Mg2+或 Mn2+为辅助因子,催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和HCO3-生成草酰乙酸( OAA)和无机磷酸的不可逆性反应。

PEPC广泛存在于光合生物, 如植物、藻类、蓝细菌和光合细菌中, 还存在于很多非光合细菌和原生动物中。

PEPC催化的反应为细胞各种组分的生物合成提供四碳二羧酸, 参与维持柠檬酸循环, 在初级代谢中有重要的补给作用, 在C4植物和CAM 植物的光合作用中催化大气中CO2固定的第一步反应, 是C4光合作用途径中最重要的酶之一。

所有已知的PEPC均是四聚体,四个相同亚基的分子量大约为95~110k Da。

大多数 PEPC是变构酶, 其活性调控方式为变构作用。

不同种类生物的PEPC有多种变构效应物。

把C4光合作用特异性的PEPC基因导入C3植物中,以期提高C3光合作用效率, 是目前植物基因工程的一个研究热点。

研究结果发现在转基因植物中PEPC的活性也如同在C4植物中一样, 受代谢产物如苹果酸, 6-磷酸葡萄糖(Gluc6-P)和可逆性磷酸化的共价修饰调控。

由于PEPC的变构调控方式和机理很复杂,使PEPC的转基因操作得不到预期的结果, 为此PEPC的分子特性需要通过基因工程改造使之更适合转基因操作的要求。

对PEPC分子结构的研究可以为基因工程改造PEPC的分子特性提供理论依据、为提高C3光合作用固定CO2的效率和作物的产量提供有益的启示。

二氧化碳测定试剂盒(PEPC酶法)产品技术要求zhongshengbeikong 二氧化碳测定试剂盒（PEPC酶法）适用范围：本产品用于体外定量测定人血清中二氧化碳的浓度。

1.1包装规格液体单剂型试剂（R）：20mL×4，校准品：3mL×1；试剂（R）：20mL×6，校准品：3mL×1。

1.2主要组成成分试剂（R）液体:磷酸烯醇式丙酮酸（PEP） 12.5mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC） 400U/L） 8.0mmol/L氯化镁（MgCl2苹果酸脱氢酶（MDH） 4100U/L还原辅因子 0.6mmol/L校准品液体：水溶液基质（1个浓度）碳酸氢钠目标浓度25.0 mmol/L(每批定值，详见值单) 2.1 外观试剂盒中各组件的外观应满足：2.1.1试剂（R）应为浅黄绿色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损。

2.1.2校准品应为无色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损。

2.2 净含量液体试剂净含量应不少于标示值。

2.3 试剂空白吸光度在波长400nm～420nm（光径1cm）处，试剂空白吸光度（A）应≥0.600；试剂空白吸光度变化率（△A/min）应≤0.015。

2.4准确度测定GBW06101，测定结果的相对偏差应不超过±10％。

2.5分析灵敏度对应于浓度为 25mmol/L的二氧化碳所引起的吸光度变化率（△A/min）的绝对值应在0.010～0.080的范围内。

2.6重复性重复测试高、中、低浓度样本，变异系数（CV）应≤10%。

2.7批间差测试同一样本，批间差（R）应≤10%。

2.8线性范围在［3，60］mmol/L范围内，线性相关系数（r）应≥0.990；在（25，60］mmol/L范围内，线性相对偏差应不超过±10％；在［3 ，25］mmol/L范围内，线性绝对偏差应不超过±2.5mmol/L2.9试剂稳定性2.9.1效期稳定性原包装的试剂盒在2℃～8℃避光贮存，有效期为12个月。

