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人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建

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第２８卷　２Ｏｏ７年　第３期　５月　中山大学学报（医学科学版）　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＳＵＮ　ＹＡＴ—ＳＥＮ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＭＥＤＩＣＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥＳ）　Ｖｏｌ－２８　Ｎｏ．３　Ｍａｖ　２００７　

人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建　

张志　，黄宗青　，沈琪　，刘洪涛　，邓英太　，李爱东　，周国强　，汪华侨　，何蕴韶　

（１．广东医学院附属深圳第四人民医院神经内科，广东深圳５１８０３３；２．中山大学中山医学院人体解剖学　

教研室脑研究室：３．中山大学达安基因诊断中心，广东广州５１００８０）　

摘　要：　【目的】克隆健康人苯丙氨酸羟化酶基因全长ｅＤＮＡ序列，构建并鉴定其原核表达质粒　

ｐＴｒｅＨｉｓＢ／ＰＡＨ。【方法】采用ＲＴ—ＰＣＲ方法从人肝组织中扩增ＰＡＨ基因全长ｃＤＮＡ，Ｔ／Ａ克隆到ｐＭＤ１８一Ｔ载　

体中，双酶切后将ｃＤＡ亚克隆入ｐＴｒｅＨｉｓＢ载体，构建ｐＴｒｅＨｉｓＢ／ＰＡＨ质粒，经限制性内切酶鉴定并测序。【结　

果】人ＰＡＨ基因ｃＤＮＡ正确克隆入ｐＴｒｅＨｉｓＢ表达载体，与Ｇｅｎｅｂａｎｋ中ＰＡＨ基因序列一致。【结论】成功构建　ｐＴｒｅＨｉｓＢ／ＰＡＨ表达质粒。为进一步进行研究ＰＡＨ蛋白表达和重组蛋白活性鉴定奠定基础。　

关键词：苯丙酮尿症；苯丙氨酸羟化酶；克隆；原核表达质粒　中图分类号：Ｒ４７９．１　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７２—３５５４（２０ｏ７ｌ０３—０２８８—０４　

Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　Ｇｅｎｅ　ａｎｄ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　

Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　

ＺＨＡＮＧ　Ｚｈｉ　，ＨＵＡＮＧ　Ｚｏｎｇ－ｑｉｎｇ　，ＳＨＥＮ　Ｑｉ　，ＬＩＵ　Ｈｏｎｇ－ｔａｏ　，ＤＥＮＧ　Ｙｉｎｇ－ｔａｉ　，ＬＩ　Ａｉ－ｄｏｎｇ　，　

ＺＨＯＵ　Ｇｕｏ－ｑｉａｎｇ　，ＷＡＮＧ　Ｈｕａ－ｑｉａｏ　，ＨＥ　Ｙｕｎ－ｓｈａｏ　

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｆｕｔｉａｎ　Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，５１８０３３，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｎａｔｏｍｙ　ａｎｄ　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３．Ｃｅｎ￣ｒ　ｏｆ　Ｄａａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，　

ＳＵＮ　Ｙａｔ—ｓｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１００８０，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｏ　ｃｌｏｎｅ　ｈｕｍａｎ　ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＰＡＨ）ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ａ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】Ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＰＡＨ　Ｇｅｎｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｆｒｏｍ　ｈｅａｌｔｈ　ｈｕｍａｎ　ｌｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐＭＤ１８一Ｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ｂｙ　Ｔ／Ａ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ａｆｔｅｒ　ｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ．ＰＡＨ　ｃＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｗａｓ　ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ　

ｉｎｔｏ　ｐＴｒｃＨｉｓＢ　ｖｅｃｔｏｒ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ａ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄ．　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｃｏｎｆｏｒｎｌ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ．　【Ｒｅｓｕｌｔｓ】Ｔｈｅ　ｆｕｌｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ＰＡＨ　ｃＤＮＡ　ｗａｓ　ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ，ａｎｄ　ｉｔｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｗａｓ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｒｅｐｏｒｔｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｇｅｎｅｂａｎｋ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｔｈｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ａ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　

ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ；ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ；ｃｌｏｎｅ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄ　【Ｊ　ＳＵＮ　Ｙａｔ－ｓｅｎ　Ｕｎｉｖ（Ｍｅｄ　Ｓｃｉ）＇２００７，２８（３）：２８８—２９１】　

苯丙酮尿症（ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ，ＰＫＵ）是神经科　

常见氨基酸代谢障碍的常染色体隐性遗传病。　

９８％～９９％是由于苯丙氨酸羟化酶（ｐｈｅｎｙｌＭａｎｉｎｅ　

ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，ＰＡＨ）基因突变导致肝脏苯丙氨酸羟　

化酶活性降低而致病【”。当前的基因治疗为本病治　

疗提供了崭新的思路［２１。国外学者已经在ＰＫＵ小　

鼠模型上用腺病毒载体转导ＰＡＨ进行基因治疗　

获得一定的成功，但是始终未能解决生物安全和　如何长期稳定表达等问题【　／ｑ，阻碍了这种方法的临　

床推广和应用。本研究旨在通过体外原核表达活　

性ＰＡＨ蛋白，开发新型ＰＫＵ基因治疗药物。改进　

当前ＰＫＵ治疗单纯依靠饮食控制的现状。我们采　

用基因工程重组技术从健康人肝细胞中定向克隆　

出人ＰＡＨ基因，构建ｐＴｒｃＨｉｓＢＰＡＨ原核表达质粒　

并进行鉴定，为以后ＰＡＨ蛋白的体外表达打下基　

础，结果报道如下。　

收稿日期：２００６—１１－０２　基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）项目（２００６ｃｂ５００７００）　作者简介：张志（１９７１－），男，安徽安庆人，博士，主治医师；何蕴韶，教授，博士导师，通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈ０７５５＠１２６．

ｃｏｍ　维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com 第３期　张　志，等．人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建　２９１　

