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双缩脲法测定蛋白质26页PPT

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【医学课件】 双缩脲法测定血清蛋白

【医学课件】 双缩脲法测定血清蛋白
三、试剂 1. 溴甲酚绿试剂 BCG
2. 60g/L蛋白标准液
三、试剂 1. 6mol/LNaOH
2. 双缩脲试剂
3. 双缩脲空白试剂
4. 60－70g/L标准液
四、操作
Bl
0.1
0.1
蛋白标准液
0.1
蒸留水
0.1
空白试剂
5.0
双缩脲试剂
5.0
5.0
5.0
混匀置25℃30分钟或37℃10分钟，蒸留水调零在540nm处 比色，测各管吸光度 五、 计算 血清总蛋白(g/L)
实验三、双缩脲法测定血清蛋白
一、目的
二、原理 血清中蛋白质的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液 中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物，这 种 紫 红 色 络 合 物 在 540nm 处 有 明 显 的 吸 收 峰 ， 吸 收 峰 在一定范围内与血清中蛋白含量成正比，与同样方法 处理的蛋白标准液比较求得其含量。
=(AU-ARB-AB)/(AU-ARB-AB)*标准液浓度(g/L)
六、参考值 成人 60－80(g/L) 七、注意事项 略
附：溴甲酚绿法测定血清白蛋白
一、目的
二、原理 血清白蛋白在PH4.2的缓冲液中带正电荷， 在有非离子型表面活性剂存在时，可与带负电荷的 染料溴甲酚绿结合形成蓝绿色的复合物，在波长 630NM处有吸收峰，其颜色深浅与蛋白的浓度成正 比。

实验双缩脲法测定蛋白质含量共41页PPT

实验双缩脲法测定蛋白质含量共41页PPT
实验双缩脲法测定蛋白质含量
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。——苏联
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
41、学问异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国

双缩脲法测定蛋白质PPT教学课件

双缩脲法测定蛋白质PPT教学课件
➢ 严禁在实验室内吃饭、吸烟、扔废物和随地吐痰，实验室内学生轮流安排值日，实 验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
试剂使用规则
➢ 使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。 ➢ 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原瓶。 ➢ 取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干试管中，再用干净吸管吸取标准液，以免
污染瓶中的标准液体。 ➢ 使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。 ➢ 使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿
用嘴吸取，以免造成意外。
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吸量管的使用
➢ 正确拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端。 ➢ 取液：用吸耳球吸取液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上
端。 ➢ 调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体
下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。 ➢ 放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸
量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。吸量管应最后靠壁15秒。
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不同浓度的VitB12溶液对相同波长的光的不同吸收
λ＝ 550nm
A
µg/ml
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物质定性分析常用方法
➢ 原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物质溶液的定性检测 ➢ 比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化学结构不同。 ➢ 比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同；化学结构相似的物质最大吸收波长

双缩脲法测定蛋白质的浓度ppt课件

双缩脲法测定蛋白质的浓度ppt课件
取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml置试管中，加入双缩脲试剂 2.0ml，混匀，测其540nm的吸光度，对照标准曲线求得未知液蛋 白质浓度。
6
0123456
2mg/ml 牛血清白蛋白液（ml） 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8
蒸馏水（ml）
3 2.7 2.4 2.1 1.8 1.6 1.2
双缩脲试剂（ml）
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
OD540
0
将上述溶液混合后，试管中即有紫红色出现，在540nm下测 的各管的吸光度，以蛋白质浓度为横坐标，OD值为纵坐标作出标 准曲线。 2、 样液的测定
2、双缩脲试剂：将1.75gCuSO4.5H2O溶于约150ml蒸馏水， 然后置于1000ml容量瓶中，加入300ml浓氨水、300ml冰 冷的蒸馏水和200ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置 2小时，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
5
四、实验步骤 1、标准曲线的绘制：取7支干燥的试管，按下表加入试剂：
实验五 双缩脲法测定蛋白质的浓度
一、实验原理
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。 蛋白质在碱性溶液中可与CU2+形成紫色化合物，在一定 浓度的范围内，蛋白质浓度与生成的紫色化合物颜色的 深浅成正比，可用比色法测定。
1
双缩脲反应
尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双 缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色 的化合物，此反应称为双缩脲反应。
2
蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行 此反应。双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。
3
二、实验仪器
1、 试管 2、 吸管 3、 72
1 、 2mg/ml 牛 血 清 白 蛋 白 液 ： 将 1g 牛 血 清 白 蛋 白 溶 于 0.9%NaCl溶液并稀释至1000ml.