2021年 2月 Journal of Science of Teachers′ College and University Feb. 2021文章编号：1007-9831（2021）02-0054-07植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究进展于济1，2，沙伟1，2，张梅娟1，2，马天意1，2（齐齐哈尔大学 1. 生命科学与农林学院，2. 抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）摘要：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC 4.1.1.31）是广泛存在的一种细胞质酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸和HCO3-生成草酰乙酸．PEPC作用的产物在植物的生长发育过程和植物应对环境胁迫反应中起到调控的作用，因而被广泛关注．介绍了植物PEPC的种类、结构特征、不同物种中PEPC基因的克隆与分离、在植物逆境反应中的应用、植物PEPC 的活性调节，为深入研究PEPC基因提供理论依据．关键词：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；植物；植物逆境胁迫中图分类号：Q945 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1007-9831.2021.02.011Research progress of plant phosphoenolpyruvate carboxylaseYU Ji1，2，SHA Wei1，2，ZHANG Meijuan1，2，MA Tianyi1，2（1. School of Life Sciences，Agriculture and Forestry，2. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering andProtection of Biodiversity in Cold Areas，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China）Abstract：Plant phosphoenolpyruvate carboxylase（PEPC，EC 4.1.1.31）is a ubiquitous cytoplasmic enzyme that catalyzes the production of Oxaloacetate by phosphoenolpyruvate and HCO3-．The products of PEPC play important roles in the growth and development of plants and the responses of plants to environmental stresses，so that the PEPC is widely concerned．Introduced the types，structural characteristics，the cloning and isolation of PEPC genes in different species，the applications in plant stress responses，and the researches of plant PEPC activity regulation，which provides a theoretical basis for further studiesof PEPC genes．Key words：phosphoenolpyruvate carboxylase；plant；plant stress responses磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC 4.1.1.31）是一种胞质酶，在HCO3-存在的情况下，可以催化磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP）的β-羧化反应，以Mg2+为辅因子生成草酰乙酸（Oxobutanedioic acid，OAA）和无机磷酸[1]70，此反应为不可逆反应．PEPC存在于所有植物中，如绿藻、蓝细菌、大多数古细菌、非光合细菌中，但在动物和真菌中不存在[2]15． PEPC以其在C4和景天酸代谢（Crassulacean acid metabolism，CAM）光合作用中的作用而闻名，在此过程中，其初步固定了大气中的CO2[3]274．然而，PEPC在C3植物的非光合和光合组织中也发挥着广泛的作用，它可以通过补充C4-二羧酸进行能量和生物合成代谢，主要起抗衰老作用[4-5]．