做了大量的工作，发现了很多新的突变『８】。迄今全　

世界共发现７Ｏ余种致病突变，导致ＰＡＨ酶的催　

化功能减弱或消失，引起体内苯丙氨酸的蓄积致　

病　０】。　

我们于２００３年采用荧光ＰＣＲ技术成功建立　

经典型ＰＫＵ的基因诊断方法［１１】。鉴于目前国内外　

研究ＰＫＵ基因治疗的报道尚少，为了探讨ＰＫＵ的　

新型基因治疗方法，弥补ＰＫＵ治疗的缺陷，本研　

究采用基因工程技术，根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ中　

ＰＡＨｃＤＮＡ序列，自行设计一对引物，分别在引物５　

端和３　端设计　ｎＩ和肪ｏＲＩ酶切识别位点，并添　

加保护碱基。扩增包括目的基因在内的全部序列，　

ＰＣＲ产物克隆入ｐＭＤ１８一Ｔ载体构建ｐＭＤ１８一Ｔ／　

ＰＡＨ质粒，ＫｐｎＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切鉴定后全长测序　

证实ｐＭＤ１８一Ｔ／ＰＡＨ质粒序列完整、正确，即包含　

起始密码、终止密码及两端的　ｎＩ和肪ｏＲＩ识别　

序列。ｐＭＤ１８一Ｔ／ＰＡＨ质粒双酶解消化，目的基因　

片段定向克隆入ｐＴｒｃＨｉｓＢ表达载体，蓝白斑筛选　

挑白色菌落，ＰＣＲ初筛后转化入ＴＯＰ１０菌体中扩　

增，抽提重组质粒，　ｎ　Ｉ和肪ｏＲ　Ｉ双酶解鉴定，　

最后全长测序。测序结果表明我们获得的　

ｐＴｒｃＨｉｓＢ／ＰＡＨ质粒序列与ＧｅｎｅＢａｎｋ上ＰＡＨ基因　

ｃＤＮＡ序列（ＧＩ：１８７６５８８４１一致，且ｐＴｒｃＨｉｓ／ＰＡＨ质　

粒中５　端起始密］ｉ￣Ｔ＇（ＡＴＧ）和３　端终止子（ＴＡＡ１及　

两侧ＫｐｎＩ和ＥｃｏＲＩ限制性内切酶的识别序列均　

完整，序列和方向完全正确，未见框移和突变，表　

达质粒的成功构建为下一步重组蛋白的表达和纯　

化研究奠定了坚实的基础。目前，该重组质粒的表　

达及其重组蛋白的活性鉴定研究正在进行之中　

参考文献　

【２】　张　志，何蕴韶．苯丙酮尿症分子遗传学研究进展【Ｊ】．　

遗传，２００４，２６（５）：７２９—７３４．　

ＤＩＮＧ　Ｚ，ＨＡＲＤＩＮＧ　Ｃ　Ｏ，ＴＨＯＮＹ　Ｂ．Ｓｔａｔｅ—ｏｆ—ｔＩｌｅ—ａｒｔ　

２００３　ｏｎ　ＰＫＵ　ｇｅｎｅ　ｔｈｅｒａｐｙ【Ｊ１．Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ　Ｍｅｔａｂ，２００４，　８１（１）：１—２．　【３】ＨＡＲＤＩＮＧ　Ｃ　Ｏ，ＧＩＬＬＩＮＧＨＡＭ　Ｍ　Ｂ，ＨＡＭＭＡＮ　Ｋ，ｅｔ　

ａ１．　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｐｅｒｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｍｉａ　

ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｌｉｖｅｒ—ｄｉｒｅｃｔｅｄ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＡＡＶ２／８　ｖｅｃｔｏｒ—　

ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｉｎ　ｍｕｒｉｎｅ　ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ【Ｊ１．　

Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ，２００６，１３（５）：４５７—４６２．　

【４】　ＯＨ　Ｈ　Ｊ，ＬＥＥ　Ｈ，ＰＡＲＫ　Ｊ　Ｗ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｖｅｒｓａｌ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ　

ａｆｔｅｒ　ａｄｅｎｏ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　

ｔｈｅｒａｐｙ【Ｊ１．Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ　Ｍｅｔａｂ，２００５，８６　Ｓｕｐｐｌ　１：Ｓ１２４—　

３２．　【５】　ＷＯＯ　Ｓ　Ｌ　Ｃ，ＬＩＤＳＫＹ　Ａ　Ｓ，ＧＵＴＹＬＥＲ　Ｆ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．　

Ｃｌｏｎｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　

ａｌｌｏｗｓ　ｐｒｅｎａｔａｌ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ【Ｊ１．Ｎａｔｕｒｅ，１９８３，３０６（１）：１５１－　１５５．　

【６】　ＳＣＲＩＶＥＲ　Ｃ　Ｒ，ＷＡＴＥＲＳ　Ｐ　Ｊ，ＳＡＲＫＩＳＳＩＡＮ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．　

ＰＡＨｄｂ：　ａ　ｌｏｃｕｓ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ　ｂａｓｅ【Ｊ１．Ｈｕｍ　Ｍｕｔａｔ，２０ｏ０，１５（１）：９９—１０４．　

【７】　ＳＣＲＩＶＥＲ　Ｃ　Ｒ，ＨＵＲＴＵＢＩＳＥ　Ｍ，ＫＯＮＥＣＫＩ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．　

ＰＡＨｄｂ　２００３：ｗｈａｔ　ａ　ｌｏｃｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ　ｃａｎ　ｄｏ【Ｊ１．Ｈｕｍ　Ｍｕｔａｔ，２００３，２１（５）：３３３—３４４．　【８】　孟峻，张军力．内蒙古经典型苯丙酮尿症ＰＡＨ基因　

