质粒DNA及λDNA的酶切、连接、转化及重组子的筛选鉴定

质粒DNA及λDNA的酶切、连接、转化及重组子的筛选鉴定

陈倩倩 交流生 118627140313

一、实验目的：

1、学习和掌握限制性内切酶的特性

2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法

3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法

4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法

5、掌握α互补筛选法的原理

6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法

7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法

二、实验原理:

重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。

限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒等DNA分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。

DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。T4 DNA连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。

目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种：

（一）、具互补粘性末端片段之间的连接

（二）、平末端的连接

所谓受体细胞（receptor cell）又称为宿主细胞或寄主细胞（host cell）等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。显然，并不是所有的细胞都可用作受体细胞。一般情况下，受体细胞的选择应符合以下基本原则：

（1）便于重组DNA分子的导入；（2）能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；（3）便于重组体的筛选；（4）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长；（5）安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；（6）选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达；（7）受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性；（8）具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；（9）在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。以上是受体细胞选择的总原则，在实际应用过程中，可根据具体需要或用途而重点考虑其中部分要求即可。

原核生物细胞: 是较为理想的受体细胞类型，其原因是：

（1）大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA进入；（2）没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦；（3）基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析；（4）原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。

鉴于上述原因，原核生物细胞普遍作为受体细胞用来构建基因组文库和cDNA文库，或者用来建立生产目的基因产物的工程菌，或者作为克隆载体的宿主菌。至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌等。大肠杆菌是迄今为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。

以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可能机制包括如下基本步骤：

（1）细菌感受态的形成；（2）转化因子的吸收；（3）整合复合物前体的形成；（4）单链DNA转化因子的整合；（5）转化子的形成。

Ca2诱导的转化：细菌处于容易吸收外源DNA状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内。其原理是将处于对数生长期的细菌置于0℃，CaCL2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，同时Ca2 使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入DNA，Ca2 又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（Dnase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。 Ca2处理的感受态细胞，一般每微克DNA能获得105～106个转化子，环化重组子分子愈小，转化率愈高，环状DNA分子比线性DNA分子的转化率高1000倍。

转化子的筛选以及鉴定：在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致。因此，如何将被 转化细胞从大量受体菌细胞中初步筛选出来，然后进一步检测到含有期待重组 DNA分子的克隆子将直接关系到基因克隆和表达的效果，也是基因克隆和工程操作中极为重要的环节。

通常我们将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子，而含有重组DNA分子的转化子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子。

在构建基因工程载体系统时，载体DNA分子上通常携带了一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特性，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。一般的做法是将转化处理后的菌液（包括对照处理）适量涂布在选择培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间，观察菌落生长情况，即可挑选出转化子。

在本实验中利用的是麦康凯培养基，用来筛选重组子。质粒PUC19进入E.coliDH5α后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基的平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，PH降低培养基中的指示剂变红，转化子的菌落变成红色。而含有外源基因片段的PUC质粒进入受体细胞后，不能形成互补的β-半乳糖苷酶活性而出现白色菌落，这样根据这个条件即可筛选重组子。

三、实验材料以及仪器

PUC19的质粒、LB培养基、麦康凯培养基 提取质粒试剂盒

恒温振荡培养箱，高速离心机，旋涡振荡器，水浴锅，酒精灯，微波炉，天平，电子天平，分析天平，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendorf管，微量移液器，手套，记号笔。

LB培养基，抗生素氨苄青霉素，TAE电泳缓冲液(10×)，琼脂糖，50×TAE缓冲液，溴化乙锭(EB)， DNA相对分子质量标准物DNA Marker k／HindⅢ

四、实验步骤

1，质粒DNA，λDNA酶切，电泳检测 目的说明与现象及其解释 ①质粒DNA酶切：λDNA 5μl ，10×缓冲溶液 3μl，重蒸水：20μl，HindⅢ：2μl 此为载体与目的基因用同种酶切出相同的粘性末端，相同的粘性末端之间在连接酶的作用下可以连接到一起