在C3植物叶片和非光合收稿日期：2020-11-15基金项目：齐齐哈尔大学大学生创新创业训练计划项目（202010232817）；黑龙江省省属高等学校基本科研业务费青年创新人才项目（135309364）；黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目植物性食品加工技术特色学科专项（YSTSXK201876）；黑龙江省人力资源和社会保障厅2018年省级留学回国人员择优资助项目作者简介：于济（1997-），女，吉林松原人，在读硕士研究生，从事植物逆境分子遗传学研究．E-mail：*****************通信作者：马天意（1989-），男，黑龙江齐齐哈尔人，讲师，博士，从事植物逆境分子遗传学研究．E-mail：********************组织中，PEPC的主要作用是在三羧酸循环中补充中间体，以及后面的氮同化和各种生物合成途径[3]274．此外，PEPC还参与了广泛的生理和发育过程，包括种子萌发和发育、果实成熟、豆科植物根瘤固氮等，在气孔保卫细胞中提供苹果酸以及增强了对渗透压和生物胁迫的耐受性[2，6-9]．正是因为PEPC在植物中发挥着非常重要的作用，因此被人们广泛关注．为了更好地了解植物体中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的作用机制，本文概括分析了植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的分类、功能、分离与克隆、活性调节以及在植物抵抗逆境过程中的作用等方面的研究结果，介绍了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因在基因工程方面的应用，也为进一步研究磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因提供了理论基础．1 PEPC的基本结构1984年，首先从大肠杆菌（Escherichia coli）克隆的PEPC基因推导了PEPC的一级结构[10]．目前，已经分别在植物和细菌中发现了许多PEPC序列，包括同一生物体中的同工型，并且大约500个部分序列已经记录在GenBank中，主要用于系统发育重建[11-12]．系统进化树显示，这些PEPC是从相同的祖先进化而来的[3，13]．PEPC多肽的大小随生物体的种类而异：细菌、维管束植物、蓝细菌、原生动物（如疟疾病原体）的氨基酸残基数量大约为870（100 kDa），970（110 kDa），1010（116 kDa）或1150（134 kDa）[1]71．尽管已知古细菌的亚基大小非常小（约60 kDa），并且没有常见的变构调节子，但尚无来自古细菌的PEPC 序列数据[14-15]．此外，还寻找了藻类PEPC的序列数据，因为硒的纯化亚型之一是由3种不同的亚基组成的[16]，这种新的PEPC类型也在发育中的蓖麻（Ricinus communis）种子中被发现[17]．在拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组序列中确定了另一种新的进入高等植物PEPC的第4种亚型[18]，在分子大小上与蓝细菌的PEPC相似，并且缺少N端磷酸化位点，这是植物PEPC的标志．在植物和微生物界的多样性和广泛分布使得PEPC成为系统发育分析中最有趣的目标之一．对PEPC序列的比对表明，大约100个残基始终是保守的（相同的），另外100个残基是保守的具有相似的氨基酸残基的，对于成对的陆地植物酶，其识别率超过71%，因为C末端是高度保守的，所以长度的任何差异似乎是由于在N末端或内部区域（大约10个基因位点）处添加或插入了额外的序列而引起的．所制备的重组PEPCs的数量和特征仍是有限的，所涉及的物种目前不超过15个[1]71，因此有必要做进一步的工作．2 植物PEPC的分类及生理生化功能PEPC基因已大致分为2个亚家族，分为植物型PEPC（PTPC）和细菌型PEPC（BTPC）[19]11．PTPC表现出高度的遗传保守性，并在其100~110 kDa蛋白质中包含高度保守的N末端丝氨酸磷酸化基序和关键的C末端四肽QNTG[1，20]．相比较而言，116~118 kDa的BTPC蛋白质显示低序列相似性并包含1个类似原核的C端（R/K）NTG四肽基序[17，21]．PTPC典型地存在于同型四聚体-1类PEPCs中，而BTPCs作为调节和催化亚基存在于超常的异质配合物中（2类PEPCs）[2]26．PTPC又可以分为C4，C3和根特异亚型[21-22]，它们在植物细胞中发挥着不同的功能．植物中PEPC的C3，C4类型至少在3个关键方面不同[23]：（1）C4型的PEPC通过吸收C4和CAM物种中的大气CO2参与了CO2浓缩机制的第1步，C3型PEPC存在于所有植物中，它参与多种生理功能，如三羧酸循环中中间体的补给，OAA的合成以及随后的苹果酸及其衍生物的合成[2]15．（2）C4型PEPC存在于叶肉细胞中，其表达方式对实现C4光合循环具有重要意义[24]，而C3型的PEPC分布在C3和/或C4植物的不同组织中，起到管家的作用[22]865．（3）C4型PEPC的底物（PEP）饱和常数（Km）高于C3型，并且显示更多对苹果酸的耐受性，但是在一些植物物种中（如南美白菊科（Chenopodiaceae）植物和异子蓬（Suaedaaralocaspica））尚未将不同的PEPC区分为C3或C4类型，仅命名为ppc-1，ppc-2[25]，它们的功能需要进一步验证．