外显子ｌ１突变的检测【Ｊ】．内蒙古医学院学报，２００６，　

２８（３）：１７８－１８０．　

【９１　ＷＡＴＥＲＳ　Ｐ　Ｊ．Ｈｏｗ　ＰＡＨ　ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｃａｕｓｅ　ｈｙｐｅｒ－　ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｍｉａ　ａｎｄ　ｗｈｙ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｍａｔｔｅｒｓ：　ｉｎｓｉｇｈｔｓ　

ｆｒｏｍ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ【Ｊ１．Ｈｕｍ　Ｍｕｔａｔ，２００３，２１（６）：　

３５７—３６９．　

【１０】　ＬＵＩ正ＹＡＰ　Ｈ　Ｕ，ＡＬＰｒＥＫＩＮ　Ｄ，ＰＡＺＡＲＢＡＳＩ　Ａ，ｅｔ　ａ１．　Ｔｈｅ　ｉｍｐｏ￣ａｎｃｅ　ｏｆ　ａｒｇｉｎｉｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　

ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　ｇｅｎｅ【Ｊ１．Ｍｕｔａｔ　Ｒｅｓ，２００６，６０１（１－２）：３９－４５．　【ｌ１】　张志，何蕴韶，闫宗合，等．荧光ＭＧＢ探针实时ＰＣＲ　

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人β2微球蛋白成熟肽基因克隆及其原核表达载体的构建

人β2微球蛋白成熟肽基因克隆及其原核表达载体的构建

第４４卷　

２Ｏ１０年　第１期　

２月　河南农业大学学报　

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｎａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｖＯ１．４４　ＮＯ．１　

Ｆｅｂ．　２ＯｌＯ　

文章编号：１０００—２３４０（２０１０）０１—００９１—０５　

人　微球蛋白成熟肽基因克隆　

及其原核表达载体的构建　

张　蕾，李新生，崔保安，陈红英，魏战勇，孙　凯，宋亚鹏，阮武营　

（河南农业大学牧医工程学院，河南郑州４５０００２）　

摘要：根据ＧｅｎＢａｎｋ基因库中人Ｂ２微球蛋白（１３２ｍ）成熟肽基因序列设计２对引物，使用ＲＴ—ＰＣＲ法从健康人血　液中扩增人［３２ｍ成熟肽基因，扩增产物进行Ｔ—Ａ克隆和测序．结果表明，获得的人［３２ｍ成熟肽基因为２９７　ｂｐ，与　模板序列的同源性为１００％．利用基因重组技术，将［３２ｒｎ成熟肽基因亚克隆入ｐＥＴ一２８ａ（＋）载体中，经ＰＣＲ、酶　切和测序鉴定，证实所获重组表达质粒ｐＥＴ一２８／Ｈｕｍ［３２ｍ中含有目的片段，且连接、构建正确，表明成功构建了　

重组表达质粒ｐＥＴ一２８／ＨＵｌＴＩ［３２ｍ．　关键词：人Ｂ２微球蛋白；克隆；原核表达载体　中图分类号：Ｑ９３９．９２　文献标志码：Ａ　

Ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　

Ｈｕｍａｎ　－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｃｈａｉｎ　ｍａｔｕｒｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｇｅｎｅ　

ＺＨＡＮＧ　Ｌｅｉ，ＬＩ　Ｘｉｎ—ｓｈｅｎｇ，ＣＵＩ　Ｂａｏ—ａｎ，ＣＨＥＮ　Ｈｏｎｇ—ｙｉｎｇ，ＷＥＩ　Ｚｈａｎ—ｙｏｎｇ，ＳＵＮ　Ｋａｉ，　

ＳＯＮＧ　Ｙａ—ｐｅｎｇ，ＲＵＡＮ　Ｗｕ—ｙｉｎｇ　

（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ　ａｎｄ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｎａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　

Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ　４５０００２，Ｃｈｉｎａ）　

人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建

人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建

第２８卷　２Ｏｏ７年　第３期　５月　中山大学学报（医学科学版）　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＳＵＮ　ＹＡＴ—ＳＥＮ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＭＥＤＩＣＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥＳ）　Ｖｏｌ－２８　Ｎｏ．３　Ｍａｖ　２００７　

人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建　

张志　，黄宗青　，沈琪　，刘洪涛　，邓英太　，李爱东　，周国强　，汪华侨　，何蕴韶　

（１．广东医学院附属深圳第四人民医院神经内科，广东深圳５１８０３３；２．中山大学中山医学院人体解剖学　

教研室脑研究室：３．中山大学达安基因诊断中心，广东广州５１００８０）　

摘　要：　【目的】克隆健康人苯丙氨酸羟化酶基因全长ｅＤＮＡ序列，构建并鉴定其原核表达质粒　

ｐＴｒｅＨｉｓＢ／ＰＡＨ。【方法】采用ＲＴ—ＰＣＲ方法从人肝组织中扩增ＰＡＨ基因全长ｃＤＮＡ，Ｔ／Ａ克隆到ｐＭＤ１８一Ｔ载　

体中，双酶切后将ｃＤＡ亚克隆入ｐＴｒｅＨｉｓＢ载体，构建ｐＴｒｅＨｉｓＢ／ＰＡＨ质粒，经限制性内切酶鉴定并测序。【结　

果】人ＰＡＨ基因ｃＤＮＡ正确克隆入ｐＴｒｅＨｉｓＢ表达载体，与Ｇｅｎｅｂａｎｋ中ＰＡＨ基因序列一致。【结论】成功构建　ｐＴｒｅＨｉｓＢ／ＰＡＨ表达质粒。为进一步进行研究ＰＡＨ蛋白表达和重组蛋白活性鉴定奠定基础。　

关键词：苯丙酮尿症；苯丙氨酸羟化酶；克隆；原核表达质粒　中图分类号：Ｒ４７９．１　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７２—３５５４（２０ｏ７ｌ０３—０２８８—０４　

Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　Ｇｅｎｅ　ａｎｄ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　

Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　

ＺＨＡＮＧ　Ｚｈｉ　，ＨＵＡＮＧ　Ｚｏｎｇ－ｑｉｎｇ　，ＳＨＥＮ　Ｑｉ　，ＬＩＵ　Ｈｏｎｇ－ｔａｏ　，ＤＥＮＧ　Ｙｉｎｇ－ｔａｉ　，ＬＩ　Ａｉ－ｄｏｎｇ　，　

ＺＨＯＵ　Ｇｕｏ－ｑｉａｎｇ　，ＷＡＮＧ　Ｈｕａ－ｑｉａｏ　，ＨＥ　Ｙｕｎ－ｓｈａｏ　

过量表达黄烷酮3-羟化酶基因(AaF3H)提高青蒿中青蒿素的含量

过量表达黄烷酮3-羟化酶基因(AaF3H)提高青蒿中青蒿素的含量

过量表达黄烷酮3-羟化酶基因(AaF3H)提高青蒿中青蒿素的含量

张婷婷;马嘉伟;王路尧;唐克轩;李杉;赵静雅

【摘 要】黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)是参与黄酮类化合物合成过程的一个关键酶.为了研究青蒿中F3H对青蒿素的影响,从青蒿中克隆到黄烷酮3-羟化酶基因(AaF3H),全长为1 095 bp,编码364个氨基酸.SouthernBlot证实AaF3H基因在青蒿基因组中只有1个拷贝.通过构建AaF3H过表达载体并稳定转化青蒿来获得转基因株系,再采用HPLC测定过量表达AaF3H的转基因青蒿植株中的青蒿素含量.结果表明,过表达AaF3H转基因青蒿植株中青蒿素的含量显著升高.通过实时荧光定量PCR分析,在转基因青蒿中,作为青蒿素合成的关键酶,紫穗槐-4,11-二烯合成酶基因(AaADS)、紫穗槐-4,11-二烯氧化酶基因(AaCYP71AV1)和青蒿醛△11(13)双键还原酶基因(AaDBR2)的表达量显著提高.研究结果表明过量表达AaF3H基因是提高青蒿中青蒿素含量的有效方法.