经典蛋白含量测定方法比较及双缩脲法实验步骤简介优秀PPT

经典蛋白含量测定方法比较及双缩脲法实验步骤简介优秀PPT
Folin－酚 试剂法 (Lowry法)
灵敏度 时间 原 理 干扰物质
说明
灵敏度低, 适用于0.2 ~ 1.0mg氮,误 差为 2％
费时 8～10 小时
将蛋白氮转化为 氨，用酸吸收后 滴定
非蛋白氮(可 用TCA沉淀 蛋白质而分 离)
用于标准蛋白质 含量的准确测定; 干扰少;费时太长
灵敏度低 1～20mg
（二〕资料 标准蛋白溶液(10mg/ml BSA)、 未知液(人血清 ×10)
（三〕试剂 双缩脲试剂 溶解0.175 g硫酸铜
〔CuSO4·5H2O〕溶于15ml蒸馏水，置于100ml
四、实验操作步骤
（一） 标准曲线的制作
试管
0
1
2
3
4
5
剂号
标准蛋白溶液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
➢ 在一定的实验条件下, 被广泛地应用。
硫酸铵;Tris缓冲液；
未知样品的溶液与标
准蛋白质溶液同时反应, 并于540－560nm下 Triton X-100;SDS
双缩脲试剂 溶解0. 在一定的实验条件下, 未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应, 并于540－560nm下比色, 可通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品
实验四、双缩脲法测定蛋白质的浓度
N端
C端
相关知识
目前常用的有五种经典方法： 定氮法：灵敏度0.2~1.0mg 双缩脲法〔Biuret法）：1~20mg Folin－酚试剂法(Lowry法)：
50~100μg 紫外吸收法：5μg
方法
凯氏定氮法 (Kjedahl法)
双缩脲法 (Biuret法) 紫外吸收法
考马斯亮蓝法〔Bradford法）：1~5μg