3 植物PEPC基因的分离与克隆1953年，植物的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶从菠菜（Spinacia oleracea）叶中首次被分离出来．目前，PEPC基因已在多种植物中被鉴定和研究，拟南芥和水稻（Oryzasativa）中分别报道4，6个PEPC家族成员[18，26]，在大豆（Glycine max）中共鉴定到10个PEPC基因（GmPEPC1~10），其中GmPEPC6，GmPEPC8，GmPEPC9被铝毒、寒害、盐害等非生物胁迫诱导表达[27]．花生（Arachis hypogaea）基因组报道5个PEPC 基因（AhPEPC1~5）[28]，涂嘉琦[29]等从蔓花生（Arachis duranensis）基因组中鉴定到9个PEPC基因．马海洋[30]等从菠萝（Ananas comosus）基因组中鉴定出3个PEPC基因．邵姁[31]等从蓝莓（Vaccinium corymbosum）果实中克隆到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因VcPEPC，该基因开放阅读框全长为2 907 bp，可编码968个氨基酸，分子量为110.59 kD．赵晋锋[32]等从谷子（Setariaitalica）基因组中鉴定出1个SiPEPC基因，进一步研究表明，SiPEPC基因在拔节期和抽穗期正常光照强度下参与了对干旱胁迫的响应，推测SiPEPC基因参与了谷子对非生物逆境的应答，可能在干旱和其它逆境胁迫信号途径中起关键作用．4 植物PEPC基因在植物逆境反应中的作用非生物胁迫（如盐度、干旱、高温）通常会对植物的光合作用产生负面影响[33]901．PEPC已被建议用于支持主要的生理代谢途径（即三羧酸循环中中间体的补给等），以帮助植物和微生物避免和/或耐受极端的环境胁迫[7，34]．在水分胁迫下，PEPC介导PEP的羧基化为OAA，随后合成苹果酸和渗透活性化合物（糖、氨基酸、糖醇）以帮助植物耐受水分胁迫[34-35]．铝的积累、磷和铁的缺乏导致PEPC的上调，从而增加了包括苹果酸和柠檬酸在内的有机酸合成[36-38]．有机酸向土壤中的排泄不仅可以增加磷和铁的可溶性形态并为植物所利用，还可以与Al3+形成稳定的配合物，从而降低毒性[39]．生物应激（如病毒感染）也可以诱导PEPC的高活性，推测PEPC可以在防御作用中增强植物抗毒素、氨基酸、蛋白质的合成[40-41]．也有研究表明，番茄（Lycopersicon esculentum）PEPC基因在盐、冷、植物激素胁迫下均有不同表达[19]15．可以推测PEPC 对植物的生长发育和抗逆性起一定作用．5 PEPC基因的应用目前，已经在多种植物物种中使用了不同PEPC基因作为改善作物的手段．如在水稻中，C4-PEPC使转基因水稻具有耐旱性，但叶绿体定位的PEPC对铵同化至关重要[42]．玉米（Zea mays）C4型PEPC基因在小麦（Triticum aestivum）受体内实现了正确的转录和准确的剪接，也证明了玉米C4型PEPC基因在小麦中表现了一定的光合生理效应[43]．以转甘蔗（Saccharum officinarum）PEPC基因的籼稻植株和非转基因的植株为研究材料，发现在光合效率和产量相关性状方面，转甘蔗PEPC基因植株都有较大提高，可以实现增产目的[44]．张桂芳[45]等首次将含有稗草（Echinochloacrusgalli）根型的PEPC基因对水稻进行遗传转化，研究结果表明，转基因水稻的PEPC活性最高，为对照的5.85倍，植株叶片的净光合速率（Pn）较对照相比提高了20.0%．尹吴[46]等发现，与对照相比，转玉米PEPC基因的杨树表现出较强的光利用能力，其羧化能力和酶活性与对照相比最高可分别增加62.3%，38.6%．最近有研究表明，许多PEPC基因在增强对各种非生物和生物胁迫的耐受性中起调节作用．在干旱和盐胁迫下，PEPC的过度表达增强了耐受性[8]1513，但抑制导致转基因植物对渗透胁迫的敏感性增加[47]．同样，拟南芥AtPPC4也可能在干旱胁迫中发挥作用[33]906．然而，表达PEPC的马铃薯（Solanum tuberosum）转基因植株表现出整体有机氮含量的增加，但淀粉和可溶性糖含量有所损失[48]．6 植物组织中PEPC的活性调节PEPC通常由4个相同的亚基组成，相对分子质量约为95~110 kDa．大多数PEPC是变构酶，具有多种变构效应物，具体取决于生物的种类[1]70．此外，维管植物PEPCs通过位于N末端附近的保守丝氨酸处的可逆磷酸化来调节[49]．目前解析了来自大肠杆菌和玉米的PEPC三维结构[50-51]，这种结构信息以及通过定点诱变获得的信息为长期以来一直深入研究的催化和变构调节的分子机理提供了启示． 大多数PEPC都受变构调节，维管植物的效应仅限于一组效应类型，双子叶植物的PEPCs被葡萄糖6-磷酸（G6P）激活，并被L-苹果酸或天冬氨酸抑制，而单子叶植物的PEPC被甘氨酸或丙氨酸进一步激活[52]154．相反，大肠杆菌PEPC受更复杂的方式调节，被乙酰辅酶A、果糖1，6-双磷酸、长链脂肪酸、鸟苷3′-二磷酸5′-二磷酸激活，并被天冬氨酸或L-苹果酸抑制[53]．