【期刊名称】《生物技术进展》

【年(卷),期】2018(008)001

【总页数】8页(P55-62)

【关键词】青蒿;黄烷酮3-羟化酶;过量表达;青蒿素

【作 者】张婷婷;马嘉伟;王路尧;唐克轩;李杉;赵静雅

【作者单位】上海交通大学农业与生物学院,交大-复旦-诺丁汉植物生物技术研发中心,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,交大-复旦-诺丁汉植物生物技术研发中心,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,交大-复旦-诺丁汉植物生物技术研发中心,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,交大-复旦-诺丁汉植物生物技术研发中心,上海200240;华南理工大学生物科学与工程学院,广州510006;上海交通大学农业与生物学院,交大-复旦-诺丁汉植物生物技术研发中心,上海200240

L-色氨酸

L-色氨酸

L-色氨酸的生产及其代谢控制育种

摘要 本文综述了利用微生物生产L-色氨酸的各种方法和L-色氨酸的生物合成途径及其代谢调控机制，并介绍了利用重组DNA技术选育L-色氨酸高产菌的研究现状。

L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，为白色或略带黄色叶片状结晶或粉末，水中溶解度1.l4g(25℃)，溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解。微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。它是人体和动物生命活动中必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料等方面。在生物体内，从-色氨酸出发可合成5-羟基色胺等激素以及色素、生物碱、辅酶、植物激素等生理活性物质，可预防和治疗糙皮病，同时具有消除精神紧张、改善睡眠效果等功效。色氨酸代谢失凋会引起糖尿病和神经错乱，因此在医学上被用作氨基酸注射液和复合氨基酸制剂。另外，由于色氨酸是一些植物蛋白中比较缺乏的氨基酸，用它强化食品和做饲料添加剂对提高植物蛋白质的利用率具有重要的作用，它是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸。

1.色氨酸的生产方法

色氨酸的生产最早主要依*化学合成法和蛋白质水解法，但是随着对微生物法生产色氨酸研究的不断深入，这种方法已经走向实用并且处于主导地位。微生物法大体上可以分为直接发酵法、微生物转化法和酶法。近年来还出现了将直接发酵法与化学合成法相结合、直接发酵法与转化法相结合生产色氨酸的研究。另外，重组DNA技术在微生物育种和酶工业上的应用极大地推动了直接发酵法和酶法生产色氨酸的工业化进程。

1.1微生物转化法

亦称前体发酵法。这种方法使用葡萄糖作为碳源，同时添加合成色氨酸所需的前体物如邻氨基苯甲酸、吲哚等，利用微生物的色氨酸合成酶系来合成色氨酸。这种方法同直接发酵法一样，需要解除生物合成途径中大部分酶所受到的反馈调节，以使色氨酸能够高浓度蓄积。另外，所添加的前体物大都是抑制微生物生长的，因此添加量不可过高，一般采取分批少量添加的方法。同时可以筛选前体物的抗性突变株来提高前体物的添加量。例如采用枯草杆菌的5-FT抗性突变株SD-9在15L含6%葡萄糖的培养基中培养，在培养过程中每次添加少量6%的邻氨基苯甲酸溶液共2L，经120h后可生产色氨酸9.6g/L。微生物转化法的不足在于当转化液中前体物浓度较高时，转化率有所下降。另外，前体物的价格比较昂贵，不利于降低成本。