加样次序：重蒸水，Buffer，DNA ②λDNA酶切：重组pUC19 DNA 3.5μl，10×缓冲溶液 1.5μl，重蒸水：9μl HindⅢ：1μl酶37℃ 1h

③电泳检测： 电泳确检验酶切是否成功，以便继续后续试验。

下图为酶切结果

此次检验酶切失败可能原因有：1，电泳点样失误

2，λDNA保存或是加样时受到污染，导致后加的酶失活

2，连接

λDNA/HindⅢ 2μl，puc19/HindⅢ 2μl，Buf 1μl，重蒸水 1μl

Ligase：1μl，16℃连接过夜。 在连接酶的作用下，具有相同粘性末端的质粒与具有相同粘性末端的DNA片段连接，可能连接方式有，λDNA与λDNA，质粒与质粒，质粒与λDNA

3，感受态细胞制备

Ecoil DH5α——20ml LB液体培养基（37℃培养过夜）——转接至20mlLB培养基（37℃培养2—2.5h）——1.5ml×2管，2000rpm 5min——重复收集菌体一次——弃上清，加1ml0.1mol/L氯化钙，混匀——冰浴15min——离心，弃上清，吸干上清——加100μl氯化钙冰浴 用第二次培养2—2.5h的菌体，原因为此时的细胞在生长的对数期，生命最旺盛，导入外源基因后继续生长；氯化钙使细胞壁的通透性增加，便于外源基因的导入

4，转化实验 此为我组酶切后的结果，由条带可知酶切不成功，所以后述实验为老师备用λDNA酶切片段 感受态 1、50ml感受态细胞

细胞 2、50ml感受态细胞＋Puc19 2μl

3、100μl感受态细胞＋连接液10μl

冰浴30min——42℃2min——冰浴5min——加液体LB500μl

37℃1h——涂布平皿

麦康凯 1，分别在加和没加氨苄青霉素平板接种感受态细胞1

培养基 2，加氨苄青霉素平板接种感受态细胞2

3，加氨苄青霉素平板分别接种感受态细胞3

20μl ，50μl，100μl150μl，200μl

37℃ 24h 感受态细胞一，为没有导入重组Puc19质粒的对照实验

感受态细胞二，为导入的质粒不是全部含有外源基因质粒的对照试验

感受态细胞三，用于选出既导入Puc19质粒且所有Puc19质粒均含有外源片段的细胞

因为不清楚在哪个浓度下既可以得到重组子，又可以使其为但菌落存在，所以需要设置梯度

5，重组子鉴定

白色转化子——麦康凯平板+氨苄青霉素培养基 Puc19带有氨苄青霉素抗性基因，未导入 Puc19的受体细胞在含有氨苄青霉素的培养基上不生长；质粒PUC19进入E.coliDH5α后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基的平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，PH降低培养基中的指示剂变红，转化子的菌落变成红色。而含有外源基因片段的PUC质粒进入受体细胞后，不能形成互补的β-半乳糖苷酶活性而出现白色菌落。

6，重组DNA提取

白色转化子（一环）——接种至20mlLB培养基（37℃培养过夜）——取3ml菌液用试剂盒提取质粒菌液1.5ml——10000rpm 1min弃上清，重复一次，弃上清，吸干上清——加250μl溶液一，充分悬浮细胞——加250μl溶液二，轻轻反转，倒置数次至获得透明裂解液（室温）——加350μl溶液三，立即翻转倒置数次至絮状沉淀生成——12000rpm离心10min——小心吸取上清液至柱中（置于收集管上）10000rpm离心1min，弃管中液体——加500μlBufHB柱中10000rpm

1min，弃管中液体——加700μlDNA Wash Buf10000rpm 1min——重复洗一次——空柱干燥10000rpm 2min——空柱置于新管上，加50μlElution Buf于柱中心，室温12000rpm 2min