此外，细菌PEPC中不存在的调节性磷酸化是植物PEPC中固有的[1]73．调节性磷酸化后，PEP的半饱和浓度略有降低，而抑制剂的半饱和浓度在包含底物和Mg2+生理浓度的反应混合物中增加了约2.7倍[52]155．Tovar-Mendez[52，54-55]等采用目前可用的最明确的玉米C4-PEPC制剂进行了全面的动力学分析，从生理条件下的动力学测量清楚地表明了变构效应子和磷酸化的重要性．S形PEP饱和度曲线归因于附加的PEP与G6P位点的结合[1]73，这些研究成功地应用了变构调控的协调过渡模型来描述玉米C4-PEPC的动力学行为，并且通过快速动力学分析观察到伴随变构过渡的构象变化[56]．PEPC的活性在多个层次上受到调节．变构控制由调节PEPC活性（尤其是在细胞质pH值下）的正（葡萄糖6-P，甘氨酸）、负（L-苹果酸，天冬氨酸）效应子施加[3]280．此外，C4-PEPC通过光依赖性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶激酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase kinase，PEPCK）进行调节性磷酸化[57]．PEPC的磷酸化形式与去磷酸化形式的动力学性质不同，如更高的最大反应速率对PEP的亲和力更高，对变构效应子的敏感性有所改变，从而减轻了苹果酸对其抑制作用，并增强了其对葡萄糖-6-P和甘氨酸的活化作用[58-59]．高粱（Sorghum bicolor）中所有PTPC（SbPPC1-5）均含有带有保守丝氨酸的N末端磷酸化结构域，BTPC （SbPPC6）中不存在此域，PEPCK基因家族包括3个基因（SbPPCK1~3）[60]，在叶肉细胞中，SbPPCK1的表达是由光触发的，其转录本在叶肉中比束鞘细胞更为丰富，由于这些原因，它被认为是光合异构体，其中SbPPCK2和SbPPCK3的功能未知[61]．另一种可能调控PEPC活性的翻译后修饰（Post-translational modification，PTM）是保守的赖氨酸残基的单泛素化作用，使该酶对苹果酸和天冬氨酸更加敏感[62-64]．据报道，该PTM（仅针对C3型PEPCs）存在于蓖麻种子[62]、Hakea prostata种子[63]、高粱种子[64-65]、拟南芥叶片[65-66]中．此外，在不同的植物组织（叶片、保卫细胞、根、果实）[67-70]以及大麦（Hordeum vulgare）、小麦、高粱种子[71-74]中还报道了2条免疫反应性PTPC条带，表明上部条带是下部条带的单泛素化形式．PEPC改变了该酶的动力学特性，从而干扰了其与PEP结合的能力，并增强了其对大多数代谢物效应子的敏感性[62]29656．7 展望植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作为C4型光合途径的关键酶，对其结构特点、代谢途径已有较为深入的研究[75]．现在PEPC基因已经在越来越多的植物中被发现，并对其功能进行研究探索．在C4和CAM植物中，PEPC的作用以及其基因表征信息比较详细，但在C3植物中PEPC表达的细节报道很少，仍需进一步探索．转PEPC基因植物也在不同方面表达出PEPC基因对植物的调控功能，PEPC作为植物中广泛存在的酶，其在植物应对环境胁迫过程中的作用逐渐被发现，尤其是CAM植物中的大多数物种具有较高抗逆性，而这之中PEPC的相关功能机制还有待进一步挖掘，因此有必要进一步对PEPC基因在植物抗逆性研究中的作用进行详细探索．参考文献：[1] Izui K，Matsumura H，Furumoto T，et al．Phosphoenolpyruvate carboxylase：a new era of structural biology[J]．Annual reviewof plant biology，2004，55：69-84[2] O′Leary B，Park J，Plaxton W C．The remarkable diversity of plant PEPC（phosphoenolpyruvate carboxylase）：recent insightsinto the physiological functions and post-translational controls of non-photosynthetic PEPCs[J]．The biochemical 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2. 实验试剂：50mM ATP溶液，50mM磷酸肌酸溶液，0.2mM NaHCO3溶液，160U/ml 磷酸肌酸激酶溶液，160U/ml磷酸甘油酸激酶溶液，160U/ml磷酸甘油醛脱氢酶溶液（U为酶活力单位），25mM RuBP溶液，5mM NADH，Rubisco提取介质（40mM Tris-HCl缓冲液，pH7.6，内含10mM MgCl2溶液，0.25mM EDTA，5mM谷胱甘肽），反应介质（0.1M Tris-HCl缓冲液，pH7.8，内含12mM MgCl2溶液，0.4mM EDTA）。