双缩脲法测定蛋白质的浓度优选PPT文档

双缩脲法测定蛋白质的浓度优选PPT文档
（一） 绘制标准曲线
吸量管（1毫升，2毫升，5毫升）、试管及试管架、721或7220型分光光度计。
H2O
待测液中选择吸光值在标准曲线范围内的作为计算基础。
蛋白质含有两个以上的肽键（与双缩脲中肽键相似）， 吸5H量2O管）（溶1于毫1升5m，l2蒸毫馏升水，，5毫置升于）10、0m试l容管量及瓶试中管，架加、入72310或ml7冰22冷0型的分蒸光馏光水度和计20。ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置1~2h，再加蒸馏水
因此有双缩脲反应。 对刻度，摇匀备用。
在540毫微米波长下7220型分光光度计比色、读数，记录各管A值。
比色分析法 待测液中选择吸光值在标准曲线范围内的作为计算基础。
考马斯亮蓝法（Bradford法）：1~5μg
HN
NH
（二）未知样品溶蛋白液质浓的度的颜测定色和光的选择吸取、光的吸收定律：T%与A或E
HN NH 吸量管（1毫升，2毫升，5毫升）、试管及试管架、721或7220型分光光度计。
R-CH
CH-R
H2O
紫色络合物
溶液的颜色和光的选择吸取、光的吸收定律：T%与A或E
学会使用721或7220型分光光度计并了解仪器的基本结构。
双缩脲试剂 待测液中选择吸光值在标准曲线范围内的作为计算基础。
（二）未知样品蛋白质浓度的测定
双缩脲法测定蛋白质的浓度
N端
C端
相关知识
目前常用的有四种经典方法： 定氮法：灵敏度~mg 双缩尿法（Biuret法）：1~2mg Folin－酚试剂法（Lowry法）： 50~100μg 紫外吸收法：5μg 考马斯亮蓝法（Bradford法）：1~5μg
H2O
考马斯亮蓝法（Bradford法）：1~5μg
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玻璃器皿的一般清洗方法
➢ 一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷后，用洗衣粉刷洗， 再用自来水反复冲洗，最后用蒸馏水淋洗2～3次。干燥备用。
➢ 容量分析仪器：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，待晾干后，再用 铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水淋洗2～3次，干燥 备用。
➢ 要爱护公物，小心使用仪器和实验设备，注意节约用水、电、药品和器材。 ➢ 所有固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾桶中。强酸、强碱必
须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。
➢ 实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。实验完毕，仪器洗 净放好。
➢ 在实验过程中必须遵守操作规程，不得随意乱动乱用。如不会使用，应请教指导教 师。凡因乱动乱用违反操作规程而损坏仪器设备，造成事故者，按有关规定进行赔 偿和处理。
A＝KCL 或 lgI0/I =KCL A为溶液对光的吸光度，反映了物质对光的吸收程度； C为溶液浓度； L为溶液厚度； I0为照射待测物质的单色光强度，I为透过待测物质光线的光强度，透光度 T= I/I0即溶液透过光的强度与入射光的强度之比； K为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度的条件下对入射光的吸光度。 实验中溶液厚度不变，则A＝KC
➢ 吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶 液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的吸量管，则不必吹出管尖的残留 液体。(0.5ml以下的都要吹）
➢ 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中，以免污染吸量管 及试剂。
➢ 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验完毕后，用自来水 冲洗干净，晾干备用。
不同浓度的VitB12溶液对相同波长的光的不同吸收
λ＝ 550nm
A
µg/ml
物质定性分析常用方法
➢ 原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物质溶液的定性检测 ➢ 比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化学结构不同。 ➢ 比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同；化学结构相似的物质最大吸收波长
➢ 比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗。洗不净时，用盐酸或适当溶剂冲洗，再用 自来水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗糙布(纸)擦拭。
➢ 上述所有玻璃器材洗净(以倒置后器壁不挂水珠为干净的标准)后，根据需要晾干 或烘干。
分光光度法
一般性实验-1
➢ 光是一种电磁波，通常用频率和波长来描述光。 ➢ 人的视觉所能感觉到的光称为可见光，波长范围在400～760nm，人的眼睛感觉不到的
端。 ➢ 调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体
下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。 ➢ 放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸
量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。吸量管应最后靠壁15秒。
吸量管的使用注意事项
还有红外光（波长大于760-5000000nm）、紫外光（波长200-400nm）、X射线等。 ➢ 在可见光区，不同波长的光呈不同的颜色，但各种有色光之间并没有严格的界线，而
是由一种颜色逐渐过渡到另一种颜色。
溶液的颜色与吸收光颜色的关系
Beer-Lambert定律－吸收光谱法基本定律
➢ 描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。 ➢ 含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓度和液层厚度成正比。
光吸收示意图
I0
I
C
b
吸收光谱和物质的定性分析
➢ 物质的吸收光谱与物质分子结构有关。 ➢ 吸收光谱曲线是物质的特征曲线。用各种不同波长的光线作为入射光测定物质的吸光度
（Absorbance），然后以波长（λ）为横轴，相应的吸光度（A）为纵轴，按结果作图， 可得到该物质的吸收光谱曲线，这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力。 ➢ 在一定的温度、pH值等条件下吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收光谱中，往往可 找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长（λmax）。物质不同，它 们的最大吸收波长也往往不同。
实验记录
实验记录是在进行科学研究过程中积累资料、经验的一项重要工作，每一次实验过程 中都应当养成良好的习惯，及时做好记录和总结。 要求： ⑴ 真实性 ⑵ 原始性 ⑶ 完整性 ⑷ 条理性
实验报告的书写
实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。完整的实验报告应包 括：实验题目、实验目的 、实验日期、操作步骤与条件、实验结果、讨论和结 论等项目。
相同，吸收系数不同。 ➢ 比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（DNA A260/A280=1.8 纯度鉴定)
物质的定量分析
污染瓶中的标准液体。 ➢ 使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。 ➢ 使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿
用嘴吸取，以免造成意外。
吸量管的使用
➢ 正确拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端。 ➢ 取液：用吸耳球吸取液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上
➢ 严禁在实验室内吃饭、吸烟、扔废物和随地吐痰，实验室内学生轮流安排值日，实 验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。
试剂使用规则
➢ 使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。 ➢ 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原瓶。 ➢ 取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干试管中，再用干净吸管吸取标准液，以免
实验室规则
➢ 上实验课时不迟到，不早退，自觉遵守课堂纪律，上课时应保持实验室安静，不得大 声说笑。进入实验室必须穿实验工作服。
➢ 实验课前认真预习有关课程，明确实验目的、要求和注意事项，熟悉实验内容和方法 步骤。
➢ 实验时应遵守实验操作规程，按教师要求，认真操作。要细心观察实验现象，认真记 录实验数据，作出结论，最后写出实验报告。