3实验步骤3.1 酶粗提液的准备取新鲜洗干净的条斑紫菜的丝状体和条斑紫菜的叶状体各1克，加入预冷的提取介质1ml，冰浴研磨10min，将样品在40C，10,000×g离心10min，弃沉淀；上清夜即是酶粗提液，置于00C备用（王维光，1985；张志良等，2003）。

3.3.2 Rubisco酶活力的测定按下表配制反应体系：试剂加入量ml5mM NADH 0.250mM ATP 0.2酶提取液0.150mM磷酸肌酸0.20.2mM NaHCO30.2反应介质1.4160U/ml磷酸肌酸激酶0.1160U/ml磷酸甘油酸激酶0.1160U/ml磷酸甘油醛脱氢酶0.1双蒸水0.3将配制好的反应体系混匀，倒入比色杯内，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计计上测量340nm处反应体系的OD值，作为零点值。

将0.1mlRuBp加入比色杯内，立即计时，每隔20s测一次OD值，共测3min。

以零点到第1min 的OD值下降的绝对值计算酶活力。

由于酶提取液中可能存在3-磷酸甘油酸（PGA），会使酶活力的测定产生误差，因此除上述测定外还需做一个不加RuBp的对照。

对照的反应体系与上述酶的反应体系完全一样，所不同的仅仅是把酶提取液放在最后加，加入后马上测定此反应体系340nm处的OD值，并记录前1min内OD值的变化量。

二氧化碳测定试剂盒(PEPC法)适用范围：本品用于体外定量测定人血清中二氧化碳的含量。

1.1规格规格1: （试剂1：30mL）；规格2: （试剂1：60mL）；规格3: （试剂1：90mL）；规格4：（试剂1：120mL）；校准品：（选配）规格1（0.3mL×1；1水平)；规格2（0.5mL×1；1水平)；规格3（1.0mL×1；1水平)；质控品：（选配）规格1（0.5mL×2；2水平)；规格2（1.0mL×2；2水平)。

1.2组成试剂盒组成见表1表1 二氧化碳测定试剂盒组成注：校准品及质控品赋值具有批特异性，每批次浓度详见标签。

2.1试剂2.1.1外观试剂盒外观应整洁，文字符号标识清晰；组分齐全，液体无漏液；试剂1为浅黄色透明液体，不得有沉淀和絮状物。

2.1.2装量每瓶不少于标示值。

2.1.3试剂空白吸光度用指定的空白样品测试试剂（盒），在光径1cm下，在A405nm处测定试剂空白吸光度A≥0.8。

2.1.4分析灵敏度测定在29 mmol/L范围内的样品，吸光度变化绝对值大于0.05A。

2.1.5线性范围2.1.5.1在[0.5,50] mmol/L内,相关系数R≥0.990。

2.1.5.2在[0.5,15] mmol/L内，线性绝对偏差不超过±1.5mmol/L；(15,50] mmol/L内，线性相对偏差不超过±10%。

2.1.6 重复性重复测试（18±3.6）mmol/L和（34±6.8）mmol/L样本，所得结果的变异系数（CV%）应不大于5%。

2.1.7批间差测定（18±3.6）mmol/L和（34±6.8）mmol/L样本，所得结果的批间相对极差（R）应不大于10%。

2.1.8准确度）中加入一定体积高于50 mmol/L的碳酸氢钠纯在正常浓度范围的临床样本（C品（Cs）或由纯品配制的标准溶液，回收率应在90%-110%范围内。

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Fructoneoxidase，简称FOXO）是一类非常重要的蛋白质，它可以将磷酸烯醇丙酮（fructone）氧化到羧酸（formate），为细胞提供能量。

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有重要的生理学功能，比如调节细胞内葡萄糖代谢、影响衰老和促进细胞凋亡等。

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶主要在细胞内部发挥作用，是建立和维持正常的细胞代谢的重要组成部分。

在细胞在高糖水平下，FOXO启动磷酸烯醇丙酮酸羧化过程，将其氧化到羧酸，提供细胞有利的热能量。

其过程可以自动由FOXO来控制，也可以被外界刺激因素如亚硝酸、钙离子和谷胱甘肽等信号调节。

FOXO也可以调节细胞内葡萄糖代谢，当糖水平过高时，FOXO可以抑制糖异构酶糖原合成酶，启动糖酵解反应，并促进肝细胞内糖的代谢，从而降低体内的血糖水平。

FOXO也可以影响衰老，当FOXO水平低时，细胞可能更容易衰老，而FOXO水平高时，细胞可以抵抗衰老。

此外，FOXO还可以促进细胞凋亡，它可以抑制一些凋亡抑制蛋白，从而有效地促进细胞凋亡。

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶在很多生理活动中发挥着重要的作用，它参与细胞内的热能生成，影响细胞的衰老和凋亡，调节葡萄糖代谢，从而支持细胞正常的生长和运转。

由于FOXO的多功能性和作用深远，它在抗衰老、抗癌、肥胖和代谢性疾病等领域得到了广泛的研究和应用。

研究表明，FOXO介导的磷酸烯醇丙酮酸羧化反应是细胞内非常重要的代谢途径，有助于细胞内机能的平衡调节，保证细胞正常的运转。

最近，FOXO被用来设计药物治疗肥胖，糖尿病，动脉硬化，癌症等疾病，在这些疾病之中发挥着重要的作用。

综上所述，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（FOXO）可以将磷酸烯醇丙酮（fructone）氧化到羧酸（formate），为细胞提供能量，参与细胞内热能生成、影响细胞衰老、凋亡以及调节葡萄糖代谢等等，是建立和维持正常细胞代谢的重要组成部分。

FOXO还可以用来治疗肥胖，糖尿病，动脉硬化，癌症等疾病，具有重要的治疗意义。